Name: En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Aprenda la técnica de transfección de siRNA en la médula espinal lumbar de ratones mediante inyección intratecal rápida y no invasiva. Este método permite silenciar genes específicos para investigaciones en neurociencia.

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Todos los procedimientos de uso de animales estaban en conformidad con las normas éticas establecidas por la Junta de Gobierno Local (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Alemania). 1. Preparación del Complejo siRNA / PEI La solución de complejo de ARNsi / PEI se prepara utilizando las instrucciones del fabricante de la siguiente manera: <ol><li> Solución A: Diluir la cantidad deseada de siRNA con agua estéril (si es necesario) hasta una cuarta parte del volumen final y diluir dicha adicionalmente con una solución de glucosa al 10% hasta la mitad del volumen final. Vortex o mezclar suavemente la pipeta hacia arriba y hacia abajo. La cantidad óptima de siRNA se debe determinar empíricamente pero 1 mg siRNA en 10 l solución compleja por animal es un buen punto de partida para la optimización. </li><li> Solución B: Diluir el volumen necesario de reactivo PEI con agua estéril hasta una cuarta parte del volumen final y diluir dicha adicionalmente con una solución de glucosa al 10% hasta la mitad del volumen final. Vortex gently o mezclar pipeteando arriba y abajo. Nota: la cantidad de reactivo de PEI determina el equilibrio iónico en el complejo que influye en la eficiencia de la transfección. Del mismo modo la cantidad óptima de solución de PEI tiene que ser determinada empíricamente. En nuestras manos, la cantidad óptima es de 0,12 l de solución de PEI por 1 g de siRNA. </li><li> Mezclar la solución A con la solución B a la vez, vórtice suavemente. </li><li> Incubar la solución se mezcló durante 15 min a temperatura ambiente antes de su uso. Este complejo es estable durante 2 horas a temperatura ambiente y durante 24 horas a 4 ° C. </li></ol> 2. La inyección intratecal <ol><li> Anestesiar el ratón con el 3% isoflurano, hasta que no muestra signos de reflejo de enderezamiento. Además, compruebe si hay cola y / o la pata pizca reflex para asegurar aún más el estado de anestesia. </li><li> Shave alrededor de 2 cm 2 de piel en el extremo posterior del animal cerca de la base de la cola para facilitar una mejor visualización durante la inserción de la aguja. </li><li> Coloque el ratón enun cono de la nariz para una administración continua isoflurano durante el procedimiento, a reducir el isoflurano al 1,5%, y cubrir los ojos del ratón con lubricante ocular. </li><li> Prepare la lista para su uso siRNA solución mixta utilizando una jeringa Hamilton de 25 l adjunto a un 30 G 0,5 en la aguja. </li><li> Busque la apófisis espinosa de la L6, que debería ser el más destacado y fijar la columna de la vertebrado alrededor de esta área presionando suavemente. </li><li> Inserte cuidadosamente la aguja entre la ranura de L5 y L6 vértebras y observar por un movimiento de la cola ya que este signo indica una entrada exitosa de la aguja en el espacio intradural. Consejo: El uso de la uña, uno debe ser capaz de localizar la ranura también. </li><li> Una vez que se observa movimiento de la cola, de inmediato, pero con cuidado, asegurar la posición de la aguja con una mano e inyectar el volumen deseado de la sustancia con la otra mano lentamente. Consejo: un volumen de entre 5-10 l es óptima ya que el volumen de menos de 5 y# 181; l es poco fiable y un volumen más grande que 10 l conduce a demasiada presión. </li><li> Una vez que se realiza la inyección, mover el ratón de nuevo a la jaula para recuperarse de la anestesia. </li><li> Repita este inyección de al menos 2 veces más cada 24 horas para lograr una óptima regulación a la baja del gen diana. </li></ol>

<ol><li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+tactile+allodynia+following+intrathecal+puncture+in+mouse%3A+contributions+of+Toll-like+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling.</a> Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).</li>
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<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+modulation+of+wide+dynamic+range+neurons+in+the+lumbar+dorsal+horn+of+the+rat+by+spinally+administered+WIN55%2C212-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2.</a> Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).</li>
<li>Song, Z. H., Takemori, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+spinal+kappa+opioid+receptors+in+the+antinociception+produced+by+intrathecally+administered+corticotropin-releasing+factor+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).</li>
<li>Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+cannabinoid+%28CB1%29-receptors+in+the+development+and+maintenance+of+opioid+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance.</a> Neuroscience. , 1275-1288 (2007).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).</li>
<li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. , 677-681 (2006).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Cav3.2+T-type+calcium+channel+gene+in+sensory+neurons+demonstrates+its+major+role+in+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception.</a> EMBO J. 24, 315-324 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+dorsal+root+ganglia+by+intrathecal+injection%3A+effects+on+regeneration+of+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves.</a> Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).</li>
<li>Wigdor, S., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+and+systemic+morphine-induced+antinociception+in+mice%3A+contribution+of+descending+serotonergic+and+noradrenergic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Por lo tanto, la técnica de inyecciones intratecales de aguja anteriormente descrito es eficaz, rápido, específicamente localizada-, y no destructiva. Técnicamente, el aspecto más crítico de este procedimiento es el punto de inserción de la aguja en el surco. Es crucial que este procedimiento se realiza con las manos muy tranquilas y paciencia. Como muchos procedimientos quirúrgicos, la formación mejora la tasa de éxito de la inyección. Esto también es importante porque durante un experimento real, esta técnica no propo...

La médula espinal es un centro muy importante en una variedad de procesos biológicos fundamentales y funciones fisiológicas, incluyendo el procesamiento y la transmisión de entradas dolorosas (nociceptivo) 4-7. Diversas técnicas experimentales se han desarrollado para facilitar la modulación farmacológica de la médula espinal, tales como la implantación crónica de catéteres intratecales 8, la microinyección de la médula espinal, intratecal y la aguja de inyección 9. Cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas, y dependiendo del paradigma experimento Una técnica podría ser más adecuado que los otros. Considerando que la implantación crónica de los catéteres intratecales es fácilmente factible en la rata, este método es muy difícil en el ratón, dadas las restricciones de tamaño. El índice de éxito es muy baja y el déficit motor a menudo se producen debido a la presencia voluminosa de un catéter en el espacio subdural severamente limitado en el ratón. Además, la administración a largo plazo de medicamentos se hace debido a la coagulación frecuentesde implantado crónicamente catéteres. Finalmente, las reacciones inmunes son comunes. Estos problemas pueden ser evitados utilizando el método de la inyección intratecal aguda a través de una aguja en la ausencia de un catéter preimplanted, que permite una aplicación rápida y anatómicamente limitado de medicamentos y reactivos a la médula espinal en ratones. Este método mantiene plenamente los beneficios de la entrega intratecal sobre otras rutas de administración sistémica (por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, etc) tales como especificidad de la modulación espinal, que permite la reducción de las dosis y los efectos secundarios límite, así como la capacidad para entregar sustancias no hacen normalmente no atraviesan la barrera hematoencefálica ya que durante la inyección intratecal, se inserta la aguja entre la duramadre y la médula espinal. Es importante destacar sin embargo, en comparación con otros métodos de entrega intratecal, el método de inyección de aguja intratecal es el menos invasivo, lo que permite numerosas aplicaciones en lamismo animal sin causar ningún daño tisular considerable o evocando reacción inmune debido a la implantación de material extraño. Sin embargo, requiere habilidades técnicas para una orientación muy precisa de la aguja para permitir la eficacia. Este sentido, demostrar visualmente el método para alcanzar una tasa óptima de éxito para la orientación específica de la médula espinal lumbar. El sitio de la inyección que se elige en este experimento es el surco entre L5 y L6 columna de vertebrados, cerca de donde termina la médula espinal, para reducir al mínimo la posibilidad de dañar la columna vertebral. Por otra parte, se demuestra el uso de esta técnica para derribar los genes en la médula espinal utilizando siRNAs.

<table><tbody><tr><td>En vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>201-10G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 siRNA</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-36832</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Control siRNA-A</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-37007</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-&szlig;-Tubulina III anticuerpo</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-WAVE1</td><td>R& D Sistemas</td><td>AF5514</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tinte verde rápido</td><td>Sigma</td><td>F-7252</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Configuración de isoflurano</td><td>Dr&auml; ger L&uuml; Beck</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Afeitadora</td><td>Wella</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton Gastight 1702</td><td>Hamilton</td><td></td> <td>&nbsp;</td></tr><tr><td>30 G 1/2 en aguja de 13 mm</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio Leica MS5</td><td>Leica</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>WAVE1 imprimación directa para qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cacagagcctcaggacagg</td></tr><tr><td>WAVE1 imprimación inversa para qRT-PCR</td><td>Sigma</td><td></td><td>cttttcaccaacggcatctt</td></tr><tr><td>FastStart Essential DNA Green Master</td><td>Roche</td><td>6402712001</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

en vivo transfección sirna y gene derribo en la médula espinal a través de rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

En este informe se describe una guía paso a paso a la técnica de inyecciones intratecales agujas agudas de una manera no invasiva, es decir, independiente de la implantación del catéter. La limitación técnica de esta técnica quirúrgica se encuentra en la finura de las manos. La inyección es rápida, sobre todo para un investigador entrenado, y dado que la interrupción del tejido con esta técnica es mínima, las inyecciones repetidas son posibles; reacción además inmune a las herramientas de extranjeros (por ej. Catéter) no ocurre, dando así una mejor y más específica leer en voz de la modulación de la médula espinal. Dado que la aplicación de la sustancia se limita en gran parte a la región diana de la médula espinal, los fármacos no necesitan ser aplicado en grandes dosis, y efectos más importante no deseados en otro tejido, como se observa con un suministro sistémico, pueden ser eludidas 1, 2. Además, combinamos esta técnica con la transfección in vivo de ácido nucleico con la ayuda de polyethylenimINE (PEI) de reactivo 3, que proporciona una gran versatilidad para el estudio de funciones de la médula a través de la administración de agentes farmacológicos, así como de genes, ARN, y moduladores de proteínas.

Con el fin de ilustrar una inyección de éxito, se realizó esta técnica usando Fast tinte verde FCF en ratones adultos C57Bl6 (8-10 semanas de edad). El animal se le permitió recuperarse durante unos minutos después de la inyección para dar tiempo suficiente para que el tinte se extendió y luego mató con una sobredosis de CO 2. Posteriormente, la columna de la vertebrado fue disecada y la médula espinal se expuso. El puntos lagrimales azul correspondiente al colorante difusa, marcó el sitio de la inyección. No...

Este informe describe una técnica sencilla y rápida de la aguja de punción intratecal para una transfección localizada de siRNA en la médula espinal lumbar de ratón bajo anestesia de corta luz duradera.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

El objetivo general de este procedimiento es aplicar localmente ARNi mediante administración intratecal en la médula espinal. Esto se logra primero preparando el reactivo complejo óptimo de I-R-N-A-P-E-I. El segundo paso consiste en preparar el ratón para la inyección intratecal.Después de un tiempo de incubación de al menos 15 minutos, la solución mezclada de ARN de interferencia se aspira en una jeringa Hamilton. El paso final consiste en realizar cuidadosamente la inyección intratecal, repitiendo las inyecciones una vez cada 24 horas para asegurar una regulación descendente óptima. Finalmente, inmunotransferencia y PCR cuantitativa en tiempo real.La PCR se utiliza para demostrar la reducción exitosa en los niveles de proteína y de ARNm tras la transfección con INA. La principal ventaja de esta técnica es que es menos invasiva que una inyección intracatéter o una inyección en la médula espinal. Por lo general, las personas nuevas en este método deben entrenarse para adquirir la destreza necesaria para inyectar a través de un pequeño surco entre la columna vertebral sin dañar la médula espinal.Para preparar la solución de SIR, comience por diluir la cantidad deseada de SIR A con a

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Un protocolo de mínima invasión para estabilizar la columna espinal de ratón y realizar...

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

Fuente: Tadokoro, T., et al. Administración del vector del virus adenoasociado subpial 9 (AAV9) en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra una técnica de inyección subpial para la administración de genes a la médula espinal en ratones. El procedimiento consiste en exponer la duramadre, perforar la piamadre e inyectar un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que lleva un gen que expresa proteínas fluorescentes en el espacio subpial. Después de la inyección y la recuperación,...

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Fuente: Li, D., et al. Inyección intratecal directa de virus adenoasociados recombinantes en ratones adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este video muestra el procedimiento para la inyección intratecal de virus adenoasociados (AAV) en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ratón despierto, que cubre la preparación de la jeringa, la alineación de la columna vertebral y la inserción precisa de la aguja. Este método valida la administración de genes dirigidos, lo que respalda su potencial para las...

Administración intratecal de virus en un modelo de ratón para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central

Los vectores virales permiten la manipulación dirigida de genes. Se demuestra un método para la expresión génica condicional o ablación en la médula espinal de ratón, usando inyección estereotáxica de un vector viral en el asta dorsal, un sitio prominente de contacto sináptico entre las vías aferentes somatosensoriales y las neuronas del sistema nervioso central.

Inyección estereotáxica de un vector viral para la manipulación genética condicional en la médula espinal de ratón

Aquí, presentamos una técnica in vivo para la transferencia de genes a células de Schwann (SC) en el nervio ciático de roedores. Esta sencilla técnica es útil para investigar los mecanismos de señalización implicados en el desarrollo y mantenimiento de las SC mielinizantes.

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

Inyección intraspinal del recombinase dependiente recombinante virus adeno-asociado (rAAV) puede utilizarse para manipular cualquier tipo de célula genéticamente marcadas en la médula espinal. Aquí describimos cómo transduce las neuronas en el asta dorsal de la médula espinal lumbar. Esta técnica permite interrogatorio funcional del subtipo neurona manipulada.

Expresión de transgenes de mediada por Virus adeno-asociado en neuronas genéticamente definidas de la médula espinal

Aquí presentamos una técnica de inyección directa intratecal con clorhidrato de lidocaína 1% en una solución viral para asegurar la entrega eficiente de virus adeno-asociado a pequeños animales y establecer un sistema de puntuación para predecir la eficiencia de la transducción de señales en la central sistema nervioso según el grado de debilidad transitoria inducida por la lidocaína.

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Aquí, describimos un método para suministrar medicamentos al sistema nervioso central de la rata mediante la implantación de un catéter en el espacio intratecal lumbar de la columna vertebral. Nos centramos en la entrega de oligonucleótidos antisentido, aunque este método es adecuado para la entrega de otras modalidades terapéuticas también.

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Una inyección intratecal lumbar representa una vía de administración traslacionalmente relevante para administrar terapia génica al sistema nervioso central. Este protocolo estandarizado integral para inyecciones intratecales lumbares en ratones y ratas neonatales, juveniles y adultos tiene como objetivo guiar a los investigadores en la adopción de esta técnica para estudios preclínicos de terapia génica.

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Este artículo detalla métodos de administración intratecal para terapias dirigidas al SNC en ratones adultos, centrándose en la precisión del protocolo y en la posibilitación de inyecciones repetidas. Incluye hallazgos de un estudio de validación en el que los oligonucleótidos antisentido redujeron la expresión mutante de SOD1 en ratones modelo SOD1-ALS, lo que respalda la utilidad del enfoque en la investigación preclínica sobre enfermedades neurodegenerativas.

Inyección intratecal lumbar de SOD1-ASO para la dirección precisa del SNC y la eficacia predictiva en ratones humanos SOD1-G93A ALS

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