Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

El objetivo general del siguiente experimento es observar la expresión génica transitoria de un reportero marcado con GFP en células epidérmicas de hoja de tabaco. Esto se logra diseñando primero una construcción de ADN que se expresará en el cloroplasto y los peroxisomas. A continuación, la construcción se construye utilizando la amplificación por PCR y el ensamblaje de Gibson.

A continuación, se utiliza una pistola de genes para entregar el constructo a las células epidérmicas de la hoja de tabaco. En última instancia, las imágenes de la hoja de tabaco mediante microscopía confocal revelan la expresión de GFP en el cloroplasto y el peroxisoma. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la clonación clásica, es que no requiere enzimas de restricción, por lo que se puede clonar cualquier secuencia que pueda ser amplificada por PCR.

Debido a la flexibilidad del diseño genético, las aplicaciones de estas técnicas se extienden hacia una escala mayor. Ingeniería genética de plantas agrícolas Comience este protocolo determinando los sitios dentro de la célula vegetal para la expresión final de la proteína. Para este trabajo, el objetivo es dirigir la expresión al cloroplasto, el peroxisoma y el citosol.

A continuación, diseñe la construcción de la expresión. La construcción debe contener un promotor, un gen detectable y un terminador dentro de un solo plásmido. En este caso, el promotor constitutivo P end cup two impulsa la expresión de GFP, a la que sigue el Nolene Synthe, terminator o nos t.

Tenga en cuenta que en este experimento, probaremos una serie de etiquetas, etiquetas trit, uno, dos y tres terminales terminales expresados a GFP para la expresión en cloroplastos y peroxisomas. El método de ensamblaje de Gibson depende de la acción de varias enzimas en una mezcla prefabricada para digerir parcialmente los extremos del ADN bicatenario y facilitar el recocido de pares de bases complementarios de secuencias de ADN vecinas. La construcción final tiene tres partes que deben amplificarse en cuatro reacciones de PCR antes del ensamblaje de Gibson.

La primera y la segunda reacción amplifican un vector plásmido de 8.000 pares de bases, PORE, que contiene GFP NOS T y un marcador de resistencia cany. El marcador de resistencia es un buen lugar para dividir este ADN grande en dos plantillas más pequeñas que se amplifican más fácilmente por PCR. La tercera reacción amplifica el promotor P end cup two, y la cuarta reacción amplifica triag one utilizando software de diseño in silico como ape design, la construcción base por base, de modo que hay una superposición de 50 pares de bases entre cada pieza.

Al pedir cebadores para PCR, es posible utilizar la superposición de 50 pares de bases como cebadores 25 pares de bases en cada dirección Después de realizar la PCR para amplificar cada componente, purifique el producto de PCR por separado y dilúyalos en agua destilada desionizada. Si la plantilla de PCR era una mini preparación del tratamiento con E. coli con la enzima de restricción DPN, se eliminará el ADN de la plantilla contaminante. A continuación, mide las concentraciones de cada una de las piezas de ADN.

Ajuste la concentración del vector a aproximadamente 150 nanogramos por microlitro para cada construcción que se ensamble, incluido un control, saque una alícuota de 15 microlitros de la mezcla de Gibson Assembly del congelador y descongélela en hielo. Utilizando el tool@gibbon de código abierto en línea. org, determine los volúmenes para cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos.

Añade el volumen calculado de cada uno de los fragmentos a la mezcla Gibson de 15 microlitros. También prepare un control del vector de ADN solo. El volumen total de cada reacción debe ser de 20 microlitros.

Use agua para ajustar el volumen si es necesario. Incube los tubos a 50 a 55 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Después de la incubación, vuelva a colocar los tubos en hielo.

Retire un tubo de micro fuga que contiene una preparación comercial de 200 microlitros de e-coli competente en cloruro de calcio de un congelador a menos 80 grados Celsius, y caliéntelo ligeramente con la mano. A continuación, añada los 20 microlitros de la reacción a la E. coli. Incubar los cultivos en hielo durante 30 minutos, luego transferirlos a un baño de agua a 42 grados centígrados y choque térmico durante 60 segundos.

No utilice celdas electrocompetentes. La concentración relativamente alta de sal y la baja concentración de ADN pueden hacer que las células se arqueen después de la transformación. Regrese los cultivos a ICE durante dos minutos, luego aplique 750 microlitros de medio SOC o LB y deje que se recuperen durante 30 minutos a 37 grados centígrados.

En la siguiente placa, la mezcla en placas LB con cany u otro antibiótico apropiado se incuba a 37 grados centígrados durante la noche y examina 10 colonias por secuenciación. Tenga en cuenta que este método puede dar lugar a un mayor fondo y a un mayor número de eventos de recombinación no objetivo que la clonación tradicional basada en la ligadura. La transfección biótica del tabaco con una pistola genética ha sido descrita previamente en JoVE.

Aquí, se revisan los pasos clave y las diferencias con respecto a los protocolos anteriores. Después de amplificar y aislar las construcciones, prepare balas de pistola genética como se describe en el artículo de JoVE de Woods y Zeto y cárguelas en la pistola de genes para la transfección del tejido epidérmico de la hoja de tabaco Nico Tania Benham Miana. Elija una hoja grande cerca de la base de una planta de tres a cinco meses.

Colóquelo con cuidado con la parte inferior hacia arriba sobre toallas de papel húmedas en una placa de Petri de 15 centímetros con protección adecuada para los ojos y los oídos. Ajuste la presión de helio para la pistola genética a 200 a 250 PS. Apunto cuidadosamente la pistola genética entre las costillas en la parte inferior de una hoja, a unos tres o cinco centímetros por encima de ella. Libere el seguro y entregue las partículas a la hoja.

Use cada bala dos veces en el mismo lugar de la hoja. Muévase a otro lugar y repita el proceso si la hoja explota, deséchela y comience una nueva hoja. Existe cierta variación en la dureza de las hojas debido a las condiciones de crecimiento como la edad, la humedad, etc.

Después de que se hayan administrado todas las inyecciones, cubra la hoja y guárdela de dos a tres días con poca luz en el banco. Examine la hoja en un microscopio de disección equipado con fluorescencia UV y busque células individuales que expresen GFP. Cuando se encuentren células que expresen GFP, use tijeras de disección para extraer cuidadosamente secciones de hoja de cinco a 10 milímetros.

Sumerja inmediatamente cada fragmento de hoja individual en el pocillo de un portaobjetos de microscopio de pozo profundo que contenga aproximadamente 200 microlitros de 0,1%Triton X 100. El detergente ayuda a evitar que se formen burbujas de aire en la superficie y el portaobjetos de microscopio de pozo profundo permite obtener imágenes de células de área de tejido más grandes utilizando un microscopio confocal equipado con los filtros adecuados y un objetivo de inmersión en agua de 40x. En este estudio, se compararon los tres diferentes constructos de orientación de orgánulos GFP con GFP sin etiquetar y un rubis. Coag.

Se utilizó la microscopía confocal de GFP para detectar la fluorescencia de GFP en las células individuales transformadas transitoriamente en experimentos de control en los que se expresó GFP sin marcar. La fluorescencia se observa solo en el núcleo y el citosol, pero no en el cloroplasto, que se identifican por la autofluorescencia roja de la clorofila, como se ve en este ejemplo de una célula transfectada con un cloroplasto solo Rubis Oag. La GFP se expresó en los orgánulos grandes.

La celda está delineada en blanco. El amarillo indica áreas de colocalización del constructo con clorofila, lo que indica que el constructo está dirigido al cloroplasto, como se muestra en esta imagen de una célula triag, se observa la expresión de GFP en el cloroplasto, las periferias, el citosol y pequeños orgánulos punteados que se cree que son peroxisomas. Del mismo modo, las células triag dos transfectadas también expresan GFP en el citosol del cloroplasto y los peroxisomas triag tres, que consiste en una señal de peroxisoma incrustada dentro de una región de baja complejidad de la secuencia del cloroplasto, localizada solo en el cloroplasto y el peroxisoma.

Tenga en cuenta que esta celda se encuentra en una capa de hoja diferente. Esta figura resume la expresión observada en los compartimentos de una célula epidérmica típica de la hoja de tabaco. Se muestran los tamaños y ubicaciones relativos dentro de la célula y se observan los niveles de expresión relativos mediante transfección de pistola génica y microscopía confocal.

Tenga en cuenta que la GFP desetiquetada se localiza en el citosol y el núcleo, el control PIMT dos GFP se localiza en el cloroplasto y triag una GFP, triag dos GFP y Triag 3G FP localizada en el cloroplasto y el peroxisoma como se predijo, Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un plasma con ensamblaje de Gibson, Entréguelo en forma de bola a las hojas de tabaco y observe la expresión de GFP dentro de los tres días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar 150 nanogramos por microlitro de ADN vectorial para el ensamblaje de Gibson, y 1500 nanogramos por microlitro de su construcción final de ADN para hacer sus balas de pistola genética. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transfección de agrobacterias para obtener una expresión génica estable en lugar de transitoria.