Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

El objetivo general del siguiente experimento es observar la expresión transitoria de un gen reportero marcado con GFP en células epidérmicas de hoja de tabaco. Esto se logra primero diseñando un constructo de ADN que se expresará en los cloroplastos y peroxisomas. Luego, el constructo se construye mediante amplificación por PCR y ensamblaje Gibson.

A continuación, se utiliza una pistola génica para introducir el constructo en células epidérmicas de hoja de tabaco. Finalmente, el análisis de la hoja de tabaco mediante microscopía confocal revela la expresión de GFP en el cloroplasto y en el peroxisoma. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la clonación clásica, es que no requiere enzimas de restricción y, por lo tanto, cualquier secuencia que pueda amplificarse mediante PCR puede clonarse.

Debido a la flexibilidad del diseño genético, las aplicaciones de estas técnicas se extienden hacia una escala más amplia. La ingeniería genética de plantas agrícolas comienza este protocolo determinando los sitios dentro de la célula vegetal para la expresión final de la proteína. Para este trabajo, el objetivo es dirigir la expresión hacia el cloroplasto, el peroxisoma y el citosol.

A continuación, diseñe el constructo de expresión. El constructo debe contener un promotor, un gen detectable y un terminador dentro de un solo plásmido. En este caso, el promotor constitutivo P end cup two impulsa la expresión de GFP, seguido por el terminador Nolene Synthe o nos t.

Tenga en cuenta que en este experimento probaremos una serie de etiquetas, las etiquetas trit, uno, dos y tres, expresadas en el extremo terminal de GFP para su expresión en cloroplastos y peroxisomas. El método de ensamblaje Gibson depende de la acción de varias enzimas en una mezcla preformulada que digiere parcialmente los extremos del ADN de doble cadena y facilita el apareamiento de pares de bases complementarios de secuencias de ADN adyacentes. El constructo final tiene tres partes que deben amplificarse en cuatro reacciones de PCR antes del ensamblaje Gibson.

Las primeras dos reacciones amplifican un vector plasmídico de 8.000 pares de bases, PORE, que contiene GFP NOS T y un marcador de resistencia a canamicina. El marcador de resistencia es un buen sitio para dividir este ADN grande en dos plantillas más pequeñas que se amplifican más fácilmente por PCR. La tercera reacción amplifica el promotor P end cup dos, y la cuarta reacción amplifica triag uno utilizando software de diseño in silico como ape design, ensamblando el constructo base por base, de modo que exista una superposición de 50 pares de bases entre cada fragmento.

Al pedir cebadores para PCR, es posible utilizar el solapamiento de 50 pares de bases como cebadores, con 25 pares de bases en cada dirección. Después de realizar la PCR para amplificar cada componente, purifique por separado el producto de la PCR y dilúyalo en agua destilada desionizada. Si la plantilla de PCR fue una mini prep de E. coli tratada con la enzima de restricción DpnI, se eliminará el ADN de la plantilla contaminante. A continuación, mida las concentraciones de cada uno de los fragmentos de ADN.

Ajuste la concentración del vector a aproximadamente 150 nanogramos por microlitro para cada construcción que se vaya a ensamblar, incluyendo un control; tome una alícuota de 15 microlitros de la mezcla de ensamblaje Gibson del congelador y deshiélela en hielo. Mediante la herramienta de código abierto en línea @gibbon.org, determine los volúmenes necesarios para obtener cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos.

Añada el volumen calculado de cada uno de los fragmentos a la mezcla de Gibson de 15 microlitros. También prepare un control con el ADN del vector solo. El volumen total de cada reacción debe ser de 20 microlitros.

Utilice agua para ajustar el volumen si es necesario. Incube los tubos a 50-55 grados Celsius durante 30-60 minutos. Después de la incubación, coloque los tubos nuevamente en hielo.

Retire un tubo microfuga que contiene una preparación comercial de 200 microlitros de *E. coli* competente en cloruro de calcio de un congelador a menos 80 grados Celsius y caliéntelo ligeramente con la mano. A continuación, añada los 20 microlitros completos de la reacción a la *E. coli*. Incube las culturas en hielo durante 30 minutos, luego transfiéralas a un baño de agua a 42 grados Celsius y aplique un choque térmico durante 60 segundos.

No utilice células electrocompetentes. La concentración relativamente alta de sal y la baja concentración de ADN pueden hacer que las células produzcan arcos después de la transformación. Devuelva los cultivos al hielo durante dos minutos, luego agregue 750 microlitros de medio SOC o LB y permita que se recuperen durante 30 minutos a 37 grados Celsius.

A continuación, plaquear la mezcla en placas de LB con canamicina u otro antibiótico apropiado e incubar a 37 grados Celsius durante la noche. Analice 10 colonias mediante secuenciación. Tenga en cuenta que este método puede generar un fondo más alto y un mayor número de eventos de recombinación no deseados en comparación con la clonación tradicional basada en ligación. La transformación biolística del tabaco mediante una pistola de genes ha sido descrita previamente en JoVE.

Aquí se revisan los pasos clave y las diferencias con respecto a protocolos anteriores. Después de amplificar y aislar los constructos, prepare balas para la pistola génica como se describe en el artículo de JoVE por woods y zeto y colóquelas en la pistola génica para la transfección del tejido epidérmico de la hoja de tabaco Nico Tania Benham Miana. Elija una hoja grande cercana a la base de una planta de tres a cinco meses de edad.

Colóquelo cuidadosamente con la cara inferior hacia arriba sobre toallas de papel húmedas en una placa de Petri de 15 centímetros, utilizando protección adecuada para los ojos y los oídos. Ajuste la presión de helio del cañón génico a entre 200 y 250 PSI. Apunte cuidadosamente el cañón génico entre las nervaduras en la cara inferior de una hoja, aproximadamente a tres o cinco centímetros por encima de ella. Libere el seguro y administre las partículas a la hoja.

Utilice cada proyectil dos veces en el mismo lugar de la hoja. Pase a otra ubicación y repita el proceso si la hoja explota, descártela y comience con una hoja nueva. Existe cierta variabilidad en la resistencia de las hojas debido a condiciones de crecimiento como la edad, la humedad, etc.

Después de administrar todos los disparos, cubra la hoja y almacénela de dos a tres días con poca luz sobre la bancada. Examine la hoja en un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia UV y busque células individuales que expresen GFP. Cuando se encuentren células que expresen GFP, use tijeras de disección para extraer cuidadosamente secciones de hoja de cinco a diez milímetros.

Sumerja inmediatamente cada fragmento foliar individual en el pocillo de una placa microscópica de pocillos profundos que contenga aproximadamente 200 microlitros de Triton X-100 al 0,1 %. El detergente ayuda a prevenir la formación de burbujas de aire sobre la superficie, y la placa microscópica de pocillos profundos permite un área mayor de tejido para la obtención de imágenes celulares mediante un microscopio confocal equipado con los filtros adecuados y un objetivo de inmersión en agua de 40x. En este estudio, se compararon los tres constructos diferentes de marcado de orgánulos con GFP frente al GFP sin marca y un rubis.Coag.

Se utilizó microscopía confocal GFP para detectar la fluorescencia GFP en células individuales transformadas transitoriamente en experimentos de control en los que se expresó GFP sin etiqueta. Se observa fluorescencia únicamente en el núcleo y el citosol, pero no en el cloroplasto, los cuales se identifican mediante la autofluorescencia roja de la clorofila, como se ve en este ejemplo de una célula transfectada con un constructo GFP solo de Rubis Oag del cloroplasto. El constructo GFP se expresó en los orgánulos grandes.

La célula está delimitada en blanco. El color amarillo indica áreas de colocalización del constructo con la clorofila, lo que demuestra que el constructo se dirige al cloroplasto, tal como se muestra en esta imagen de una célula transfectada con triag uno, en la que se observa expresión de GFP en el cloroplasto, en las periferias, en el citosol y en pequeñas organelas puntuales que se cree son peroxisomas. De manera similar, las células transfectadas con triag dos también expresan GFP en el cloroplasto, en el citosol y en los peroxisomas. Triag tres, que consiste en una señal de peroxisoma insertada dentro de una región de baja complejidad de la secuencia del cloroplasto, se localiza únicamente en el cloroplasto y en el peroxisoma.

Téngase en cuenta que esta célula se encuentra en una capa foliar diferente. Esta figura resume la expresión observada en los compartimentos de una célula epidérmica típica de hoja de tabaco. Se muestran los tamaños y ubicaciones relativos dentro de la célula, así como los niveles relativos de expresión observados mediante transfección con pistola de genes y microscopía confocal.

Tenga en cuenta que la GFP sin etiqueta se localiza en el citosol y el núcleo, el control PIMT dos GFP se localiza en el cloroplasto, y triag uno GFP, triag dos GFP y Triag 3G FP se localizaron en el cloroplasto y el peroxisoma tal como se predijo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un plásmido mediante ensamblaje Gibson, introducirlo balísticamente en hojas de tabaco y observar la expresión de GFP dentro de tres días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar 150 nanogramos por microlitro de ADN vectorial para el ensamblaje Gibson y 1500 nanogramos por microlitro de su construcción final de ADN para fabricar las balas para el cañón genético. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la transfección con agrobacterium, para obtener una expresión génica estable en lugar de transitoria.