Name: Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprende a realizar expresión génica transitoria en células epidérmicas de tabaco mediante ensamblaje Gibson y biobalística. Este método simplifica la clonación sin enzimas de restricción y permite visualizar GFP en cloroplastos y peroxisomas por microscopía confocal.

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Los autores desean agradecer a Jen Sheen, del Hospital General de Massachusetts por la generosa donación de plantones Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ayudó mucho en el asesoramiento en el cultivo de plantas y la creación de un área de la cámara de crecimiento. Tom Ferrante del Instituto Wyss ofreció ayuda decisiva con microscopía confocal. Los autores desean agradecer especialmente a Don Ingber del Hospital de Niños de Boston y el Instituto Wyss por la generosa donación de una pistola de genes y materiales asociados. Los fondos para este proyecto fueron proporcionados a través de un acuerdo de cooperación con el Departamento de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Energía (ARPA-E Award # DE-000079) para PAS, JCW, y Médicos del Mundo, y por medio de Chimerion Biotechnology, Inc. para MJV.

1. Diseño de secuencias Alternativamente empalmados-en caso de pluralidad Orgánulos Focalización <ol><li> Determinar los sitios para la expresión de la proteína final. Para este trabajo, el interés se centra en la orientación del cloroplasto, peroxisomas y citoplasma. </li><li> Usar la literatura para identificar las secuencias de proteínas y de ADN conocidos que atacan las proteínas de los orgánulos de interés. En este caso, una orientación del cloroplasto secuencia de Arabidopsis thaliana-L isoaspartate metiltransferasa 6,15, y una secuencia dirigida a los peroxisomas de Arabidopsis thaliana-transtiretina como S-alantoína sintasa 16,17 fueron determinado. </li><li> Identificar un régimen alternativo de empalme que deben orientar las proteínas de interés a los orgánulos correctas. Para este trabajo, los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis naturales 6. La secuencia de ARNm fue rediseñado dejando los sitios de empalme naturales, pero las secuencias de codificación se colocaron peroxis cloroplastos oome de metas de etiquetas dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1). </li></ol> 2. Asamblea Gibson de piezas de ADN Ver también la Figura 2. El método de montaje Gibson depende de la acción de varias enzimas en una mezcla pre-hechos a 1) digerir parcialmente los extremos de la doble hebra de ADN para hacer de hebras sencillas y 2) de recocido pares de bases complementarias de la vecina partes de ADN. Esto permite la clonación de fragmentos de ADN sin las limitaciones de los sitios de restricción. <ol><li> Elige un órden para los elementos de la construcción del plásmido de ADN. Como un ejemplo TriTag-1 tiene elementos de: a) un vector plásmido (poros, que contiene una construcción de GFP se sabe que funciona en plantas, un marcador de resistencia a kanamicina, y orígenes de replicación para E. coli y Agrobacterium tumefaciens anfitriones), b) una secuencia de promotor, (P ENTCUP2, demostrado ser constitutiva en plantas), C) una secuencia de direccionamiento de cloroplastos (CTS), c) una secuencia de dirección de peroxisomas (PTS), y d) una serie de sitios de empalme como se ha descrito previamente 6. </li><li> Diseñar la base para la construcción de la base con en el software de diseño de silico. ApE es un paquete de software gratuito de código abierto útil para este trabajo. Nota: TriTag-1, tiene la orden: vector de plásmido, promotor, ATG, sitio de empalme de donantes, secuencia diana del cloroplasto, el sitio donador de empalme, lugar neutral, el sitio aceptor de empalme, secuencia diana de peroxisomas, sitio aceptor de empalme, las buenas prácticas agrarias, que figura en el plásmido vector . <ol><li> Diseñar el silico construcción de ADN de tal que hay un solapamiento de 50 pb entre cada pieza en el pedido cebadores para la PCR. Es posible usar la superposición de 50 pb como los cebadores: 25 pb cada dirección. <ol><li> Asegúrese de no perder de vista el origen de cada uno de los pedazos de secuencia. Es como: un plásmido ser cultivadas y miniprepped; una secuencia lineal que se puede utilizar como una plantilla de PCR; o una secuencia que tiene que sersintetizado comercialmente? Varias compañías ofrecen servicios de síntesis de ADN de bajo costo para los fragmentos de &lt;500 pb. En este caso, la propia TriTag es 437 pb por lo que era conveniente pedirlo en el mercado. </li><li> Los mejores resultados vendrán si todos los fragmentos son amplificado por PCR y purificados a partir de su plantilla de ADN. El marcador de resistencia es un buen lugar para dividir esta gran ADN en dos plantillas más pequeñas que son más fácilmente amplificado por PCR. </li><li> Enzima de restricción Restricción DpnI corta el ADN metilado. Si la plantilla de PCR era un miniprep a partir de E. coli, el tratamiento DpnI se retire la plantilla de ADN contaminante. </li></ol></li></ol></li><li> Purificar todas las secuencias de ADN por separado y se produzca la elución en agua, o TE Buffer EB. <ol><li> Pore ​​vector parte 1, ~ 3000 pb (flechas verdes). Amplificó por PCR y DpnI tratada. </li><li> Pore ​​vector parte 2, ~ 3000 pb (flechas negras). Amplificó por PCR y DpnI tratada. </li><li> TriTag inserción, 437 pb (flechas azules). Pedido comercialmente. Resuspend en ddH 2 O. </li><li> P promotor ENTCUP, ~ 750 pb (flechas de color naranja). Amplificado por PCR y DpnI tratada. </li></ol></li><li> Medir las concentraciones de cada una de las piezas de ADN. Apunta a 150 ng / l de las piezas de vectores. </li><li> Tomar una alícuota de la mezcla de ensamblaje Gibson del congelador y descongelar en hielo. Este está disponible comercialmente, pero también fácil de hacer en el laboratorio 12-14. <ol><li> Hay dos pasos para esta receta: una mezcla maestra 5x viscosa y 15 alícuotas 1.33x reacción de tamaño mL. La mezcla maestra 5x contiene: 3 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 300 l 1 M de MgCl 2, 600 l 10 mM de cada dNTP, 300 l de DTT 1 M, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, y ddH 2 O a 6 ml. Preparar 320 ml de alícuotas (18) y la congelación de todos menos uno a -20 ° C. La solución será bastante viscoso. Etiquetar estos &quot;tampón 5X isoterma&quot; </li><li> Para el resto (320 l), añadir 1,2 l T5 Exonucleasa, 20 l Phusion alta FidElity ADN polimerasa, 160 l de Taq ADN ligasa y 700 l ddH 2 O. Preparar 15 ml de alícuotas (~ 80) en el hielo en tubos de PCR y se almacena a -20 ° C. </li></ol></li><li> Determinar los volúmenes de cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos. Hay algunas calculadoras en línea, incluyendo Gibthon.org. Debe haber un total de 5 l de todas las piezas de ADN. Añadir a la l 15 Gibson mezclar alícuota. Si esto requiere volúmenes demasiado pequeño para pipeta, diluir los fragmentos de ADN y / o utilizar más de una parte alícuota. <ol><li> No te olvides de preparar un control del ADN vector solo (por ejemplo, la parte de ADN que contiene el marcador de resistencia a los antibióticos) y completar el volumen con agua. </li></ol></li><li> Incubar los tubos en un termociclador a 50-55 ° C durante 30-60 minutos. Vuelva a colocar en hielo y se transforman en E. coli mediante choque térmico células químicamente competentes. No utilice células electrocompetentes. La alta concentración de sal y la concentración de ADN relativamente bajapueden hacer que las células ARC. <ol><li> Aplicar todos los 20 l de una preparación comercial de 200 l de cloruro de calcio competente de E. coli. Incubar en hielo 30 min y el calor de choque 60 segundos a 42 ° C </li><li> Volver a hielo 2 min, aplicar 750 l de SOC o medio LB y recuperar agitación en un tubo de microcentrífuga de 30 min a 37 ° C. Placa de la mezcla y las diluciones adecuadas en LB + Kan (u otro antibiótico adecuado). Esto puede resultar en un mayor fondo (y un mayor número de eventos de recombinación no objetivo) que la clonación basada en la ligadura tradicional, pero vale la pena analizar cerca de 10 colonias. </li></ol></li><li> Confirmar clon a través de la secuencia y almacenar una parte alícuota a -80 ° C </li></ol> 3. Biolístico transfección de Tabaco de la pistola de Gene Esta es una técnica que se establece en JoVe 18,19. Los pasos clave y las diferencias se describen a continuación. <ol><li> Crecer 50-100 ml E. coLi o 200 ml de Agrobacterium. Maxi-prep de la cultura. Una concentración de aproximadamente 1500 ng / l se requiere para continuar. </li><li> Preparar balas de pistola de genes tal como se describe anteriormente. Cargarlos en la pistola de genes. </li><li> Para la transfección de Nicotiana benthamiana tabaco tejido foliar epidérmica, elija una hoja grande cerca de la base de una planta de 3 meses de edad. Corte con cuidado y colocarlo parte inferior hacia arriba en toallas de papel húmedas en un plato de 15 cm de Petri. </li><li> Ajustar la presión de Él para la pistola de genes de 200 a 250 psi. </li><li> Apuntar con cuidado la pistola de genes entre las costillas en la parte inferior de una hoja, unos 3-5 cm por encima de ella. Suelte la seguridad y entregar las partículas a la hoja. Cada bala puede ser utilizado dos veces en el mismo lugar en la hoja. Si estalla la hoja, descartan y empezar una nueva vida-hay una cierta variación en la hoja de la dureza debido a las condiciones de crecimiento, tales como la edad, la humedad, etc Para una hoja de 12 cm, le espera para encajar alrededor de 6 disparos. </li><li> Guarde la hoja, cubierta con la parte superior de unPlaca de Petri durante 2-3 días con poca luz en el banquillo. </li><li> Examine la hoja en un microscopio de disección equipado con fluorescencia UV, y la búsqueda de las células individuales que expresan GFP. Diseccionar 5-10 mm secciones de la hoja. </li><li> Sumerja la hoja en un portaobjetos de microscopio de pozo profundo en ~ 200 l 0,1% de Triton X-100. El detergente ayuda a prevenir la formación de burbujas de aire en la superficie, y la profunda portaobjetos de microscopio y permite una zona de formación de imágenes de tejido más grande. </li></ol> 4. Microscopía Confocal del tejido Transfectadas Estas instrucciones varían para cada instrumento, por lo que es esencial para conseguir una formación adecuada. <ol><li> Para los experimentos de detección por fluorescencia, ajuste el láser de excitación a 489 nm, y establecer los detectores fotomultiplicadores de 500-569 nm para GFP fluorescencia y 630-700 nm para la clorofila autofluorescencia. Celdas de imagen utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x. </li></ol>

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<li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle%3A+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li>
<li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides%2C+metabolic+pathways%2C+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+Fluorescence+Complementation+%28BiFC%29+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, se describen estrategias simples para la localización de una única proteína transgénica a múltiples compartimentos celulares en plantas. El objetivo era diseñar constructo que expresara un solo gen en más de un orgánulo en Nicotiana benthamiana. Las estrategias incluyen el diseño racional de construcciones de ADN basada en GFP, el montaje de Gibson, la entrega de los plásmidos de células de las hojas con la pistola de genes, y la observación de los resultados con microscopía confocal. <p cl...

Este trabajo es un proyecto de ingeniería / biología sintética metabólica en la que las células vegetales están diseñados para expresar una proteína reportera en varios orgánulos, pero con una única construcción de ADN. Un enfoque para dirigir proteínas a más de un lugar de clonación implica múltiples copias genéticas, cada uno que contiene un péptido de localización diferente. Cada copia debe ser introducida por los sucesivos retransformación, o alternativamente, por retrocruzamiento transformaciones individuales 1. Esto implica la clonación por adición, y está limitado por una etiqueta de localización por terminal. Otra forma de localizar una proteína para múltiples ubicaciones es a través de splicing alternativo 2-5. ARN se transcribe a partir de un único gen, pero diferentes copias de la transcripción se procesa de manera diferente, a menudo en más de una forma por célula. Esto puede resultar en más de un ARN mensajero en la célula transcrito a partir de un único gen. Estos diferentes messengeARN R puede codificar para diferentes isoformas de la misma proteína, o en el caso de un desplazamiento del marco, una proteína totalmente diferente. Aunque splicing alternativo ha sido descrita en la literatura para muchos años, los mecanismos de acción y de donantes conservadas y sitios de empalme del receptor sólo están siendo elucidados más recientemente 6. A medida que se describen mejor estos sitios, se abren oportunidades para la ingeniería. Ingenieros metabólicos Plant se enfrentan a un desafío cuando la expresión de una proteína en múltiples orgánulos. Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen varias veces, cada una con una secuencia señal separada dirigir a los orgánulos de interés. Para un solo gen en tres orgánulos, esto es simplemente tres genes. Sin embargo, para una vía metabólica de seis genes, esto se expande a 18 genes, un importante esfuerzo de clonación. Combinación de varias secuencias de localización en un único signo de genes empalmados alternativamente-reduce ificantly este esfuerzo. Por ejemplo, la reingeniería de la fotorrespiración 7,8 y la síntesis de isoprenoides 9,10 involucra tanto a los cloroplastos y peroxisomas. En nuestro caso nos aprovechamos de los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis thaliana naturales descrito previamente 6. Nos racionalmente rediseñado la secuencia de ARNm de salir de los sitios de empalme naturales solo, pero colocamos secuencias que codifican cloroplasto-o etiquetas al peroxisoma dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1). La proteína expresada puede o no puede tener una etiqueta, dependiendo de si la pre-ARNm que lo codifica se escindió como un intrón (Figuras 1g y 1h). Para obtener más información sobre el diseño de las construcciones que se presentan en este trabajo, por favor vea el artículo del compañero 11. Debido a que este es todavía un esfuerzo significativo clonación, montaje Gibson, un nuevo método para la clonación de las construcciones de ADN, es used en la construcción. El método de Gibson puede ser utilizado para cualquier secuencia, con independencia de los sitios de restricción (Figura 2) 12-14. La mezcla específica de enzimas permite un solo paso, el montaje isotérmica. En este método, varias partes de ADN lineal de doble cadena están diseñados de tal manera que tienen secuencias solapantes de ~ 50 pb. El conjunto de mezcla de enzimas Gibson digiere parcialmente las partes lineales de ADN, la exposición de cadenas simples de secuencias homólogas. Estas secuencias de una sola hebra parciales se vuelven a recocidas en la mezcla de reacción, lo que resulta en una, de un solo paso, independiente de la secuencia, la reacción subclonación-ligadura libre rápida. Este trabajo describe 1) Diseño de construcciones racionales empalmados alternativamente para la expresión en los cloroplastos de las plantas, los peroxisomas, y citosoles, 2) su clonación utilizando el nuevo método de ligadura libre de reunión Gibson, 3) de su entrega a las células de las hojas de tabaco con la pistola de genes, y 4) resultados que muestran la orientación de orgánulos, como se observa con las buenas prácticas agrariasy microscopía confocal.

<table><tbody><tr><td>Cebadores de oligonucleótidos</td><td>IDT</td><td>(personalizado)</td><td>Diseño específico para la construcción</td></tr><tr><td>de GeneBlocks</td><td>IDT</td><td>(personalizado)</td><td>500 bp oligonucleótidos</td></tr><tr><td>ApE software U</td><td>Utah</td><td>(descargar)</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td></tr> <tr><td>MinKit de elución</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Se utiliza para purificar productos de PCR</td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Se utiliza para preparar cantidades apropiadas para la clonación de plásmido</td></tr><tr><td>Phusion Master Mix con tampón GC</td><td>NEB</td><td>M0532S</td><td>Se utiliza para amplificar por PCR el gen de interés</td></tr><tr><td>Mezcla de reacción de ensamblaje de Gibson</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Mezcla maestra de los siguientes 9 ingredientes</td></tr>: <tr><td>1 M Tris-HCl pH7.5</td><td>Teknova</td><td>T1075</td><td>Mezcla de ensamblaje de Gibson</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>G Biosiences</td><td>82023-086 Mezcla de</td><td>montaje Gibson</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>mix Fermentas</td><td>R0192</td><td>Mezcla de montaje Gibson</td></tr><tr><td>1 M DTT</td><td>Fermentas</td><td>R0861</td><td>Mezcla de montaje Gibson</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Affymetrix</td><td>19966</td><td>Mezcla de montaje Gibson</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Applichem</td><td>A1124,0005</td><td>Mezcla de montaje Gibson</td></tr><tr><td>T5 exonucleasa</td><td>Epicentre</td><td>T5E4111K</td><td>Mezcla de ensamblaje Gibson</td></tr><tr><td>Phusion polimerasa</td><td>NEB</td><td>F530S Mezcla de</td><td>montaje de Gibson</td></tr><tr><td>Taq ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0208L</td><td>Mezcla de montaje de Gibson</td></tr><tr><td>Gibthon.org</td><td></td><td></td><td>Sitio web para simplificar los cálculos</td></tr><tr><td>Plásmido PLUS Maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td>Se utiliza para preparar el ADN para las balas de las pistolas genéticas</td></tr><tr><td>Sistema de pistola</td><td>genética BioRad</td><td>165-2451</td><td>Incluye todas las piezas necesarias</td></tr><tr><td>Nicotania benthamiana</td><td>(n/a)</td><td>(n/a)</td><td>Regalo de Jen Sheen,</td></tr><tr><td>MGH Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>SP5 X MP</td><td>Obtención de imágenes de las células resultantes</td></tr><tr><td>Portaobjetos de pozos profundos</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>71561-01</td><td>Utilizado para la obtención de imágenes confocales</td></tr><tr><td>Un editor de plásmidos (ApE) </td><td>Universidad de Utah </td><td></td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td></tr><tr><td>Gibthon:Calculadora</td><td></td><td></td> de ligadura <td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td></tr></tbody></table>

expresión génica transitoria en tabaco utilizando asamblea gibson y la pistola de genes

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Con el fin de dirigirse a una sola proteína a múltiples orgánulos subcelulares, las plantas normalmente duplican los genes pertinentes, y expresan cada gen por separado utilizando estrategias regulatorias complejas incluyendo promotores diferenciales y / o secuencias de señal. Ingenieros metabólicos y biólogos sintéticos interesadas en la orientación de las enzimas a un orgánulo particular, se enfrentan a un desafío: Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen múltiples veces. Este trabajo presenta una solución a esta estrategia: aprovechar splicing alternativo del mRNA. Esta tecnología se aprovecha de cloroplasto establecido y secuencias de peroxisomas focalización y los combina en un único ARNm que se empalmados alternativamente. Algunas variantes de empalme se envían al cloroplasto, algunos hasta el peroxisoma, y ​​algunos al citosol. Aquí, el sistema está diseñado para múltiples orgánulo que apunta con el corte y empalme alternativo. En este trabajo, se espera que las buenas prácticas agrarias para ser exprEssed en el cloroplasto, citosol, y peroxisomas por una serie de diseñados racionalmente 5 &#39;etiquetas de ARNm. Estas etiquetas tienen el potencial de reducir la cantidad de clonación requerido cuando los genes heterólogos necesitan ser expresado en múltiples orgánulos subcelulares. Las construcciones fueron diseñadas en el trabajo anterior 11, y se clonaron utilizando el montaje de Gibson, un método de clonación independiente de ligación que no requiere enzimas de restricción. Los plásmidos resultantes se introdujeron en las células epidérmicas de la hoja de Nicotiana benthamiana con un protocolo modificado pistola de genes. Finalmente, las hojas transformadas se observaron con microscopía confocal.

El esfuerzo de diseño fue el resultado de una planificación significativa. Novela de este proyecto es la utilización del splicing alternativo para crear un pre-ARNm que se traduce en proteínas expresadas diferencialmente. Estas proteínas se expresan en diferentes orgánulos, en este caso el cloroplasto, peroxisomas y / o citosol. Adaptamos gen Arabidopsis natural que se empalmados alternativamente 6, y se coloca conocidos cloroplasto 6 y peroxisomas 17 secuencias dirigidas en los...

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

El objetivo general del siguiente experimento es observar la expresión transitoria de un gen reportero marcado con GFP en células epidérmicas de hoja de tabaco. Esto se logra primero diseñando un constructo de ADN que se expresará en los cloroplastos y peroxisomas. Luego, el constructo se construye mediante amplificación por PCR y ensamblaje Gibson.A continuación, se utiliza una pistola génica para introducir el constructo en células epidérmicas de hoja de tabaco. Finalmente, el análisis de la hoja de tabaco mediante microscopía confocal revela la expresión de GFP en el cloroplasto y en el peroxisoma. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la clonación clásica, es que no requiere enzimas de restricción y, por lo tanto, cualquier secuencia que pueda amplificarse mediante PCR puede clonarse.Debido a la flexibilidad del diseño genético, las aplicaciones de estas técnicas se extienden hacia una escala más amplia. La ingeniería genética de plantas agrícolas comienza este protocolo determinando los sitios dentro de la célula vegetal para la expresión final de la proteína. Para este trabajo, el objetivo es dirigir la expresión hacia el cloroplasto, el peroxisoma y el citosol.A continuación, diseñe el constructo de expresión. El constructo debe contener un promotor, un gen detectable y un terminador dentro de un solo plásmido. En este caso, el promotor constitutivo P end cup two impulsa la expresión de GFP, seguido por el terminador Nolene Synthe o nos t.Tenga en cuenta que en este experimento probaremos una serie de etiquetas, las etiquetas trit, uno, dos y tres, expresadas en el extremo terminal de GFP para su expresión en cloroplastos y peroxisomas. El método de ensamblaje Gibson depende de la acción de varias enzimas en una mezcla preformulada que digiere parcialmente los extremos del ADN de doble cadena y facilita el apareamiento de pares de bases complementarios de secuencias de ADN adyacentes. El constructo final tiene tres partes que deben amplificarse en cuatro reacciones de PCR antes del ensamblaje Gibson.Las primeras dos reacciones amplifican un vector plasmídico de 8.000 pares de bases, PORE, que contiene GFP NOS T y un marcador de resistencia a canamicina. El marcador de resistencia es un buen sitio para dividir este ADN grande en dos plantillas más pequeñas que se amplifican más fácilmente por PCR. La tercera reacción amplifica el promotor P end cup dos, y la cuarta reacción amplifica triag uno utilizando software de diseño in silico como ape design, ensamblando el constructo base por base, de modo que exista una superposición de 50 pares de bases entre cada fragmento.Al pedir cebadores para PCR, es posible utilizar el solapamiento de 50 pares de bases como cebadores, con 25 pares de bases en cada dirección. Después de realizar la PCR para amplificar cada componente, purifique por separado el producto de la PCR y dilúyalo en agua destilada desionizada. Si la plantilla de PCR fue una mini prep de E. coli tratada con la enzima de restricción DpnI, se eliminará el ADN de la plantilla contaminante. A continuación, mida las concentraciones de cada uno de los fragmentos de ADN.Ajuste la concentración del vector a aproximadamente 150 nanogramos por microlitro para cada construcción que se vaya a ensamblar, incluyendo un control; tome una alícuota de 15 microlitros de la mezcla de ensamblaje Gibson del congelador y deshiélela en hielo. Mediante la herramienta de código abierto en línea @gibbon.org, determine los volúmenes necesarios para obtener cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos.Añada el volumen calculado de cada uno de los fragmentos a la mezcla de Gibson de 15 microlitros. También prepare un control con el ADN del vector solo. El volumen total de cada reacción debe ser de 20 microlitros.Utilice agua para ajustar el volumen si es necesario. Incube los tubos a 50-55 grados Celsius durante 30-60 minutos. Después de la incubación, coloque los tubos nuevamente en hielo.Retire un tubo microfuga que contiene una preparación comercial de 200 microlitros de *E. coli* competente en cloruro de calcio de un congelador a menos 80 grados Celsius y caliéntelo ligeramente con la mano. A continuación, añada los 20 microlitros completos de la reacción a la *E. coli*. Incube las culturas en hielo durante 30 minutos, luego transfiéralas a un baño de agua a 42 grados Celsius y aplique un choque térmico durante 60 segundos.No utilice células electrocompetentes. La concentración relativamente alta de sal y la baja concentración de ADN pueden hacer que las células produzcan arcos después de la transformación. Devuelva los cultivos al hielo durante dos minutos, luego agregue 750 microlitros de medio SOC o LB y permita que se recuperen durante 30 minutos a 37 grados Celsius.A continuación, plaquear la mezcla en placas de LB con canamicina u otro antibiótico apropiado e incubar a 37 grados Celsius durante la noche. Analice 10 colonias mediante secuenciación. Tenga en cuenta que este método puede generar un fondo más alto y un mayor número de eventos de recombinación no deseados en comparación con la clonación tradicional basada en ligación. La transformación biolística del tabaco mediante una pistola de genes ha sido descrita previamente en JoVE.Aquí se revisan los pasos clave y las diferencias con respecto a protocolos anteriores. Después de amplificar y aislar los constructos, prepare balas para la pistola génica como se describe en el artículo de JoVE por woods y zeto y colóquelas en la pistola génica para la transfección del tejido epidérmico de la hoja de tabaco Nico Tania Benham Miana. Elija una hoja grande cercana a la base de una planta de tres a cinco meses de edad.Colóquelo cuidadosamente con la cara inferior hacia arriba sobre toallas de papel húmedas en una placa de Petri de 15 centímetros, utilizando protección adecuada para los ojos y los oídos. Ajuste la presión de helio del cañón génico a entre 200 y 250 PSI. Apunte cuidadosamente el cañón génico entre las nervaduras en la cara inferior de una hoja, aproximadamente a tres o cinco centímetros por encima de ella. Libere el seguro y administre las partículas a la hoja.Utilice cada proyectil dos veces en el mismo lugar de la hoja. Pase a otra ubicación y repita el proceso si la hoja explota, descártela y comience con una hoja nueva. Existe cierta variabilidad en la resistencia de las hojas debido a condiciones de crecimiento como la edad, la humedad, etc.Después de administrar todos los disparos, cubra la hoja y almacénela de dos a tres días con poca luz sobre la bancada. Examine la hoja en un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia UV y busque células individuales que expresen GFP. Cuando se encuentren células que expresen GFP, use tijeras de disección para extraer cuidadosamente secciones de hoja de cinco a diez milímetros.Sumerja inmediatamente cada fragmento foliar individual en el pocillo de una placa microscópica de pocillos profundos que contenga aproximadamente 200 microlitros de Triton X-100 al 0,1 %. El detergente ayuda a prevenir la formación de burbujas de aire sobre la superficie, y la placa microscópica de pocillos profundos permite un área mayor de tejido para la obtención de imágenes celulares mediante un microscopio confocal equipado con los filtros adecuados y un objetivo de inmersión en agua de 40x. En este estudio, se compararon los tres constructos diferentes de marcado de orgánulos con GFP frente al GFP sin marca y un rubis.Coag.Se utilizó microscopía confocal GFP para detectar la fluorescencia GFP en células individuales transformadas transitoriamente en experimentos de control en los que se expresó GFP sin etiqueta. Se observa fluorescencia únicamente en el núcleo y el citosol, pero no en el cloroplasto, los cuales se identifican mediante la autofluorescencia roja de la clorofila, como se ve en este ejemplo de una célula transfectada con un constructo GFP solo de Rubis Oag del cloroplasto. El constructo GFP se expresó en los orgánulos grandes.La célula está delimitada en blanco. El color amarillo indica áreas de colocalización del constructo con la clorofila, lo que demuestra que el constructo se dirige al cloroplasto, tal como se muestra en esta imagen de una célula transfectada con triag uno, en la que se observa expresión de GFP en el cloroplasto, en las periferias, en el citosol y en pequeñas organelas puntuales que se cree son peroxisomas. De manera similar, las células transfectadas con triag dos también expresan GFP en el cloroplasto, en el citosol y en los peroxisomas. Triag tres, que consiste en una señal de peroxisoma insertada dentro de una región de baja complejidad de la secuencia del cloroplasto, se localiza únicamente en el cloroplasto y en el peroxisoma.Téngase en cuenta que esta célula se encuentra en una capa foliar diferente. Esta figura resume la expresión observada en los compartimentos de una célula epidérmica típica de hoja de tabaco. Se muestran los tamaños y ubicaciones relativos dentro de la célula, así como los niveles relativos de expresión observados mediante transfección con pistola de genes y microscopía confocal.Tenga en cuenta que la GFP sin etiqueta se localiza en el citosol y el núcleo, el control PIMT dos GFP se localiza en el cloroplasto, y triag uno GFP, triag dos GFP y Triag 3G FP se localizaron en el cloroplasto y el peroxisoma tal como se predijo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un plásmido mediante ensamblaje Gibson, introducirlo balísticamente en hojas de tabaco y observar la expresión de GFP dentro de tres días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar 150 nanogramos por microlitro de ADN vectorial para el ensamblaje Gibson y 1500 nanogramos por microlitro de su construcción final de ADN para fabricar las balas para el cañón genético. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la transfección con agrobacterium, para obtener una expresión génica estable en lugar de transitoria.

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