Name: Imaging A través de la envoltura pupal de Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T15:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Aprende a realizar imagen a través de la envoltura pupal de Drosophila melanogaster sin dañar su integridad estructural. Este método de microscopía confocal de barrido rápido permite visualizar procesos celulares dinámicos como mitosis y fagocitosis in situ durante períodos prolongados.

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Los autores desean agradecer Akira Chiba para la ayuda intelectual, material de apoyo, y las existencias. Gracias a Julia Dallman para comentarios.

1. Vuela Trabajo <ol><li> Mantener moscas en medio de la harina de maíz-agar-melaza-levadura estándar a temperatura ambiente 10. </li><li> Para cruces, vírgenes aislar dentro de las 6 horas de la eclosión. Después de cruzar a los hombres del genotipo deseado, el cambio vuela a nuevos viales cada 3-4 días. </li></ol> Nota: Para estos experimentos, la línea de Gal4 A9 se utilizó para conducir la expresión de los transgenes en el ala. Fly existencias se pueden obtener en el centro stock en Bloomington. Acciones utilizadas en estos experimentos incluyen A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), Sco / CyO HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), lollibow 11. 2. Selección y montaje de pupas <ol><li> Etapa pupas ya sea por su recogida como prepupas blanco (WPP) y mantenerlos a 25 ° C hasta que alcanzan la edad adecuada o utilizando criterios morfológicos 12. </li><li> Observar las divisiones celulares, seleccione pupa que han sido objeto recientemente de eversión cabeza.Desde este momento hasta antes de la eclosión (a&gt; 96 h), pupas están permitiendo inmóvil observación prolongado lapso de tiempo. </li><li> Retire las pupas de los viales por ellos tocando primero con un pincel humedecido con agua, a la espera de un minuto para permitir que el agua para aflojar el adhesivo y luego suavemente aguijoneándolos en el pincel. </li><li> Lave suavemente pupas seleccionada por pinchar con un pincel en agua para eliminar el adhesivo de la glándula y las partículas de alimentos salivales. </li><li> Traslado pupas limpia para un plato de Petri de 25 mm con un fondo cubreobjetos (número 1 ½ cubreobjetos). </li><li> El uso de tiras delgadas de cualquiera de modelado de la arcilla o cera dental como un soporte, montar pupas de modo que el tejido de interés es más cercano a la cubreobjetos. Nota: En los estudios aquí descritos, se han observado alas pupal, piernas, abdominales o histoblasts notum dorsal. En la práctica, cualquier tejido dentro de 20 micras de la superficie de la envoltura pupal es observable. </li><li> Pupas Orient con cuidado para que el tissuE de interés es paralelo a la superficie cubreobjetos de vidrio. </li><li> Una vez que se montan pupas, utilizar un pincel para transferir una capa delgada de tiodietilenglicol (TDG) al espacio entre la pupa y el cubreobjetos. </li></ol> Nota: TDG reduce la dispersión de superficie, coincide con el índice de refracción del aceite, y permite que el oxígeno penetre el tejido 13. No se recomienda el uso de aceites, ya que tienden a privar a los tejidos de oxígeno, causando un rápido cese de los comportamientos celulares. 3. Imaging Nota: Para formación de imágenes, un microscopio confocal es probable que sea esencial como la confocalidad elimina la mayor parte del fondo oscurecimiento causado por la intensa iluminación del caso de pupa. <ol><li> Ajuste la configuración de la confocal para minimizar el impacto de la iluminación en el desarrollo de pupa y viabilidad. Para ello, lograr un equilibrio entre la intensidad de la excitación y la sensibilidad de la colección. Una configuración típica para wi imágenesª del Leica SP5 utiliza el escáner de resonancia (8000 Hz), la potencia del láser se establece en el 2% (10% de transmisión de la energía del 20%), conjunto pinhole a 120 m, y la línea Configuración de promedio a 8. Configuración variarán dependiendo de las condiciones experimentales. </li></ol> Nota: Para resolver escala fina dispone de 40X y 63X lentes de inmersión en aceite (distancia de trabajo 0,1 mm) también se han utilizado con éxito en este método, a pesar de que limitan la profundidad del foco. 4. Análisis Para el análisis de los marcos, z-pilas o películas importar los archivos de datos a Fiji, que dispone de herramientas eficaces para la visualización, medición y modificación de archivos de presentación 14. Por ejemplo el tiempo para completar la mitosis se midió utilizando el intervalo de muestreo y navegador de imágenes multidimensionales para desplazarse por los marcos mientras ve una célula a partir de la profase de telofase. x-, y-, y z-dimensiones pueden medirse utilizando la herramienta de medición. Para obtener instrucciones detalladas sobre el software y su usover: http://fiji.sc/Fiji.

<ol><li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+Fzy%2FCdc20+and+Fzr%2FCdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).</li>
<li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li>
<li>Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332, 354-358 (2011).</li>
<li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage%3A+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li>
<li>Ninov, N., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).</li>
<li>Edgar, B. A., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+control+of+cell+cycle+regulators%3A+a+fly%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective.</a> Science. 274, 1646-1652 (1996).</li>
<li>Wirtz, R. A., Semey, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+kitchen%3A+equipment%2C+media+preparation%2C+and+supplies%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Information+Service%22%5BJournal%5D)">The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies.</a> Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).</li>
<li>Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+multicolor-labeled+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila.</a> Development. 140, 1605-1613 (2013).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C2%27-thiodiethanol%3A+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interkinetic+nuclear+migration+is+a+broadly+conserved+feature+of+cell+division+in+pseudostratified+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia.</a> Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).</li>
<li>Sauer, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para visualizar, medir y cuantificar las características de las células en división, el desarrollo requiere de una preparación sencilla para la observación de la mitosis en el ala pupal viviente de Drosophila mediante análisis confocal de His2AvGFP células que expresan. Este método se utiliza para documentar que el ciclo celular en el ala de pupa tiene similitudes fuertes a la celda ciclos en el epitelio pseudoestratificado que los núcleos en movimiento a la superficie apical del epitelio, donde entran en la mi...

<html> La mosca del vinagre, Drosophila melanogaster, es un modelo bien establecido para el estudio de muchos aspectos de la biología. Investigación Drosophila tiene una rica historia de la experimentación genética que permite formas sofisticadas de manipulación genética, incluyendo la expresión, desmontables y mutación. Con el advenimiento de las etiquetas de proteínas fluorescentes, este repertorio se ha ampliado para incluir estudios de células y proteínas en animales vivos. El embrión de la mosca es un sistema excelente para este tipo de estudios ya que es pequeño y ópticamente claro lo que permite modelar profundo, de alta resolución in vivo 1-3. Otras etapas de desarrollo de la mosca han demostrado ser menos manejable, lo que requiere la anestesia 4, la disección y la cultura a corto plazo 5,6, o la creación de ventanas de la cutícula para obtener imágenes de 7,8. Estas manipulaciones normalmente comprometen el desarrollo animal en el largo plazo o afectan el animal de manera que limitan la formación de imágenes a períodos cortos. ENT &quot;&gt; Para estudiar las mutaciones en los genes nuevos que se asemejan a los reguladores del ciclo celular, que era esencial para encontrar una preparación apropiada para estudiar la sincronización y la fidelidad del ciclo celular. Dado que la mayoría de los ciclos celulares embrionarias se truncan (SM o S-G2-M) y los mutantes estudiados no muestran defectos hasta en etapas posteriores, era importante tener en cuenta el ciclo celular en los tejidos de la etapa de pupa. células epiteliales en la pupa tienen un ciclo celular de G1-S-G2-M más típica y pupas de esta etapa son no capaz de movimientos musculares 9. El punto de partida inicial para manipulaciones incluyen intacto pupas completas que expresan Histone2AV-GFP. pesar de la aparente opacidad de la cápsula de la pupa, esta preparación intacta demostró ser excelente para largo plazo en imágenes in vivo. Esta técnica es simple lo suficiente para que los investigadores universitarios habitualmente lo utilizan para estudiar los aspectos de la biología celular y del desarrollo en Drosophila y sin embargo la resolución es lo suficientemente fina como para permitir la discriminación de características de escala micrométrica. Con este método, son posibles observaciones de los eventos más horas, minutos o segundos simplemente ajustando los parámetros de series de tiempo. Videos utilizando, proteínas verdes, amarillos, naranjas, rojos y azules fluorescentes, o combinaciones de éstos, se han hecho. Es importante destacar que, si se toma cuidado para reducir al mínimo la intensidad del láser, incluso de formación de imágenes a largo plazo no tiene ningún efecto sobre el desarrollo o la viabilidad de los animales.

<table><tbody><tr><td>Fly stuff fly pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>para anestesia con moscas</td></tr><tr><td>CO2 gas</td><td>Airgas South</td><td>CD50</td><td>para anestesia con moscas</td></tr><tr><td>Regulador</td><td>Airgas South</td><td></td><td>CO2</td></tr><tr><td>regulador Viales para moscas</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-113RLBF</td><td>Cultivo</td></tr> <tr><td>de moscasDrosophila líneas:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Platos con fondo de vidrio # 1 1/2</td><td>WillCo Wells BV</td><td></td><td>Para microscopía</td></tr><tr><td>Tiodietilenglicol</td><td>Fluka</td><td>88559</td><td>montante</td></tr><tr>Tienda <td></td><td>de suministros de arte</td> de<td>arcilla para modelar</td><td>Apoyo para posicionar pupas contra</td></tr><tr><td>Tienda de suministros</td><td></td><td></td> de arte de pinceles <td>Para manipular moscas</td></tr><tr><td>Pinzas finas, Inox #5</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>ordenador</td><td>cualquiera</td><td></td><td>8 Gb de RAM para el análisis de imágenes/películas</td></tr><tr><td>Software</td><td></td> de Fiji Software <td>gratuito http://fiji.sc/Fiji</td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> confocal <td>Cualquier confocal de barrido rápido debe ser suficiente</td></tr><tr><td>20 veces en seco y 40 o 63 veces lentes de inmersión en aceite</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para obtener imágenes de las características</td></tr> <tr><td>tisulares, celulares y subcelularesAceite de inmersión (no fluorescente)</td><td></td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>cualquiera</td><td></td><td>Para la manipulación de moscas</td></tr></tbody></table>

imaging a través de la envoltura pupal de<em&gt; drosophila melanogaster</em

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

El uso de larga data de la Drosophila como modelo para la biología celular y del desarrollo ha dado una serie de herramientas. En conjunto, estas técnicas han permitido el análisis de la biología celular y del desarrollo de una variedad de ángulos metodológicos. Formación de imágenes en vivo es un método emergente para la observación de los procesos dinámicos de célula, tales como la división celular o la motilidad celular. Habiendo aislado mutaciones en las proteínas del ciclo celular putativo no caracterizados Se convirtió en fundamental tener en cuenta la mitosis in situ utilizando imágenes en vivo. La mayoría de los estudios de imagen en vivo en Drosophila se han centrado en las etapas embrionarias que son accesibles a la manipulación y observación debido a su pequeño tamaño y claridad óptica. Sin embargo, en estas etapas del ciclo celular es inusual ya que carece de una o ambas de las fases gap. Por el contrario, las células del ala pupal de Drosophila tienen un ciclo celular típico y se someten a un período de la mitosis rápida que comprende aproximadamente 20 h de desarrollo de pupa. Es fácil de identify y aislar las pupas de la etapa apropiada para coger la mitosis in situ. Montaje pupas intacta proporciona la mejor combinación de manejabilidad y durabilidad durante la exploración, lo que permite experimentos para una duración de varias horas con un impacto mínimo sobre la viabilidad celular y animal. El método permite la observación de características tan pequeño como, o menor que, mosca cromosomas. Ajuste de ajustes del microscopio y los detalles de montaje, permite la extensión de la preparación para visualizar dinámica de la membrana de las células adyacentes y las proteínas marcadas con fluorescencia, tales como la tubulina. Este método funciona para todas las proteínas fluorescentes a prueba y puede capturar características submicrónicas escala sobre una variedad de escalas de tiempo. Si bien limitado a la exterior 20 m de la pupa con un microscopio confocal convencional, este enfoque a la observación de la proteína y la dinámica celular en los tejidos pupal in vivo puede ser generalmente útiles en el estudio de la biología celular y del desarrollo en estos tejidos.

Las células en el epitelio pseudoestratificado, tales como el ojo de Drosophila en desarrollo, o la capa ventricular del sistema nervioso central de los vertebrados en desarrollo, se someten a los movimientos nucleares, denominado migración nuclear interkinetic, en el tiempo con el ciclo celular. La replicación del ADN se produce cuando los núcleos están en o cerca de la superficie basal y las células entran en la mitosis cuando los núcleos llegan a la superficie apical 15,16. Las células del ala pup...

En este trabajo se demuestra el uso de un microscopio confocal de barrido rápido de comportamiento de las células de imagen directamente a través de la pupa. Al dejar el caso de pupa intacta, este método permite la observación y medición de los procesos dinámicos de célula en una etapa de desarrollo de Drosophila que es difícil de estudiar directamente.

Imaging A través de la envoltura pupal de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

En este video, demostraremos técnicas novedosas que nos permiten obtener imágenes del estadio de pupa de Drosophila melanogaster sin comprometer la integridad estructural de la misma. Al mantener intacto el caso de la pupa, minimizamos el impacto del proceso de imagen en el desarrollo y viabilidad de la pupa. Utilizamos un microscopio confocal con escaneo resonante de 8.000 hertz para la adquisición de imágenes.Es importante destacar que la velocidad de escaneo muy rápida y la alta sensibilidad de este microscopio reducen considerablemente el desvanecimiento, lo que permite períodos prolongados de observación. Con este método, hemos podido visualizar una variedad de procesos biológicos celulares, incluyendo el comportamiento, fop, podia, morfogénesis, fagocitosis y mitosis. Con esta técnica, podemos observar eventos in situ durante períodos prolongados de tiempo sin dañar al organismo.Las observaciones obtenidas mediante estos métodos pueden utilizarse para comprender una variedad de fenómenos biológicos en esta etapa relativamente inaccesible del desarrollo de *Drosophila*, las personas Cheese, la etapa adecuada; se examinan mientras aún están en el frasco, buscando indicadores clave de la etapa de desarrollo para estudiar las divisiones celulares. Buscamos pupas que hayan girado la cabeza, pero que aún no muestren paquetes verdes ni meconio en el abdomen dorsal. Los individuos se sueltan tocando el capullo con un pincel húmedo para transferir agua y disolver el pegamento salival. Luego, las pupas se desprenden suavemente, se recogen con el pincel y se transfieren a una placa de Petri que contiene agua.Las personas se lavan cuidadosamente en el agua para limpiar cualquier resto de alimento o desechos. Luego las alineamos con el lado dorsal hacia arriba para asegurarnos de que estén en la etapa correcta. Manipúlelas con cuidado.Pueden morir fácilmente si se hace incluso un pequeño agujero en el tubo. Se colocan con cuidado individuos seleccionados en una placa de Petri con fondo de vidrio y se orienta de manera que la característica de interés esté lo más cerca posible del cubreobjetos y lo más paralela posible a la superficie. Para observar el ala de la pupa, se sostiene la pupa contra un soporte, como un trozo delgado de arcilla de modelar o cera dental, asegurándose de que no se mueva después de la orientación.Luego invitamos al plato para asegurarnos de que la característica de interés sea visible y esté bien orientada. Normalmente, se montan varias pipas a la vez para prevenir la posibilidad de que alguna no exprese la proteína fluorescente o no se encuentre en la etapa deseada. Una vez que todas las pipas están montadas y orientadas adecuadamente, tocamos la base de cada pipa con un pincel humedecido con glicol de diodilina, un medio no tóxico que iguala el índice de refracción del aceite puro o de una solución acuosa diluida con agua.Esto cumple una doble función: reducir la difracción del caso de la pupila y reducir la refracción. Se utilizan lentes de inmersión una vez que hemos montado y dispuesto adecuadamente la pupila. Pasamos entonces al microscopio confocal de barrido láser. Utilizamos un microscopio invertido como un SP5 equipado con un escáner de resonancia.El platillo se monta en el microscopio y localizamos la pupa utilizando la óptica del microscopio. Una vez encontrada la pupa, se ajusta el enfoque para que la estructura de interés, en este caso el ala, sea visible. Identificamos el ala por la presencia de un elemento traqueal grande que atraviesa el centro del ala.Una vez identificada la región de interés y enfocado el microscopio, pasamos al objetivo seco de 20 x. Tras volver a verificar el enfoque, cambiamos el microscopio al modo confocal. Ajustamos los parámetros del confocal para minimizar la exposición a la luz.La intensidad de la luz se mantiene por debajo del 10 % de transmisión. Para maximizar el brillo, abrimos el diafragma hasta 130 micrones para el objetivo de 20 x con azuma cuatro y ajustamos la ganancia a 900 voltios. Con estos ajustes, podemos obtener imágenes durante horas sin afectar la duración del intervalo mitótico ni la salud del animal.A continuación, ajustamos el número de secciones Z y la frecuencia de captura de imágenes para que coincidan con las características del fenómeno biológico que intentamos observar; por ejemplo, intervalos de imagen de un minuto capturan adecuadamente todas las características importantes de la división celular. Pero intervalos de tres segundos son necesarios para observar la dinámica de los filopodios. Enfoque hacia arriba y hacia abajo a través del epitelio hasta encontrar la estructura deseada.Si es necesario, utilice el microscopio y el modo XYZT para adquirir series Z a lo largo del tiempo. La duración de los videos también es un parámetro importante. Hemos realizado videos de hasta 10 horas de duración.Al obtener imágenes de múltiples moléculas fluorescentes simultáneamente, intentamos reducir la duración total de la adquisición. En principio, cada marca fluorescente provoca una mayor producción de especies reactivas de oxígeno. En la práctica, no hemos observado letalidad asociada con la obtención de imágenes de líneas marcadas con tres etiquetas durante una hora o menos.Si el tejido objetivo o el proceso es más pequeño que unos cinco micrómetros, probablemente necesitará utilizar una lente de inmersión. Tenga en cuenta que estas lentes enfocan el láser en un punto más fino, aumentando así la intensidad de la luz, y debe ajustar los parámetros de adquisición en consecuencia. Las películas se transfieren desde el microscopio confocal a una computadora que ejecuta el programa de análisis de imágenes gratuito Fiji. Con Fiji, podemos abrir, medir y manipular características en las imágenes multidimensionales generadas por el confocal.Este método de obtención de imágenes nos ha permitido estudiar la posición de los núcleos con respecto al ciclo celular. En el ala pupilar, adquirimos una serie Z desde la parte superior del epitelio hasta los núcleos más basales observables a intervalos de un minuto. En estas películas, solo observamos divisiones ocurriendo en las secciones confocales apicales mostradas aquí a la izquierda; las secciones más basales mostradas a la derecha revelan el retorno de los núcleos recién divididos desde la capa superficial, pero no contienen otras características de la mitosis.Estos datos muestran que el epitelio de la aleta del pupil en rápida división es similar al disco de la aleta larval y a otros MedOne. Epitelial en que los núcleos se desplazan hacia la superficie apical del epitelio durante la mitosis. A pesar de esta similitud, el epitelio de la aleta del pupil es relativamente poco estratificado, con la mayoría de los núcleos muy cercanos a la capa superior.Los métodos anteriores de imagen en drosófila durante las primeras etapas del desarrollo del pupario han estado limitados, principalmente debido a los intentos de eliminar o penetrar la cápsula del pupario. Aquí describimos un enfoque novedoso que nos permite visualizar células adultas durante el desarrollo sin afectar la viabilidad del organismo. Nuestro método es cualitativamente diferente de otros en que mantiene la cápsula del pupario completamente intacta.La combinación de microscopía confocal con escaneo resonante nos permite visualizar tejidos en desarrollo dentro de 20 micrones del caso de la pupila. Las principales limitaciones para resolver la profundidad son la distancia de trabajo del objetivo y la dispersión causada por el caso en el tejido. Sin embargo, nuestro método nos permite resolver características de las células epiteliales desde el ápice hasta la base.Hemos utilizado esta técnica para observar la mitosis, el filo, los podios, la morfogénesis y la fagocitosis. Además, hemos estudiado hasta tres marcadores fluorescentes distintos en una misma muestra. Consideramos que los enfoques descritos aquí abrieron el período temprano del desarrollo del pupilo al estudio de las capas epiteliales más externas.Cuando se combina con el poder de la genética genómica, esta accesibilidad podría mejorar aún más nuestra comprensión del desarrollo adulto.

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Investigación

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Biología

Mesoscópica fluorescencia tomografía opera más allá de los límites de penetración de los tejidos de seccionamiento microscopía de fluorescencia. La técnica se basa en la iluminación multi-proyección y una descripción del transporte de fotones. Se demuestra en vivo de todo el cuerpo visualización en 3D de la morfogénesis de las buenas prácticas agrarias-que expresa ala discos imaginales...

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

Aquí se presenta un protocolo de montaje para...

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

En este video, se describe un método para obtener imágenes de células vivas de la división asimétrica sensorial células progenitoras de órganos y células de la epidermis intacta...

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)El video muestra una técnica de imagen en vivo para estudiar el patrón de ojos en una pupa de Drosophila melanogaster. Los marcadores marcados con proteína fluorescente verde (GFP) permiten la visualización de la organización y diferenciación celular durante la formación de la estructura ocular en desarrollo.

Imágenes en vivo del ojo de la pupa de Drosophila mediante microscopía de fluorescencia

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Aquí, presentamos un método fácil de usar y versátil para realizar en proyección de imagen de procesos de desarrollo en general y músculo-Tendinosas de la morfogénesis en particular en la vida de pupas de Drosophila .

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Este protocolo está diseñado para la toma de imágenes y el análisis de la dinámica de la orientación celular y el crecimiento del tejido en la drosophila epitelia abdominal a medida que la mosca de la fruta sufre metamorfosis. La metodología descrita aquí se puede aplicar al estudio de diferentes etapas del desarrollo, tejidos y estructuras subcelulares en Drosophila u otros organismos modelo.

Imágenes y análisis de la orientación del tejido y la dinámica del crecimiento en el desarrollo de la Drosophila Epithelia durante las etapas pupales

Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Aquí, se presenta un protocolo para la obtención de imágenes en vivo a largo plazo de la pata de Drosophila durante la etapa de pupa, que implica la eliminación completa del pupario. Este protocolo también se puede aplicar a otros tejidos.

Imágenes en vivo a largo plazo del desarrollo de la pata de la pupa de Drosophila después de la extracción del pupario

Drosophila es un modelo poderoso para comprender los mecanismos fundamentales de la miogénesis. Este protocolo para la disección y preparación de hemisecciones de tórax permite el análisis microscópico del músculo de vuelo indirecto tanto de la etapa de pupa como de la adulta. Este protocolo permite obtener imágenes confocales de la morfología celular, la localización de proteínas, la estructura muscular y muchos otros aspectos de la miogénesis.

Disección de los músculos de vuelo indirecto de Drosophila melanogaster para enfoques de microscopía

Aprende a realizar imagen a través de la envoltura pupal de Drosophila melanogaster sin dañar su integridad estructural. Este método de microscopía confocal de barrido rápido permite visualizar procesos celulares dinámicos como mitosis y fagocitosis in situ durante períodos prolongados.

Imaging A través de la envoltura pupal de

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