Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

El objetivo general de este procedimiento es generar esferas myos. Estructuras similares a EB compuestas por células del músculo esquelético a partir de células madre embrionarias humanas. Esto se logra mediante la reprogramación de las células mediante la infección lentiviral de Baf 60 C. El segundo paso del procedimiento es infectar las mismas células con un segundo virus, el lentivirus myo D.

A continuación, se induce a las células infectadas a formar agregados similares a EB durante cinco días en un medio de cultivo basado en suero. A continuación, el medio EB se cambia por un medio de diferenciación libre de suero, y los agregados se cultivan durante dos semanas más en esferas myos. En última instancia, la inmunofluorescencia se utiliza para visualizar secciones de agregados incrustados de OCT.

La principal ventaja de esta técnica es la degeneración de alto rendimiento de las células del músculo esquelético que, al igual que la derivación de Progenitores mesenquimales o mesodérmicos, no requiere clasificación de hechos y, por lo tanto, es compatible con un sistema cultural tridimensional. El día antes de la infección a las células madre embrionarias humanas en placas de seis pocillos, agregue el suplemento de clonación y recuperación de células madre embrionarias humanas al medio a 1000 x para una concentración final de dos micromolares el siguiente día infectar las células madre embrionarias humanas con lentivirus de alto título de 60 CGFP. Primero disocie un pocillo de células en una suspensión de una sola célula agregando un mililitro de callos e incubando la placa durante cinco minutos. Luego recoja y transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros.

Agregue nueve mililitros del medio preparado y gire las celdas a 1, 200 RPM durante cinco minutos mientras espera un mililitro de mt. SIR, uno. Agregue poly brain a seis microgramos por mililitro de concentración final y el suplemento de recuperación de células madre embrionarias humanas a dos micromolares.

A continuación, vuelva a suspender las células en esta solución y transfiéralas a un solo pocillo de una placa de fijación baja de seis pocillos. Ahora agregue el virus de baño concentrado 60 C a una multiplicidad de infección de 100 millones. Incubar la placa durante tres horas con el virus.

A continuación, recoge las células y divídelas en dos pocillos de placas recubiertos de matrigel. A cada placa, agregue dos mililitros de mt, SIR, uno con dos suplementos micromolares, y luego incube las células durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, reemplace los medios con medios nuevos.

Las células parecerán haberse agrupado después de 48 horas desde el inicio de la infección. Compruebe la fluorescencia para evaluar la eficacia de la infección. Continúe con los cambios diarios de medios hasta que las células estén al 80% de confluencia, luego disocie las células y el virus myo D a las células usando el mismo protocolo.

Mantener las células infectadas con cambios diarios de medio hasta que alcancen el 80% de confluencia el día antes de este punto de crecimiento. Placa MES en placas recubiertas de matrigel a 1000 células por centímetro cuadrado para pasar las células infectadas a la placa ME'S. Al día siguiente.

Use el ALI de disparo para disociarlos y transferir las células a un tubo de 15 mililitros a las células. Agregue nueve mililitros de medio de células madre embrionarias humanas y centrifuérrelas. Agregue 1, 200 RPM durante cinco minutos.

Resus, suspender las células peletizadas en un medio fresco de seis mililitros de células madre embrionarias humanas. Ahora retire el medio de dos placas de mes y agrégueles las células infectadas. Incuba las células durante varios días.

Una vez, agregue el 80% de confluencia. Retira todos los medios y añade un mililitro de colagenasa cuatro. Añadir un miligramo por mililitro después de cinco minutos en colagenasa a 37 grados centígrados.

Reemplace la colagenasa con un mililitro de medio de células madre embrionarias humanas. Luego, bajo un microscopio de disección, raspe las colonias con una punta de pipeta de 10 mililitros, transfiera las colonias a un tubo de 15 mililitros y deje que se asienten. Después de tres minutos, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un medio de células madre embrionarias humanas.

A continuación, coloque las células en una proporción de uno a cuatro con respecto a las placas de metanfetamina. Las células infectadas deben estar en un número alto y haber formado colonias de buena calidad para este procedimiento. Retire el medio de cada pocillo y agregue un mililitro de colagenasa. Cuatro.

Agregue un miligramo por mililitro de concentración como antes, y la colagenasa reacciona después de cinco minutos reemplazándola con medio EB. Y luego use rápidamente un microscopio para raspar las colonias. Con una punta de pipeta de 10 mililitros, es posible disociar las células en pequeños grupos de células.

Recoja estos agregados en un tubo de 15 mililitros y, después de que se hayan asentado durante unos tres minutos, retire el sobrenadante, vuelva a suspender las células en tres mililitros de medio EB y transfiera todo a un solo pocillo de una placa de fijación baja de seis pocillos. Incuba esta placa durante la noche del día siguiente. Revíselos en busca de grandes trozos de colonias.

Si se encuentra alguno. Divídelos haciéndolos pasar por una pipeta de cinco mililitros unas cuantas veces. Si hay muchas células individuales flotantes, recoja los agregados por sedimentación y reemplácelos con medio EB fresco.

Reemplace los medios cada dos días después de cinco días de cultivo. Recoja los agregados celulares y lávelos una vez con dos mililitros de PBS, lo que permite que las células se sedimenten bajo la gravedad normal. A continuación, sustituya el PBS por tres mililitros de medio DM y devuelva las células a los mismos pocillos en placa durante los siguientes 15 días de cultivo.

Reemplace el medio cada tres días. Durante este tiempo, se formarán las mesosferas. Las células madre embrionarias humanas se infectaron con el baño 60 C portadoras de fluorescencia GFP.

Después de 72 horas, las celdas fueron clasificadas. Las células que expresaban BAF 60 C crecieron hasta aproximadamente el 75% de fluidez y luego se infectaron con lentivirus myo D. La expresión génica exógena se detectó en las células infectadas mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

Se examinó la expresión y distribución a nivel de proteína. A continuación, GFP corresponde a la expresión de baf 60 C, y se utilizó un anticuerpo myo D para verificar la expresión de myo D. 15 días después de que las células madre embrionarias humanas comenzaran a formar agregados similares a EB.

Una parte de las esferas de mios se incrustó en el compuesto OCT y se seccionó, la sección se tiñó positivamente para marcadores de cadenas pesadas miogénicas y miosinas. A partir del día 10, fue posible observar una contracción esporádica en las esferas myos. Algunas esferas myos asumieron formas diferentes o inusuales, tal vez debido a la fusión entre esferas myos.

Esta técnica permitirá avanzar en la investigación en el campo del modelado y tratamiento de enfermedades, ya que se pueden generar mioesferas a partir de células madre pluripotentes de pacientes afectados por diferentes trastornos musculares. Por esa razón, las mioesferas proporcionan un modelo de enfermedad en edición adecuado para la limpieza de fármacos y la patogénesis de enfermedades.