Name: Organización helicoidal de sangre Coagulación Factor VIII en lípidos nanotubos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprende a determinar la estructura del factor VIII de coagulación organizado helicoidalmente en nanotubos lipídicos mediante microscopía crioelectrónica. Este método combina reconstrucción 3D helicoidal con algoritmos de partículas individuales.

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Este trabajo es apoyado por una beca de Desarrollo Nacional Científico de la Asociación Americana del Corazón: 10SDG3500034 y UTMB-BCN en marcha los fondos de SSM. Los autores reconocen las instalaciones Cryo-EM y Computación Científica en el Centro de Sealy de Biología Estructural en UTMB ( <a href="http://www.scsb.utmb.edu">www.scsb.utmb.edu</a> ), así como los Dres. Steve Ludtke y Ed Egelman ayuda con los algoritmos de reconstrucción helicoidales en 2D y 3D.

1. Preparación de la muestra <ol><li> El cambio de tampón de FVIII humano de BDD-14 y porcino de FVIII BDD-15 contra el tampón HBS-Ca (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, pH = 7,4) y se concentran a 1,2 mg / ml. Mantenga la solución de proteína a -80 ° C. </li><li> Preparar nanotubos de lípidos (LNT) mezclando galactosilceramida (GC) y fosfatidilserina (PS) en 01:04 w / w proporción en cloroformo. Evaporar el cloroformo en atmósfera de argón y solubilizar los lípidos en tampón HBS a 1 mg / ml. Mantenga la solución LNT a 4 ° C. </li></ol> 2. Cryo-Microscopía Electrónica de FVIII-LNT <ol><li> Cryo-EM Preparación de la muestra <ol><li> Resplandor de descarga de la malla 300 Quantifoil R2 / 2 rejillas de cobre (laterales de carbono a) en una mezcla de O 2 y H 2 gas durante 10 segundos a 50 W. </li><li> Mezclar las soluciones de FVIII y LNT en tampón HBS-Ca al 01:01 w / w proporción y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Aplique una gota de 2,5 lde la muestra de FVIII-LNT a la red de microscopía electrónica hidrófilo en la cámara humidificada Vitrobot Mark IV (100% de humedad). </li><li> Blot y flash congelar la red (una mancha de 3,5 seg, fuerza borraré 1) en el líquido C 2 H 6, enfriados por N2 líquido para obtener hielo amorfo. </li><li> Rejillas tienda en cajas de almacenamiento bajo N2 líquido (LN2). </li></ol></li><li> Cryo-EM Data Collection NOTA: El JEM2100-LaB6 (año 2010) está equipada con un sistema operativo Temcon que consiste en un ordenador conectado a la microscopio electrónico, una pantalla con ventanas de lectura del sistema de vacío, sistema de iluminación, HT, corrientes de lentes y de modo-en, y dos paneles: izquierda y derecha, colocada en ambos lados de la columna. El cambio de barras en cruz, perillas Y (SHIFT Y, SIFT Y) y la multifunción (DEF / STIG) perillas están en ambos paneles. En el panel izquierdo es el botón de iluminación (brigthness). En el panel de la derecha se encuentran: la ampliación (MAG / CAM LONGITUD) y enfoque (FOCUS) perillas y los tres imaging (MAG1, MAG2, LOWMAG) y una difracción modos botones (DIF). Adquirimos nuestros datos en MAG1 en alfa 2. Las condiciones mínimas dosis de iluminación (MDS) necesarios para la adquisición de datos Cryo-EM se establecen con botones F1 a F6, fila superior del panel DERECHA. En este protocolo se utiliza la configuración genéricos: F1 - levantar / pantalla inferior, F2 - modo de búsqueda, F3 - modo de enfoque, F4 - Modo PHOTO, F5 - MDS OFF / ON y F6 - RAYO BLANCO, que sirve para proteger la muestra de la radiación dañar al desviar el haz. <ol><li> Coloque la crio-soporte en la crio-estación y llenar el Dewar del titular y la crio-estación con LN2. Cuando la temperatura llega a -192 ° C, obturador abierto en la punta titular, el lugar previamente congelado rejilla Cryo-EM en el lugar designado y seguro con una abrazadera de anillo. </li><li> Inserte la crio-soporte en el microscopio electrónico. Vuelva a llenar el Dewar de la crio-soporte y la cámara contra el contaminador con LN2. Espere a que el titular se estabilice durante 30 a 60 min. Presione F6 yconvertir el filamento en. Cuando el filamento está saturado, pulse F6 obturador y abra el soporte para ver la cuadrícula. </li><li> Pulse Bajo Mag / alfa 1 (puesta a 200X mag) y localizar zonas con hielo delgado en la parrilla. </li><li> Cambiar al MAG 1/alfa 2 para establecer dosis mínima modo (MDS) y adquirir datos de Cryo-EM a dosis bajas de electrones, sin dañar la muestra. <ol><li> Presione F2 para configurar el modo de búsqueda. Set de ampliación a 40.000 x. Agrandar viga con perilla brigtness a dosis mínima de electrones ~ 0.04 e - / Å 2 · s. Presione DIF para cambiar al modo de difracción. Ajuste la longitud de la cámara de 120 cm con mando MAG / CAM LONGITUD. Localiza las zonas de la cuadrícula dentro de las zonas de pre-seleccionados en LOWMAG que tienen nanotubos de lípidos en los agujeros de la película de carbono. </li><li> Presione F4 para establecer el modo de fotos a 40.000 X de aumento y set de iluminación con botón BRILLO en dosis de 16 a 25 e - / A 2 · s. Pulse el botón Estándar Focus para establecer las condiciones de enfoque ajustando la altura Zde la muestra con los botones ARRIBA / ABAJO (Z del panel de control a la derecha). Establecer desenfoque entre -1,5 y -2,5 m. </li><li> Alinear búsqueda y el modo FOTO dibujando un cuadrado en la ventana de Vista en vivo en la pantalla de la cámara digital en modo de búsqueda correspondiente al área a explorar en el modo Foto. </li><li> Presione F3 para configurar el modo de enfoque a 100.000 aumentos. Enfoque de iluminación para cubrir el chip CCD (~ 4 - 5 cm de radio) y fuera del eje para no irradiar el área a explorar en el modo de FOTO. Ajuste de desenfoque a ~ -1,5 y -2,5 m con el botón de enfoque y correcta para el astigmatismo de la imagen con perillas DEF / STIG. </li></ol></li><li> Seleccione el FVIII-LNT en ser fotografiado en modo BUSCAR mediante la adquisición de imágenes en directo en la ventana de Vista en vivo en la pantalla de la cámara digital. Centre el FVIII-LNT en el cuadrado dibujado en la ventana de vista en directo. </li><li> Grabar una imagen digital de la cámara del CCD en 52.000 magnificación X eficaz y 0,5 segundos de exposición al cambiar a modo Foto y hacer clic en el AcquirBotón E en la micrografía pantalla de la cámara digital. Las condiciones de adquisición de imágenes se establecen como el blanco del haz (PERSIANAS) abierto sólo cuando la imagen se adquiere en el modo Foto. </li><li> Compruebe la calidad y el desenfoque de la imagen adquirida pulsando CTRL-C para obtener una transformada rápida de Fourier (FFT). </li></ol></li></ol> 3. Reconstrucción 3D NOTA: El software de análisis de imagen que se utiliza para el análisis 2D y 3D: EMAN2 y IHRSR son de libre acceso. EMAN2 se puede descargar desde http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install. El software IHRSR se puede obtener de Profesor Egelman: egelman@virginia.edu. Los refinamientos IHRSR finales se ejecutan en el de Texas Advanced Computing cluster central: http://www.tacc.utexas.edu/ en la Universidad de Texas, Austin. El algoritmo de reconstrucción 3D se muestra en la figura 1 consta de dos pasos principales: En primer lugar la selección de un conjunto homogéneo de segmentos helicoidales (partículas) con la referencia gratuita alignme 2DNT (RFA) algoritmos implementados en EMAN 2, segunda lograr una reconstrucción en 3D basado en los parámetros helicoidales y algoritmos de retroproyección incorporados en IHRSR. El primer paso utiliza los programas desarrollados para la selección de conjuntos de partículas homogéneas para la reconstrucción 3D con sola partícula SPA (algoritmos) para los que EMAN2 ha sido desarrollado y distribuido en concreto: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2. Este paso se ha adaptado a los datos de Cryo-EM. El segundo paso se consigue con el algoritmo IHRSR, que está diseñado específicamente para el tipo de los conjuntos helicoidales obtenidos con las formas de factor VIII recombinantes. Este algoritmo se ha documentado ampliamente a través de la literatura científica 12. <ol><li> Realizar el análisis de imágenes en 2D con la científica suite de procesamiento de imágenes EMAN2: http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html 16 para seleccionar partículas homogénea (segmento helicoidal) juegos para la reconstrucción helicoidal. <ol><li> Seleccione micrografías Cryo-EM con straight y bien organizada tubos helicoidales con el software de la cámara digital y herramientas de visualización. </li><li> Invertir, Normalizar y filtrar para los píxeles de rayos X en la GUI e2workflow.py, la reconstrucción de una sola partícula opción (spr): http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager </li><li> Importe las imágenes invertidas, normalizados y pixel de rayos X filtrada en la GUI e2helixboxer.py. Seleccione tubos helicoidales FVIII-LNT y segmento de 256 x 256 píxeles (2,9 Å / pix) con 90% de superposición usando: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer </li><li> Evaluar el desenfoque de las micrografías originales y aplicar la función de transferencia de contraste (CTF) corrección (sólo corrección de fase) a los segmentos helicoidales de los mismos micrografías con la opción e2ctf.py incorporado en el e2workflow.py: http://blake.bcm. edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf. </li><li> Generar partículas iniciales (segmentos helicoidales) establece en el GUI e2workflow.py opción - SPR: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow. </li><li> Calcular los promedios de clase en 2D con el algoritmo e2refine2d.py aplicar referencia libre de clasificación k-mean para seleccionar conjuntos de datos homogéneos con el mismo LNT diámetro y grado de orden helicoidal (Figura 2), siguiendo el guión: &#39;e2refine2d.py - iter = 8 - naliref = 5 - nbasisfp = 8 - path = r2d_001 - entrada = INPUT.hdf - NCLS = 51 - simcmp = dot - simalign = rotate_translate_flip - classaligncmp = dot - classraligncmp = fase - classiter = 2 - classkeep = 0,8 - classnormproc = normalize.edgemean - classaverager = media - normproj-classkeepsig &#39;, cambiando el valor de este trastorno en consecuencia. <ol><li> Clasificar los datos iniciales establecidos en &#39;NCLS = 151&#39; 150 clases de más de 8 repeticiones con &#39;classkeep = 0.8&#39;, lo que significa que las partículas con menos de 80% de similitud con el promedio de la clase están excluidas de la clase dada. http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d </li><li> Combinar las partículas de los promedios de la clasecon difracción helicoidal pronunciado en e2display.py para crear conjunto de datos intermedio. </li><li> Clasificar las establecidas en 50 clases de &#39;NCLS = 51&#39; para diferenciar las clases con el mismo diámetro y el grado de orden de los datos intermedios. </li><li> Combinar las partículas de las clases con el mismo diámetro y grado de orden en e2display.py para crear el conjunto de datos finales para la reconstrucción en tres dimensiones: http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector. </li></ol></li></ol></li><li> Realizar la reconstrucción helicoidal con el algoritmo iterativo helicoidal real espacio Reconstrucción (IHRSR), como se describe en Egelman 17, 18. <ol><li> Estimar la subida, Delta Z (A) de la hélice FVIII-LNT Del Fourier transformar combinado de las partículas en el conjunto de datos final. </li><li> Definir el ángulo azimutal ΔΦ (º) mediante la ejecución de mejoras IHRSR paralelas con un Delta Z constante, aumentando ΔΦ de 576; a 60 ° en incrementos de 5 °. </li><li> Correr 100 ciclos IHRSR consecutivos para el grupo con un cilindro sin rasgos como un volumen inicial y los parámetros helicoidales iniciales Delta Z y ΔΦ definidos en 3.2.1 cada dato de finales. y 3.2.2. </li><li> Inspeccione los volúmenes finales de la convergencia de los parámetros helicoidales y la correspondencia entre los promedios de la clase de la clasificación 2D del conjunto final de datos y las proyecciones de la reconstrucción IHRSR final. </li><li> Imponer la simetría de las reconstrucciones en 3D finales, correspondiente a la distribución unidad asimétrica observado en los últimos volúmenes 3D asimétricos: 4 veces para el FVIII humano-LNT y 5 veces para el FVIII porcino-LNT. Ejecute otros 100 ciclos de perfeccionamiento para generar una reconstrucción 3D symmetrized final. </li><li> Calcula la curva de correlación Fourier Shell para ambos volúmenes separando primero los datos correspondientes establecidos en pares e impares: &#39;e2proc2d.py &lt;infile&gt; &lt;Outfile&gt; - split = 2 &#39;. A continuación, ejecute 100 IHRSR refinamientos consecutivos como se describe en 3.2.3. Calcular la FSC de los volúmenes 3D creados a partir de los conjuntos de datos de pares e impares: &#39;e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt - calcfsc = oddmap.mrc&#39;. </li></ol></li><li> Visualizar y Segmento los volúmenes FVIII-LNT en UCSF quimera. </li><li><ol><li> Abra los volúmenes finales de la etapa 3.2.5. en UCSF Chimera y establecer el nivel de contorno a 0.005 en el Herramientas&gt; DATOS VOLUMEN&gt; opción Volume Viewer. </li><li> En Herramientas&gt; DATOS VOLUMEN&gt; mapa de segmentos, seleccione el volumen en la pestaña de mapa de segmentos y hacer clic en un segmento a otro volumen. </li><li> Segmentos del Grupo correspondiente a una celda unidad mediante la selección con CTRL + SHIFT y el grupo de clic. </li><li> Colorea los segmentos por celda unidad y la hélice con ACCIONES&gt; opción COLOR destacar las características estructurales. </li></ol></li></ol> 4. Tomografía electrónica <ol><li> Tinción negativa FVIII-LNT Preparación de la muestra <ol> &lt;li&gt; Prepare muestras FVIII-LNT como para los experimentos de Cryo-EM. </li><li> Las descargas luminiscentes rejilla de cobre recubierta de carbono de malla 300 (lado de carbono hacia arriba) en una mezcla de O 2 y H 2 de gas de 10 segundos a 50 W como para los experimentos de Cryo-EM. </li><li> Aplicar una gota de 2,5 l de suspensión de FVIII-LNT con 6-nm nanopartículas de oro coloidal a la red, secar el exceso de líquido y manchar negativamente por la aplicación de 5 l solución de 1% de acetato de uranilo durante 2 min. Seque el exceso de líquido y secar la rejilla. </li></ol></li><li> Tomografía electrónica de recopilación de datos <ol><li> Transfiera la red en el soporte de inclinación individual. </li><li> Transferir el titular en el microscopio electrónico. </li><li> Recoger serie de inclinación automáticamente con el software SerialEM 19 a los 2 ° incrementos sobre un rango angular de -60 ° a 60 ° y grabar las imágenes con una cámara CCD a 52.000 X magnificación efectiva, -6--10 desenfoque micras y la dosis de electrones de 150 - 170 elementosctrons / A 2 · s por tomografía. </li></ol></li><li> Tomografía electrónica Reconstrucción de FVIII-LNT Nota: Reconstruir la serie inclinada pFVIII-LNT y hFVIII-LNT adquirida en 4.2. con la opción Etomo del software IMOD siguiendo el tutorial: http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html <ol><li> El uso de una ventana de terminal, abra la tomografía en 3dmod. http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html. </li><li> Papelera de la tomografía por 4 con el IMOD BINVOL comando para disminuir el tamaño de la tomografía. </li><li> Seleccionar el ángulo correcto para girar el nanotubo de lípidos a lo largo del eje Y en la tomografía binned usando el comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Gire la tomografía completa con el comando IMOD ROTATEVOL. </li><li> Recortar el nanotubo de lípidos seleccionada orientada a lo largo del eje Y con el comando RESIZE CLIP IMOD. </li><li> Abra la sub-tomografía recortada con 3dmod. </li><li> Haga clic en la tomografía de visualizar la disposición de las moléculas del factor VIII a lo largo delos cortes en el eje Z ya lo largo del eje Y en el volumen sub-tomografía. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia y se les puede contactar directamente con respecto a cualquiera de los procedimientos publicados en este manuscrito.

En este trabajo se presenta una metodología para diferenciar entre dos organizaciones unidas a la membrana de proteínas altamente homólogas: FVIII humano y porcino auto-ensamblado en nanotubos de lípidos en las condiciones encontradas en el cuerpo humano. En el procedimiento descrito, humana y FVIII porcino se organizan con éxito helicoidalmente en nanotubos de lípidos, que es el paso más crítico. El siguiente paso fundamental es preservar la muestra en hielo amor...

Factor de coagulación sanguínea VIII (FVIII) es una glicoproteína grande de 2332 aminoácidos organizados en seis dominios: A1-A2-B-A3-C1-C2 3. Tras la activación de trombina de FVIII actúa como cofactor para el factor IXa en el complejo activador unido a la membrana. La unión de FVIII activado (FVIIIa) de FIXa de una manera membrana dependiendo mejora FIXa eficiencia proteolítica más de 10 5 veces, que es crítico para la coagulación de la sangre eficiente 4. A pesar de la importante función de FVIII juega en la coagulación y la formación del complejo tenasa, la estructura de FVIII unido a la membrana funcional todavía no se ha resuelto. Para hacer frente a esto, los nanotubos única bicapa lipídica (LNT) ricos en fosfatidilserina (PS), capaces de unirse con alta afinidad de FVIII 8, 9 y se asemeja a la superficie de las plaquetas activadas se han desarrollado 10. Organización helicoidal consecutiva de FVIII unido a LNT ha demostrado ser efective para la determinación estructural de estado unida a la membrana FVIII por Cryo-EM 5. Funcionalizado LNT son un sistema ideal para estudiar la proteína-proteína y las interacciones proteína-membrana de proteínas asociadas a la membrana helicoidal organizados por Cryo-EM 11, 12. Cryo-EM tiene la ventaja sobre los métodos estructurales tradicionales tales como la cristalografía de rayos X y RMN, como la muestra se conserva en más cercana a la ambiente fisiológico (tampón, membrana, pH), sin aditivos e isótopos. En el caso del FVIII, el estudio de la estructura unida a la membrana con esta técnica es aún más fisiológicamente relevantes, como la LNT se asemejan estrechamente por tamaño, forma y composición de los pseudópodos de las plaquetas activadas en donde los complejos de tenasa ensamblan in vivo. Defectos y deficiencia de FVIII causa de la hemofilia A, un trastorno hemorrágico grave que afecta a 1 de cada 5.000 varones de la población humana 4, 6. La mayoría de los eterapia ffective para la Hemofilia A es la administración de toda la vida de FVIII recombinante humano (hFVIII). Una complicación importante de la terapia de FVIII recombinante La hemofilia A es el desarrollo de anticuerpos inhibidores para la forma humana que afecta aproximadamente al 30% de los pacientes de la hemofilia A 13. En este caso, se utiliza FVIII porcino (pFVIII) concentrado, como pantallas de FVIII porcino baja reactividad cruzada con anticuerpos inhibidores contra FVIII y forma complejos funcionales con FIXa humano 7 humana. El establecimiento de la organización unida a la membrana de ambos porcina y formas de FVIII humanos es importante entender las bases estructurales de la función y las repercusiones para la hemostasia sanguínea cofactor FVIII. En este estudio, se describe una combinación de nanotecnología de lípidos, Cryo-EM, y análisis de la estructura diseñada para resolver la organización unido a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas. Los datos de Cryo-EM presentados y estructuras 3D para porci helicoidal organizadoFVIII NE y humano cargado negativamente en LNT muestran el potencial de la nanotecnología propuesto como base para la determinación de la estructura de FVIII y factores y complejos en un entorno fisiológico de la coagulación de la membrana unidos a la membrana.

<table><tbody><tr><td>JEM2100 con LaB6</td><td>JEOL Ltd.</td><td>JEM-2100</td><td>operado a 200 kV</td></tr><tr><td>con el software TEMCON</td><td>JEOL Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gatan626 Crio-soporte</td><td>Gatan, Inc.</td><td>626.DH</td><td>enfriado a -175 &deg; C</td></tr><tr><td>con unidad de control de temperatura</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD Gatan 4K x 4K</td><td>Gatan, Inc.</td><td>US4000</td><td>4.096 x 4.096 píxeles a 15 &mu; resolución física m/pixel Limpiador de</td></tr><tr><td>plasma Solarus Modelo 950</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rejilla de cobre de 300 mm con recubrimiento de carbono Rejilla de cobre de 3 mm</td><td>Ted Pella</td><td>01821</td><td>limpiado con plasma durante 10 segundos en malla</td></tr><tr><td>Quantifoil R2/2 300</td> de alta potencia <td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>Q225-CR2</td><td>Rejillas de Cu de 300 mallas recubiertas de carbono con orificios de 2 mm de diámetro&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetato de uranilo dihidratado</td><td>Ted Pella</td><td>19481</td><td>solución al 1%, ceramida de</td></tr><tr><td>galactosil</td> filtrada <td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>860546</tr><tr><td>Dioleoyl-sn-glicero-fosfo-L-serina</td><td>Avanti Polar Lipids Inc.</td><td></td><td></td>840035</tr><tr><td>software EM Micrografía digital</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td><a href="http://www.gatan.com/DM/">http://www.gatan.com/DM/</a></td></tr><tr><td>EM software EMAN</td><td>descarga</td><td></td> gratuita<td><a href="http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/&nbsp; Descarga gratuita del software </a></td></tr><tr><td>EM Spider</td><td></td><td><a href="http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a></td>EM software IHRSR descarga gratuita Programas disponibles de Edward H. Egelman http://people.virginia.edu/~ehe2n/ EM software (IMOD)descarga gratuita <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/">http://bio3d.colorado.edu/imod/&nbsp; </a></td></tr><tr><td>EM software (SerialEM)</td><td>descarga</td><td></td> gratuita<td><a href="ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/">ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/</a></td></tr><tr><td>UCSF-Chimera</td><td>descarga</td><td></td> gratuita<td><a href="http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</a></td></tr></tbody></table>

organización helicoidal de sangre coagulación factor viii en lípidos nanotubos

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

<html> Crio-microscopía electrónica (Cryo-EM) 1 es un enfoque poderoso para investigar la estructura funcional de las proteínas y complejos en un entorno de estado y de la membrana hidratada 2. Factor de coagulación VIII (FVIII) 3 es un multi-dominio de la glicoproteína del plasma sanguíneo. Defecto o deficiencia de FVIII es la causa para el tipo de hemofilia A - un trastorno hemorrágico grave. Tras la activación proteolítica, de FVIII se une a la serina proteasa Factor IXa en la membrana plaquetaria cargados negativamente, lo cual es crítico para la coagulación normal de la sangre 4. A pesar del papel fundamental FVIII juega en la coagulación, la información estructural de su estado unida a la membrana es incompleta 5. Concentrado de FVIII recombinante es el medicamento más eficaz contra la hemofilia tipo A y disponible comercialmente FVIII se puede expresar como ambos forman complejos funcionales con Factor humano IXa 6,7 humana o porcina,. &quot;&gt; En este estudio se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica (crio-ME), el análisis de lípidos y la nanotecnología estructura aplicarse para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas:. Humano y porcino La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe. Los resultados representativos demuestran que nuestro método es suficientemente sensible para definir las diferencias en la organización helicoidal entre los dos altamente homóloga en secuencia (86% de identidad de secuencia ) proteínas. protocolos detallados para la organización helicoidal, Cryo-EM y tomografía electrónica ET adquisición de datos () se dan. Los dos dimensiones (2D) y tridimensional (3D) análisis de la estructura aplican para obtener las reconstrucciones en 3D de humano y porcino Se discute FVIII-LNT. Las estructuras humanas y porcinas presentados FVIII-LNT muestran el potencial de la metodología propuesta para Calculate la organización funcional, unido a la membrana del Factor VIII de coagulación sanguínea en alta resolución.

FVIII porcino recombinante humana y se organizaron con éxito helicoidalmente en carga negativa única LNT bicapa, parecida a la superficie de las plaquetas activadas. La organización helicoidal de la humano y porcino de FVIII-LNT fue consistente a través de las micrografías digitales recogidas (Figura 2). Fueron seleccionados La LNT control y lo humano y tubos helicoidales FVIII-LNT porcinos y segmentados con la GUI e2helixboxer.py y conjuntos de datos iniciales creados con la interfaz g...

Se presenta una combinación de crio-microscopía electrónica, la nanotecnología de lípidos, y análisis de la estructura aplicada para resolver la estructura unida a la membrana de dos formas de FVIII altamente homólogas: humanos y porcinos. La metodología desarrollada en nuestro laboratorio para organizar helicoidalmente las dos formas de FVIII recombinantes funcionales en nanotubos de lípidos cargados negativamente (LNT) se describe.

Organización helicoidal de sangre Coagulación Factor VIII en lípidos nanotubos

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar cómo definir la estructura del factor VIII heli organizado en nanotubos lipídicos mediante criomicroscopía electrónica. Esto se logra organizando primero el factor VIII purificado helicoidalmente en nanotubos lipídicos y recopilando datos de criomicroscopía electrónica a temperatura de nitrógeno líquido y dosis bajas de electrones. A continuación, se calcula la estructura unida a la membrana del factor VIII combinando partículas individuales y algoritmos de reconstrucción helicoidal en 3D.Luego se recopilan los datos de la tomografía electrónica y se genera la reconstrucción en 3D. Finalmente, se validan las estructuras de nanotubos lipídicos del factor VIII calculadas segmentando los volúmenes 3D y comparándolos con las reconstrucciones tomográficas. El método demostrado puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural y la coagulación de la sangre, como cuál es la organización del factor VIII unida a la membrana y cómo se relaciona con su función en la coagulación.El GM 2100 lab six está equipado con un sistema operativo TE que consiste en un ordenador conectado al microscopio electrónico. En ambos paneles hay una pantalla con ventanas que leen el sistema de vacío, el sistema de iluminación, las corrientes de la lente HT y dos paneles a la izquierda y a la derecha colocados a ambos lados de la columna, el cambio de haz, las perillas XY y las perillas multifunción o de palanca sorda. En el panel izquierdo se encuentra la perilla de iluminación o brillo.El panel derecho alberga los mandos de aumento y enfoque y los tres botones para obtener imágenes de mag uno, mag dos y low mag, y uno para el modo de difracción. Para este protocolo, adquiera datos en mag one en alfa dos utilizando configuraciones genéricas. Establezca las condiciones de iluminación de dosis mínimas o MDS requeridas para la adquisición de datos crioelectromagnéticos con los seis botones F1 a F ubicados en la fila superior del panel derecho.Utilice F1 para subir o bajar la pantalla, F dos para el modo de búsqueda y F tres para enfocar. Elija F cuatro para el modo de foto, F cinco para apagar y encender el MDS, y F seis para el haz en blanco, que se utiliza para proteger la muestra del daño por radiación al desviar el haz. Después de preparar las muestras de criomielíticas, de acuerdo con el protocolo de texto, coloque el soporte criogénico en la estación criogénica y, con nitrógeno líquido, llene el hacedor del soporte y la estación criogénica.Cuando la temperatura alcance los 192 grados centígrados negativos, abra el obturador en la punta del soporte, coloque la rejilla criogénica EM previamente congelada en el lugar designado y use una abrazadera de anillo para asegurarla. A continuación, inserte el soporte criogénico en el microscopio electrónico y use nitrógeno líquido para rellenar el hacedor del soporte criogénico y la cámara anti atóra. Una vez que el soporte se haya estabilizado durante 30 a 60 minutos, encienda el filamento.Cuando el filamento esté saturado, presione F seis para apagar y abra el obturador en el soporte. Para ver la cuadrícula, presione alfa de magnitud baja uno y ubique las áreas de la cuadrícula con hielo fino. A continuación, cambie a mag one alpha two para establecer la dosis mínima o el modo MDS y adquiera datos criogénicos EM a dosis bajas de electrones para no dañar la muestra.Elija F dos para configurar el modo de búsqueda y establezca el aumento en 40, 000 x. Use la perilla de brillo para ampliar el haz a la dosis mínima de electrones de aproximadamente 0.04 electrones por angstrom cuadrado por segundos. Luego presione diff para cambiar al modo de difracción con la perilla de longitud de la leva magnética.Ajuste la longitud de la cámara a 120 centímetros. A continuación, localice las áreas de la rejilla que tienen nanotubos lipídicos en los agujeros de la película de carbono dentro de las áreas preseleccionadas. A continuación, presione F cuatro para configurar el modo de foto a 40, 000 x aumento y use la perilla de brillo para configurar la iluminación a dosis de 16 a 25 electrones por angstrom cuadrado por segundos.A continuación, pulse el botón de enfoque estándar para establecer las condiciones de enfoque, ajustando la altura Z de la muestra con los botones Z arriba abajo Establezca el desenfoque entre 1,5 micrómetros negativos y 2,5 micrómetros negativos. Alinee el modo de búsqueda y foto dibujando un cuadrado en el modo de búsqueda en la ventana de visualización en vivo en el monitor de la cámara digital correspondiente al área que se va a fotografiar en el modo de foto, presione F tres para configurar el modo de enfoque en 100, 000 x aumento. A continuación, enfoque la iluminación para cubrir el chip CCD y fuera del eje para no irradiar el área que se va a fotografiar.En el modo foto, ajuste el desenfoque entre 1,5 micrómetros negativos y 2,5 micrómetros negativos para corregir el astigmatismo de la imagen si es necesario. En el modo de búsqueda, seleccione el F ocho L y el T que se van a visualizar adquiriendo imágenes en vivo en la ventana de visualización en vivo en el centro del monitor de la cámara digital, el F ocho L y T en el cuadrado dibujado en la ventana de visualización en vivo. Cambie al modo foto y haga clic en el botón Adquirir en el monitor de la cámara de micrografía digital.Para grabar una imagen digital en la cámara CCD, presione CTRL F para obtener una transformada rápida de Fourier para verificar la calidad y el desenfoque de la imagen adquirida. Después de utilizar los softwares gratuitos de procesamiento de imágenes científicas Eman two e I-H-R-S-R para realizar análisis de imágenes 2D y reconstrucción helicoidal de acuerdo con el protocolo de texto. Para visualizar y segmentar los volúmenes F, ocho, L y T, abra las reconstrucciones 3D finales en las herramientas de selección de cera de UCSF, mapa de segmentos de datos de volumen y, en la pestaña mapa de segmentos, seleccione volumen y haga clic en segmento para segmentar los datos de volumen.A continuación, pulse Control shift y haga clic en agrupar para agrupar los segmentos correspondientes a una celda unitaria. Para enfatizar las características estructurales, elija las acciones color para colorear los segmentos por celda unitaria y hélice. Para recopilar los datos de tomografía electrónica, la rejilla de microscopía electrónica teñida negativamente se transfiere a un solo soporte de inclinación antes de transferir el soporte a la inclinación del microscopio electrónico.Se recolectaron series de factor VIII porcino organizado aliado en nanotubos lipídicos con el software EM seriado. De acuerdo con el protocolo de texto, el Tom se reconstruyó en IM y se visualizó en 3D mod para disminuir el tamaño del imad bin Val tobin en cuatro, luego use el comando IM mod rotate vol para seleccionar el ángulo adecuado para rotar el tubo nano lipídico a lo largo del eje Y y girar el tommo completo con el recorte del comando de cambio de tamaño del clip IM mod, el nanotubo lipídico seleccionado a lo largo del eje Y usa 3D mod para abrir el sub tommo recortado. Finalmente, haga clic en el Tommo Graham para visualizar la disposición de las moléculas del factor VII a lo largo de los cortes en el eje Z y a lo largo del eje Y en el volumen del subtomo.Como se muestra aquí, los F 8 recombinantes humanos y porcinos se organizaron con éxito en lts de una sola capa cargada negativamente que se asemejan a la superficie plaquetaria activada. Esta figura muestra que el orden helicoidal de los F ochos humanos y porcinos unidos a la membrana y la bicapa lipídica en los mejores promedios de clase LNT y F ocho LNT 2D de control están bien definidos y revela las variaciones en la organización helicoidal entre las dos proteínas. Estos paneles representan las reconstrucciones 3D iniciales para los F ocho L y T humanos y porcinos que se llevaron a cabo con 1000 partículas representativas de los conjuntos de datos finales de F ocho L y T humanos y porcinos aquí, los gráficos de correlación de conchas para F eight LNT humanos y porcinos indican una resolución de 20,5 angstroms a una correlación de conchas de Fourier igual a 0,5 en esta figura.Los volúmenes finales muestran ocho moléculas humanas F ocho y 10 F porcinas unidas a ocho membranas organizadas alrededor del eje helicoidal. Cada molécula F ocho humana se traduce 41,2 angstroms y se gira 42,0 grados con respecto a la anterior, y cada molécula F ocho porcina se traduce 35,9 angstroms y se rota 35,2 grados con respecto a la molécula anterior, lo que corresponde a los parámetros helicoidales de las reconstrucciones 3D finales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo adquirir datos de criomicroscopía electrónica de un aliado de proteína marrón de membrana organizado en nanotubos lipídicos y calcular una estructura 3D cercana a la condición fisiológica.Este video es un primer paso hacia una estructura de alta resolución unida a la membrana de una proteína de coagulación, que se puede aplicar a otras proteínas que funcionan en un entorno lipídico.

helical-organization-blood-coagulation-factor-viii-on-lipid

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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Este estudio describe un ensayo en microplaca novela que mide la actividad FV coagulación durante la formación del coágulo de fibrina en el plasma humano que no se ha informado anteriormente. El método utiliza un lector de microplacas cinético para medir continuamente el cambio en la absorbancia a 405 nm durante la formación del coágulo de fibrina en plasma humano.

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Informamos sobre una aplicación inteligente de nanotubos de carbono para la estabilización cinética de partículas lipídicas que contienen nanoestructuras autoensambladas en sus núcleos. La preparación de partículas lipídicas requiere concentraciones bastante bajas de nanotubos de carbono, lo que permite su uso en aplicaciones biomédicas, como la administración de fármacos.

Preparación fácil del ensamblado autónomos Internamente Lípidos Las partículas estabilizadas por nanotubos de carbono

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En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

En este artículo se describe un método para evaluar endotelial von Willebrand factor liberación y la plaqueta posterior capturan bajo tensión de esquileo líquido en respuesta a estímulos inflamatorios mediante un sistema de cámara en vitro flujo.

Investigación de von Willebrand Factor Fisiopatología utilizando un modelo de cámara de flujo de von Willebrand de la plaqueta Factor cadena de formación

Apoyo sólido, libre de proteína, dobles membranas de bicapa de fosfolípidos (DLBM) pueden transformarse en redes de nanotubos de lípidos complejos y dinámicos y pueden servir como modelos 2D de abajo hacia arriba del retículo endoplasmático.

Formación espontánea y cambio de redes de nanotubos lipídica Artificial como un modelo Bottom-Up de retículo endoplasmático

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Fabricación de redes de nanotubos lipídicos multicomponente utilizando el ensayo de motilidad de quinesina deslizante

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In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

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Este trabajo describe un ensayo microfluídico que utiliza el esfuerzo cortante para desencadenar la formación de trombos en sangre y caracteriza el trombo mediante múltiples dimensiones de lectura. El ensayo puede medir la tendencia protrombótica de las muestras de sangre y, por tanto, es útil en el diagnóstico de enfermedades, el descubrimiento de fármacos, así como en estudios mecanicistas básicos relacionados con la trombosis.

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Aprende a determinar la estructura del factor VIII de coagulación organizado helicoidalmente en nanotubos lipídicos mediante microscopía crioelectrónica. Este método combina reconstrucción 3D helicoidal con algoritmos de partículas individuales.

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