Name: En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprende a realizar fraccionamiento de polirribosomas en tejido del SNC in vivo para estudiar el translatoma. Este método permite aislar ARN unido a ribosomas de muestras de cerebro y médula espinal de ratón.

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Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (BMBF), la Biología de Sistemas de Señalización el Cáncer (Helmholtz Alianza en Biología de Sistemas) y el Centro Alemán de Investigación Oncológica (DKFZ).

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales del DKFZ. Precaución: Con el fin de evitar la contaminación de las muestras de la ARNasa, tomar precauciones básicas para evitar la contaminación de RNAsa y preparar todos los tampones con agua tratada con DEPC. 1. Preparación de sacarosa Degradados <ol><li> Preparar 17,5, 25,6, 33,8, 41,9 y 50% de soluciones de sacarosa (ver Tabla 1). Iniciar la preparación de gradientes añadiendo lentamente 2 ml de solución de sacarosa al 50% a la parte inferior de un tubo de ultracentrífuga polialómero. Congelación de la capa mediante la colocación de los tubos durante 20 min a -80 ° C. </li><li> Agregue las capas posteriores a la disminución de los porcentajes de sacarosa con etapas de congelación en el medio, para terminar con un 17,5% de sacarosa. Mantener gradientes en el hielo durante la adición de soluciones de sacarosa con el fin de evitar la descongelación de las capas subyacentes. </li><li> Preparar gradientes de sacarosa recién un día antes de su uso y mantener a 4 ° C. Alternatively, preparar a los gradientes de antemano, almacenar a -80 ° C y descongelación a 4 ° C la noche antes del experimento. </li></ol> 2. Preparación de Tejidos (Cordón y / o cerebro espinal) <ol><li> Se anestesia el ratón por una sobredosis de xilazina y ketamina en NaCl y transcardially perfundir con 20 ml de solución de sales equilibrada de Hank (HBSS) que contenía 200 g / ml de CHX que inmoviliza los ribosomas en transcripciones asociadas. Confirmar anestesia adecuada por la falta de respuesta a pellizcos del dedo del pie. </li><li> Extracto de tejido rápidamente. Abra la parte dorsal del cráneo y extraer el cerebro. Realizar laminectomía de toda la columna torácica y la columna vertebral lumbar y extraer la médula espinal. Utilice todo el cerebro (~ 400 mg) o una pieza de 4 cm de la médula espinal (~ 90 mg), respectivamente. </li><li> Transferir el tejido en hielo frío homogeneización buffer A (ver Tabla 1) (médula espinal: 1 ml; cerebro: 4 ml) y los dados en trozos pequeños con un bisturí limpio para permitir una mayor captación de cicloheximida. Perform todas las medidas adicionales en el hielo. </li><li> Incubar durante 15 min y homogeneizar el tejido mecánicamente usando un homogeneizador Dounce. Homogeneización controlada cuidadosamente es necesario para asegurar que los núcleos permanecen intactos. Trate todas las muestras de la misma manera para asegurar la comparabilidad. Nota: para el tejido cerebral: Disrupt tejido por 5 golpes con una mano de mortero que cierre bien. Para el tejido de la médula espinal: interrumpir por 5 golpes con una mano de mortero queden flojos, seguido de otros 5 golpes con una mano de mortero que cierre bien. </li><li> Tome alícuotas (400 l para el cerebro y 200 l de la médula espinal), la congelación flash y almacenar a -80 ° C para el aislamiento de ARN total. </li><li> Eliminar los núcleos y células ininterrumpido y fragmentos de tejido por centrifugación a 500 xg durante 10 min a 4 ° C. Centrifugación de baja velocidad evita la pérdida de los ribosomas. </li><li> Fragmentos de membrana Lyse en el sobrenadante libre de núcleos durante 30 min mediante la adición de NP-40 y detergentes desoxicolato de sodio (cada uno a una concentración final de 1%). </li></ol><ol><li> Este paso elimina los componentes grasos de la muestra que de otra manera se puede cubrir la señal en el perfil polyribosome. En primer lugar, los cubos de ultracentrífuga pre contra el frío y el rotor a 4 ° C y se preparan 2 M, 1,1 M y 0,9 M soluciones de sacarosa (ver Tabla 1). </li><li> Mezclar con un lisado de 1,22 volúmenes de solución 2 M de sacarosa y transferir a un tubo de ultracentrífuga de polietileno. Rellene todos los tubos de igual volumen de 10 ml con solución de sacarosa 1,1 M, a partir de entonces cubrirás cuidadosamente con solución de sacarosa 0,9 M. </li><li> Coloque los tubos de ultracentrífuga en cubos ultracentrífuga pre-enfriados. Centrifugar durante 3 horas a 100 000 xg a 4 ° C. Durante este proceso los ribosomas depositarse en el sedimento mientras que los componentes grasos flotan y se mantienen en el sobrenadante. </li></ol> 4. Gradiente de sacarosa Fraccionamiento <ol><li> Aspirar el sobrenadante y disolver el pellet en tampón de homogeneización B (véase la Tabla 1 </stRong&gt;). Medir la absorbancia a 260 nm para cada muestra utilizando un Nanodrop o aparato equivalente y normalizar las cantidades de carga de acuerdo con el valor de la absorbancia. </li><li> Coloque gradientes de sacarosa (la preparación se describe en una sección anterior) en los cubos de ultracentrífuga pre-refrigerados. Muestras de capa con cuidado en la parte superior de la pendiente. Añadir un gradiente de sacarosa en blanco como control técnico. </li><li> Ajustar el peso de cada cubo con tampón de homogeneización. Centrifugar las muestras durante 1,5 horas a 285 000 xg a 4 ° C. </li><li> Iniciar la preparación de la Isco fraccionador 30 minutos antes del final de la centrifugación. Si se utiliza otro modelo de fraccionador, siga el protocolo del fabricante. <ol><li> Ajuste la sensibilidad apropiada (0,2 AUFS para el cerebro o 0,05 AUFS de la médula espinal) para la lámpara UV y encenderlo para calentar. Montar el tubo perforador, conéctelo a través de la bomba de rodillo para solución de sacarosa al 60% a través de la perforación del tubo. </li><li> Prueba de la configuración mediante el bombeo de rata sacarosa (flujoe: 1 ml / min), en particular, asegúrese de que no haya fugas en las tuberías que introducir burbujas en el gradiente. </li><li> Blank absorción de fondo bombeando manualmente tampón de gradiente en el detector UV y la corrección de la línea base. </li></ol></li><li> Retire con cuidado los cubos ultracentrífuga contienen los gradientes de sacarosa con muestras sedimentadas desde el rotor y colocarlos en hielo. Evite cualquier golpes de gradientes para evitar la pérdida de resolución. </li><li> Gradientes se ejecutan en el fraccionador. Ejecute gradientes vacías primera para evaluar la absorción de fondo y asegurar la debida configuración técnica adecuada. <ol><li> Adjuntar gradiente para el detector de UV y perforar la parte inferior del tubo con el tubo perforador. Iniciar el bombeo de 60% de sacarosa, que desplazará el gradiente con muestras sedimentadas hacia arriba a través del detector de UV y en el dispensador gota. </li><li> La absorbancia a 260 nm se documenta para generar el perfil de absorción de la muestra, con picos que indican la sedimentaciónción de los ARNm asociados con subunidades ribosomales, monosomas, y posteriormente el aumento de número de ribosomas. </li></ol></li><li> Recoger las muestras en 20 fracciones a través del gotero dispensador (600 l cada uno, en tubos de 2 ml). </li></ol> 5. Aislamiento de ARN a partir de fracciones individuales <ol><li> Añadir 10% de SDS a una concentración final de 1% a las fracciones individuales y mezclar bien con el fin de desplegar proteínas y disociar los ribosomas. En este punto las muestras se pueden congelar a -80 ° C. Dependiendo de la cuestión a tratar, las fracciones se pueden agrupar de acuerdo con el perfil de absorbancia. </li><li> Aislar ARN con extracción con fenol / cloroformo ácido, lo que también elimina contaminantes trazas de ADN. <ol><li> Añadir un volumen de ácido fenol / cloroformo (precalentado a RT) a cada muestra, el calor durante 10 min a 65 ° C y la presión de liberación bajo la campana de humos después. </li><li> Centrifugar las muestras durante 20 minutos a 17.000 xg a temperatura ambiente. Transferir cuidadosamente la fase acuosa a un nuevo 1,5 mltubo. Esté al tanto de la inversión de fases en las fracciones de sacarosa más densas, donde la fase acuosa puede estar en la parte inferior después de la centrifugación. </li><li> Añadir un volumen de isopropanol, 1/9 volumen de acetato de sodio (pH 5,2) y 1 l GlycoBlue a cada muestra con el fin de precipitar el ARN. Mantener las muestras por lo menos 1 hora a -80 ° C. </li><li> Centrifugar durante 30 minutos a 17.000 xg y 4 ° C. GlycoBlue proporciona una visualización de la pastilla. Aspirar el sobrenadante, lavar pellet una vez con helado de 80% de etanol y pellet se seque al aire. Disolver el pellet en RNasa libre de agua. </li></ol></li><li> Cuantificar cantidad de ARN por Nanodrop y analizar la integridad del ARN por un chip Bioanalyzer. ARN que se obtiene mediante el protocolo presentado es adecuado para todo estado de la técnica ensayos de alto rendimiento, incluyendo microarrays y secuenciación de profundidad. </li></ol>

<ol><li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+3%27UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li>
<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
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<li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li>
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<li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li>
<li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Schlaeger, T. 1, (2011).</li>
<li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes%3A+postnatal+development+and+experimental+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T., et al. Isolation of myelin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. Bonifacino, J. S., et al. Chapter 3, (2007).</li>
<li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li>
<li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. a, Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Ningún conflicto de interés declarado.

Aunque polyribosome fraccionamiento no es una nueva técnica, sigue siendo un uno particularmente difícil. Basado en el material de entrada, la optimización sustancial puede ser necesario. Este es especialmente el caso de las muestras in vivo del SNC, donde la cantidad de material es a menudo una limitación y componentes del tejido graso dificultan el aislamiento de ARNm traducción. Protocolos de fraccionamiento mayoría de las publicaciones se ocupan de levadura o líneas celulares de mamíferos, y hay protocolos establecidos para el cerebro 12,13,14. Por el contrario, casi no hay publicaciones que describen el fraccionamiento de la médula espinal, y los protocolos anteriores requieren la médula espinal de un gran número de animales que deben ser agrupados 15. Por estas razones, se hicieron varias modificaciones esenciales para adaptar el protocolo de fraccionamiento para los tejidos del SNC, incluyendo ratón única de la médula espinal. Inmovilización del ribosoma con cicloheximida se lleva a cabo durante la perfusión de los animales para evitar la disociación de los ribosomas During el largo proceso de extracción de tejido. Posteriormente, los ARN polysomal se extraen de una manera específica para maximizar el rendimiento polyribosome. En primer lugar, controlado homogeneización del tejido por douncing, mantiene el núcleo intacto y evita la contaminación de ADN. El núcleo se retira a continuación de forma fiable por centrifugación. La combinación de los detergentes NP-40 y desoxicolato de sodio asegura la lisis del retículo endoplásmico y la liberación de su membrana asociada ribosomas. Además, los componentes de absorción de UV dentro de la mielina rica en lípidos oscurecen los perfiles polyribosome. Por lo tanto, la flotación mielina es necesaria, donde se sedimentan compuestos densos tales como polirribosomas y compuestos más ligeros tales como flotador de mielina y se eliminan 16. Polirribosomas A continuación, se sedimentan sobre un gradiente de sacarosa 17,5% a 50%. En lugar de capas de forma manual y congelación de cada capa de sacarosa, gradientes también se pueden preparar usando un mezclador de gradiente. Extracción de ARN a partir de fracciones usando ácido fenol / cloroformo permite DNA a ser retirado con una pérdida mínima de ARN. Sin embargo, la inversión de fase puede tener lugar en fracciones de sacarosa densos (por encima de la fracción 16). Este protocolo proporciona ventajas sobre otros métodos convencionales que abordan el nivel de la traducción. Por ejemplo, tanto la medición de la S6 fosforilado (un marcador traducción prominente), así como el etiquetado de las cadenas nacientes con radioisótopos dan información sobre los niveles de traducción global, pero revelan muy poco sobre lo que específicamente se está traduciendo. Polyribosome fraccionamiento, por otro lado, permite no sólo la evaluación de la traducción global, pero también de la identidad de los ARNm y la traducción de las proteínas reguladoras relacionadas. PCR cuantitativa en tiempo real se puede realizar en RNAs aislados para una lectura rápida de los ARNm seleccionados y microarrays y la secuenciación de próxima generación de ARN se puede realizar para los estudios amplios del genoma. Las optimizaciones presentados aquí permiten la técnica para ser utilizado con cantidades mínimas de tejidos del SNC, por lo tanto, disminuyeing el número de animales necesarios y mejorar la calidad experimental global al reducir el tiempo de procesamiento de tejido. Por otro lado, esta técnica no puede distinguir estancado ribosomas de traducir queridos. Las transcripciones que llevan estancado ribosomas sedimentarán en las fracciones pesadas, y esto debe ser tenido en cuenta al interpretar los datos. Hay técnicas reportadas recientes, a saber RiboTaq y TRAP, en el que los ribosomas son etiquetados con etiquetas de epítopo o reporteros respectivamente de una manera específica del tipo de célula y los ARNm aislados por inmunoprecipitación 17,18 asociadas. Esta técnica puede ser acoplado a polyribosome fraccionamiento para ofrecer alta resolución leer para poblaciones celulares específicas. Pies de impresión ribosoma es otra novedosa técnica que involucra la digestión nucleasa para generar fragmentos pequeños, o &quot;huellas&quot;, de los ARNm que están protegidos por los ribosomas. Bibliotecas continuación, se generan a partir de estas huellas y secuenciados. Este método provIdes un análisis de todo el genoma-codón específico en la traducción y es capaz de identificar estancado ribosomas, no agosto codones de inicio y pequeños marcos de lectura abierta aguas arriba, que no pueden ser alcanzados por polyribosome fraccionamiento 19. Sin embargo, polyribosome fraccionamiento puede estar acoplado a perfiles de ribosoma para el aislamiento de fragmentos digeridos que contienen ribosomas individuales, enriqueciendo así para las especies moleculares necesarios para la preparación de la biblioteca en la que a menudo se requiere una alta pureza de la muestra. Tomados en conjunto, fraccionamiento polyribosome es un método flexible con significación duradera y se puede acoplar a diferentes aplicaciones posteriores, incluyendo ensayos de genoma de ancho como la secuenciación de próxima generación.

La expresión génica se determina por la acción combinada de la transcripción, la traducción y la estabilidad de ARNm y proteínas, con la traducción teniendo el efecto más predominante 1. Ahora es evidente que cada uno de estos pasos es altamente regulado. Micro-RNAs, formación de gránulos de ARN, alternativa y poliadenilación citoplasmática son algunos ejemplos de la regulación post-transcripcional de la expresión génica 2,3. Cada uno de estos mecanismos desacopla la transcripción de la traducción e influye en el proteoma en el sistema biológico de interés. Por lo tanto, como era de esperar, los niveles de ARNm solos son una lectura imperfecta de los niveles de proteína 4. Proteómica cuantitativa proporciona la evaluación más directa de la expresión de genes, sin embargo a pesar de los avances recientes, aún existen limitaciones considerables en la sensibilidad y la resolución de proteínas secuencia. Por lo tanto frente a la translatome, el repertorio de los ARNm traducción, ofrece un excelente compromiso entre el estudio de latranscriptoma y el proteoma. Es más preciso que transcriptómica en la evaluación de la expresión génica final, y proporciona tanto una mayor cobertura y la resolución de la secuencia de la proteómica. En los sistemas de mamíferos, la mayoría de los eventos a través de la iniciación de traducción comienza cap-dependiente. Un grupo de factores de iniciación eucarióticos junto con el 40S subunidad pequeña ribosomal montar en la tapa 5 &#39;de un ARNm. El complejo luego escanea el ARNm y al llegar al codón de inicio AUG, recluta del 60S subunidad ribosomal grande para formar un completo 80S ribosoma. La etapa de elongación procede con el ribosoma se mueve a lo largo del ARNm, con factores de elongación ayudar a la incorporación de aminoácidos de ARNt cargados a la cadena de péptido naciente. Múltiples ribosomas pueden proceder a lo largo de un único ARNm simultáneamente y el número de ribosomas asociados se ha demostrado que se correlaciona con la tasa de síntesis de proteínas 5,6. Esto hace ribosomal carga una indicación fiable para translation y permite la separación de la traducción de ARNm activamente sobre la base de la velocidad de sedimentación. Además de la cuantificación de la traducción de ARNm, información de la secuencia se puede obtener para identificar los motivos implicados en la regulación de la traducción. También ARN proteínas de unión y otros factores de traducción se pueden aislar de diferentes fracciones, facilitar el estudio y descubrimiento de proteínas reguladoras relacionadas. En el sistema nervioso, control de la traducción se ha relacionado con procesos tales como ARNm de almacenamiento, el transporte y la síntesis proteica local. Los conos de crecimiento se ha demostrado que albergar una piscina localizada específica de los ARNm distintos del resto del axón 7. Además, los axones poseen la capacidad de sintetizar proteínas localmente 8,9. Como resultado, el control local de la traducción se ha convertido en un tema crucial de estudio en la neurobiología. El potencial de fraccionamiento polyribosome para abordar este ha sido ilustrada en varios estudios, en los que se utilizó la técnica deinvestigar axón orientación en el desarrollo de la médula espinal, y demostró la traducción dependiente de la actividad de BDNF en el cerebro 10,11.

<table><tbody><tr><td>Hank' s solución de sales equilibradas</td><td>Gibco</td><td>14170-138</td><td></td></tr><tr><td>Tubo, Pared fina, Polialómero, 14 ml, 14 x 95 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>precaución</td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma</td><td>C7698</td><td>peligro</td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>advertencia</td></tr> Cóctel completo de <tr><td>inhibidores de proteasa comprimidos Roche</td><td></td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>solución de fluoruro de fenilmetanosulfonilo</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>peligro</td></tr><tr><td>RNasin Plus Inhibidor de la RNasa</td><td>Promega</td><td>N2611</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Roche peligro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11332473001 Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>advertencia</td></tr><tr><td>Ácido-fenol:Cloroformo, pH 4.5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Peligro Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Molinillo, 1 ml/7 ml</td><td>Wheaton</td><td>357538/357542</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 40 Ti Rotor, Cubo Oscilante, Titanio, 6 x 14 ml, 40.000 rpm, 285.000 x &nbsp; g</td><td>Beckman Coulter</td><td>331302</td><td></td></tr><tr><td>Fraccionador de gradiente de densidad</td><td>Teledyne Isco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizador</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

en interrogatorio vivo del sistema nervioso central translatome por polyribosome fraccionamiento

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Varios procesos están implicados en la expresión génica, incluyendo la transcripción, la traducción y la estabilidad de los ARNm y proteínas. Cada uno de estos pasos están fuertemente regulados, lo que afecta la dinámica finales de la abundancia de proteínas. Existen diversos mecanismos de regulación en el paso de traducción, lo que hace los niveles de mRNA solo un indicador fiable de la expresión génica. Además, la regulación local de la traducción del ARNm se ha visto especialmente implicado en las funciones neuronales, cambiando &#39;translatomics&#39; para el centro de atención en la neurobiología. El método presentado puede utilizarse para transcriptómica puente y la proteómica. Aquí se describe modificaciones esenciales a la técnica de fraccionamiento polyribosome, que interroga la translatome basado en la asociación de mRNAs traducidos activamente a múltiples ribosomas y su sedimentación diferencial en gradientes de sacarosa. Tradicionalmente, se trabaja con muestras in vivo, en particular de la Central sistema nervioso (CNS), ha demostrado ser un desafío debido a las cantidades limitadas de material y la presencia de los componentes del tejido graso. Para hacer frente a esto, el protocolo descrito se ha optimizado específicamente para su uso con la cantidad mínima de material del SNC, como se demuestra por el uso de ratón única de la médula espinal y el cerebro. Brevemente, los tejidos del SNC se extraen y la traducción de los ribosomas se inmovilizan en los ARNm con cicloheximida. A continuación se realiza la flotación mielina para eliminar los componentes ricas en lípidos. El fraccionamiento se realiza en un gradiente de sacarosa en donde los ARNm se separan de acuerdo con su carga ribosómico. Fracciones aisladas son adecuados para una amplia gama de ensayos de aguas abajo, incluyendo las nuevas tecnologías de ensayo del genoma de ancho.

La Figura 2 muestra los perfiles representativos polyribosome después del fraccionamiento. Los perfiles de cerebro y la médula espinal muestran curvas de absorción características como se ha descrito antes para las líneas celulares. los ARNm unidos a pequeñas subunidades ribosomales (40S) de sedimentos en fracciones más ligeras y aparecen primero como un pico en el perfil, seguido de la subunidad ribosómica grande (60S) y (80S) monosome mRNAs obligado. mRNAs obligado a múltiples ribosomas sedimentos en fracciones más pesadas, con los picos posteriores que indica el aumento de número de ribosomas unidos. Traducción global puede ser evaluada a partir del perfil. Como un ejemplo, el tejido cerebral tiene un polyribosome superior a monosome relación de que el tejido de la médula espinal, lo que indica la traducción más activo. ARN extraído a partir de fracciones individuales se evaluaron por Bioanalyzer, que muestra la distribución de 18S y 28S rRNA. 18S ARNr aparece anteriormente en el perfil, de conformidad con las pequeñas subunidades ribosómicas sedimentación en sucr más ligero<html> fracciones ose. Los rendimientos típicos de ARN total son 10 a 20 g para el cerebro y 2-4 mg de la médula espinal. Los rendimientos de ARN de fracciones individuales son de hasta 4 mg y 0,8 mg para el cerebro y la médula espinal, respectivamente, dependiendo de la fracción. Un gradiente de sacarosa en blanco ya muestra algunas absorción de fondo a 260 nm, debido a la presencia de la TDT. Este fondo se puede restar durante el análisis de datos con el fin de normalizar los valores de muestra. Tratamiento con EDTA se derrumbó los picos polyribosome, lo que demuestra el perfil de sedimentación se debe a la traducción. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Flujo de trabajo y las aplicaciones potenciales de in vivo fraccionamiento polyribosome.&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Perfiles de la Figura 2. (A) polyribosome perfiles típicos de cerebro y la médula espinal, con la evaluación de ARN extraído por Bioanalyzer. (B) Distribución de GAPDH mRNA sobre fracciones mediante QRT-PCR. (C) polyribosome de gradiente de vacío y el cerebro con y sin tratamiento con EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> Búfer gradiente 2x </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 30 mM MgCl 2, NaCl 600 mM, 200 g / ml de cicloheximida (CHX), ditiotreitol 2 mM (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 17,5% </td><td> 8,67 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 25,6% </td><td> 12,8 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 33,8% </td><td> 16,9 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 41,9% </td><td> 20,95 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> solución de sacarosa al 50% </td><td> 25 g de sacarosa, 25 ml de 2x tampón de gradiente, hasta 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homogeneizacióntampón A </td><td> 0,25 M de sacarosa, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4), 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 200 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM (PMSF), 100 U / ml de ARNsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> Solución de sacarosa 2M </td><td> 68,4% de sacarosa, Tris-HCl 50, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 100 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M solución de sacarosa </td><td> 38,5% de sacarosa, Tris-HCl 50, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 100 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0,9 M solución de sacarosa </td><td> 30,8% de sacarosa, Tris-HCl 50, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl </td><td> 100 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampón B </td><td> 0,25 M de sacarosa, 50 mM Tris / HCl, pH 7,4, 5 mM de MgCl 2, 25 mM de KCl, 1% de NP-40, 1% de desoxicolato de sodio </td><td> 200 g / ml de CHX, 1x Roche inhibidor de la proteasa completo, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 100 U / ml de ARNsin </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Lista de los tampones y soluciones.

Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los ARNm en proceso de traducción en tejido primario del SNC. El protocolo comienza con la extracción de los tejidos relevantes del ratón en cicloheximida. A continuación, se realiza la homogenización mecánica y la lisis en detergente.A continuación se realiza la flotación de mielina, que elimina los componentes lipídicos grasos de los tejidos que enmascararían los perfiles de polirribosomas. El precipitado, que contiene ribosomas y ARNm asociados, se sedimenta en un gradiente de sacarosa para separar el ARNm asociado con ribosomas. Luego, el gradiente se fracciona para obtener un perfil de polirribosomas, en el que cada pico representa ARNm asociado con un número determinado de ribosomas o subunidades ribosomales.Luego se purifican las fracciones que contienen polirribosomas obteniendo ARN para aplicaciones posteriores. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite trabajar con pequeñas cantidades de tejido del SNC y es versátil en sus aplicaciones posteriores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la traducción en el sistema nervioso, como los cambios en los niveles de traducción bajo diferentes condiciones, y el papel de la traducción, los factores reguladores y los motivos de secuencia.En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los materiales del SNC in vivo suelen ser limitados, y los componentes atípicos presentes en el tejido pueden enmascarar los perfiles de polirribosomas. Para un ratón que fue perfundido transcardialmente con HBSS, con cyclo Heide, inicie rápidamente la extracción del tejido. Abra dorsalmente el cráneo y retire el cerebro. Transfiera el cerebro a tampón A frío con hielo y pique directamente el tejido cerebral.A continuación, realice una laminectomía de la columna vertebral torácica y lumbar. Retire cuatro centímetros de médula espinal y transfiera a tampón A frío sobre hielo. Pique los tejidos por separado para aumentar su absorción de cicloheida y luego incube sobre hielo durante 15 minutos.A continuación, desintegre los tejidos con el homogenizador descendente para asegurar que los núcleos permanezcan intactos. El tejido cerebral requiere cinco movimientos con un pistilo ajustado; transfiera el tejido filtrado a tubos. El tejido de la médula espinal requiere cinco movimientos con un pistilo suelto y luego otros cinco movimientos con un pistilo ajustado.Ahora recolecte alícuotas para el aislamiento de ARN total: 200 microlitros de médula espinal y 400 microlitros de encéfalo flash. Cóngélelos y almacénelos a menos 80 grados Celsius. Para eliminar los núcleos, células no rotas y fragmentos de tejido, centrifugue los tejidos a 500 G durante 10 minutos.Recolecte el sobrenadante que contiene el retículo endoplasmatico con sus ribosomas unidos, y deseche el precipitado que contiene los núcleos. A continuación, lice los fragmentos de membrana del retículo endoplasmatico para liberar los ribosomas agregando detergentes NP-40 y desoxicolato de sodio hasta alcanzar una concentración final de 1%. Permita que las muestras se incuben durante 30 minutos en hielo. Uno de los desafíos al trabajar con tejidos del sistema nervioso es que la mielina y otros componentes ricos en lípidos interfieren con los perfiles de polisomas maestros.Para abordar este problema, es necesario introducir el proceso de modelado de la flotación para eliminar estos componentes antes de comenzar. Enfríe previamente los cubos y el rotor del ultracentrífugo a cuatro grados Celsius. A continuación, mezcle los lisados recolectados con 1,22 volúmenes de sacarosa dos molar.Transfiera cada mezcla a un tubo de ultracentrífuga de polietileno y llene los tubos hasta 10 mililitros con sacarosa 1,1 molar. Luego, superponga cuidadosamente los tubos con sacarosa 0,9 molar. Ahora transfiera los tubos a los cubos refrigerados y equilíbrelos con tampón B. Coloque los cubos equilibrados en el rotor refrigerado y haga funcionar la centrífuga a 100.000 G durante tres horas a cuatro grados Celsius; los ribosomas y los ARN se sedimentarán como un precipitado bajo los lípidos suspendidos.Después de la centrifugación de flotación de mielina, retire el sobrenadante y disuelva los pellet con ribosomas en el tampón B. Luego mida la absorbancia de las soluciones de ribosomas a 260 nanómetros utilizando un equipo NanoDrop. Estime las concentraciones totales de ARN con estos valores. Ahora transfiera las muestras a gradientes de sacarosa preparados.Tenga cuidado de no alterar los gradientes e incluya un gradiente vacío como control. Equilibre los cubos fríos con las muestras como antes. Luego, haga funcionar la centrífuga a 285.000 Gs durante una hora y media a cuatro grados Celsius.Mientras la centrífuga está girando, prepare el fraccionador. Primero, ajuste la sensibilidad de la lámpara UV. A continuación, fije el perforador de tubos al fraccionador y conéctelo mediante un tubo a una botella de sacarosa al 60%.Con una bomba peristáltica intermedia, comience a bombear la sacarosa hacia el fraccionador a un mililitro por minuto. Verifique la presencia de fugas de aire que introduzcan burbujas y apriete esos sellos. Luego, bombee manualmente el tampón del gradiente hacia el detector de UV para establecer la línea base.Después de retirar cuidadosamente las muestras del ultracentrífugo sin provocar impactos y colocarlas en el fraccionador, perfore la parte inferior del tubo con el perforador. Comience a bombear la solución de sacarosa al 60 % para desplazar el gradiente más allá del detector de UV y hacia el dispensador de gotas. Registre el perfil de absorbancia a 260 nanómetros.Recoger 20 fracciones del dispensador de gotas en tubos de dos mililitros. Recoger 600 microlitros por fracción y proceder a procesar los gradientes de muestra en cada fracción al 10% de SDS hasta una concentración final de 1% de SDS y mezclar bien. Ahora, aislar el ARN utilizando una extracción ácida con fenol-cloroformo.Comience añadiendo un volumen de fenil cloroformo ácido a temperatura ambiente, y luego caliente los tubos a 65 grados durante 10 minutos. Abra cuidadosamente los frascos en una campana extractora después del calentamiento para liberar la presión. A continuación, centrifugue las fracciones a 17.000 ×g durante 20 minutos a temperatura ambiente y recoja la fase acuosa, que puede estar por encima o por debajo de la sacarosa.A continuación, agregue un volumen de isopropanol, un noveno de volumen de acetato de sodio y un microlitro de azul de glicoproteína. Precipite el ARN durante al menos una hora a menos 80 grados y luego péletelo por centrifugación. Luego, lave los pellets una vez con etanol al 80 % enfriado y, tras volver a pelotar el ARN, seque los pellets al aire, resuspenda en agua y continúe con el análisis posterior.Alternativamente, las muestras pueden almacenarse a menos 80 grados hasta su uso. Un gradiente de sacarosa en blanco muestra una absorción de fondo a 260 nanómetros debido a la presencia de DTT. Este fondo puede restarse durante el análisis de datos para normalizar los valores de la muestra; los perfiles de cerebro y médula espinal, el ARN muestran curvas de absorción características, los ARNm unidos a subunidades ribosomales pequeñas sedimentan en fracciones más ligeras que aparecen al principio del perfil.A continuación, siguen la subunidad ribosomal grande y los ARNm con un solo ribosoma unido; los ARNm unidos a múltiples ribosomas sedimentan en fracciones posteriores. El tratamiento de las muestras con EDTA colapsó los picos de polirribosomas, lo que demuestra que el perfil de sedimentación se debió a la traducción. Métodos adicionales como Ribot-attack y trap pueden acoplarse a esta técnica para realizar estudios específicos de tipo celular sobre la traducción.Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploraran el papel de la regulación de la traducción en el desarrollo neuronal y las enfermedades. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la fraccionamiento de polisomas a partir de pequeñas cantidades de tejido del SNC y purificar el ARN para aplicaciones posteriores de su elección.

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