Demostración de un resistente a múltiples fármacos Mycobacterium tuberculosis Microarray Amplificación
25 de abril de 2014
Un microarray de la amplificación de PCR asimétrica combina la amplificación y la hibridación de microarrays en una sola cámara, lo que simplifica significativamente microarrays de flujo de trabajo para el usuario final. La simplificación de los microarrays de flujo de trabajo es un primer paso necesario para la creación de diagnósticos basados en microarrays que se pueden utilizar de forma rutinaria en los entornos más bajos recursos.
El objetivo general del siguiente experimento es genotipar microbacteria tuberculosis multirresistente, utilizando un microarray de amplificación. Esto se logra mediante la realización de una PCR asimétrica múltiplex sobre la parte superior de un microarray dentro de una sola cámara de reacción microfluídica. Allí, la muestra se amplifica simultáneamente, se selecciona el tamaño marcado, se hace monocatenario y se hibrida con el microarray.
A continuación, después de lavar el microarray, un lector muestra si la microbacteria tuberculosis está presente y si contiene una mutación en el ADN que se sabe que confiere resistencia a la rifampicina iso, el niazi etambutol o la estreptomicina. La ventaja de este método sobre los métodos existentes de sonda de línea de microarrays o de hibridación de ácidos nucleicos es que un microarray de amplificación simplifica significativamente la interacción del usuario con la prueba. Aun así, al mismo tiempo que proporciona la sensibilidad analítica de la PCR y la capacidad de multiplexación de un microarray Para este procedimiento, tenga un espacio de trabajo limpio limpiado con una solución descontaminante y tenga ácidos nucleicos lo suficientemente puros para la PCR multiplex.
Después de descongelar y mezclar todas las soluciones madre, ensamble la mezcla maestra de PCR. Al preparar esta mezcla, prepare al menos un volumen adicional de mezcla para la prueba de tuberculosis que se muestra aquí. Además, agregue T polimerasa adicional a la mezcla maestra.
Además de la cantidad de pegajosidad proporcionada con los reactivos culata, mezcle una alícuota de microlitros de ADN de muestra por 49 microlitros de mezcla maestra. Agregue con cuidado 48 microlitros de cada mezcla de reacción al centro del microarray apropiado. No toque el microarray en sí.
A continuación, cubra y selle con cuidado el microarray de forma incorrecta. La aplicación del cubreobjetos puede introducir burbujas que pueden provocar artefactos, evaporación, amplificación deficiente o hibridación no uniforme. Cualquiera de estas condiciones puede conducir a un resultado erróneo.
A continuación, cargue la microrvelocidad en el termociclador. Con los sustratos contra el bloque de calor, la opción de tapa calefactada debe estar desactivada. Para los laboratorios que siguen las precauciones universales de PCR, es más eficiente incluir varios microarrays de amplificación por portaobjetos y procesar varias pruebas simultáneamente.
Ahora, ejecute el programa de ciclo térmico adecuado. Este programa tiene 50 ciclos de amplificación, que pueden parecer altos, pero necesarios debido a la población predominantemente de amplicones monocatenarios creados por la reacción. Cuando se complete la reacción, retire los microconjuntos y apague el termociclador.
Abra cuidadosamente la cámara del microarray con una tapa y unas pinzas. Retire el deslizamiento, la tapa y la junta. El microarray puede dañarse por este paso, así que tenga cuidado incorrectamente.
La extracción del conjunto de la junta puede provocar daños físicos en el microarray. Tenga cuidado de no doblar o flexionar el cubreobjetos y tenga mucho cuidado de evitar rayar la superficie del microarray con las pinzas, Ahora transfiera los sustratos del microarray a un portaobjetos de histología. Bañar los sustratos en el tampón de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave, seguir el baño de solución de lavado con dos o tres lavados más, todo en agua desionizada.
Seque los microarrays antes de proceder a la toma de imágenes. Para ello se puede utilizar un suave chorro de aire comprimido para este fin, los parámetros son específicos de la prueba MDR TB y de un generador de imágenes portátil de campo Econ DX 2100. Una luz azul en el generador de imágenes indica que está listo.
Encienda la computadora. Abra el software del sistema proporcionado por un conni y espere a que el software anuncie que ha establecido una conexión con la cámara. A continuación, inserte el microarray seco en el generador de imágenes.
Con el microarray hacia la lente y lejos del usuario. El software ahora proporcionará una imagen de vista previa desde el menú desplegable. Seleccione el script de análisis MDR TB.
Introduzca un tiempo de exposición entre 100 y 500 milisegundos. Se leerán los píxeles sobreexpuestos. Ajusta la exposición para minimizarlos.
Cuando la saturación esté configurada para minimizar la sobreexposición, inicie el análisis. El software coloca una cuadrícula de tuberculosis MDRT en las puntuaciones de las imágenes, las muestras y las intensidades de fondo, y luego informa sobre los resultados de la resistencia a los medicamentos y el genotipado. Una vez que el análisis se haya completado y guardado, retire el chip del generador de imágenes e inicie una nueva sesión de análisis para analizar la siguiente matriz.
Continúe el análisis para cada uno de los microarrays procesados. Guardar los datos cada vez. El análisis cualitativo de imágenes puede proporcionar información sobre las fuentes de ruido experimental o variabilidad que es difícil de identificar en las tablas de datos generadas por el software de análisis de imágenes automatizado.
Aquí se ve una matriz de alta calidad que carece de artefactos. Varios artefactos pueden llevar a la introducción de burbujas que crean halos. A pesar de los artefactos de la matriz, el software aún recuperará valores de ser escaneados.
Un algoritmo de informes de diagnóstico, a pesar de obtener valores, reconocería esta matriz como no válida. Se utilizó una serie de dilución de ADN genómico H 37 RA de tipo salvaje en una plantilla de PCR de microarrays a 6,25 picogramos, el equivalente a 1.250 células. Se detectaron todas las sondas.
Un valor de SNR por encima de tres es un resultado positivo, y los valores registrados fueron mucho más altos. A continuación, se genotiparon los aislados de referencia de la Organización Mundial de la Salud. Los polimorfismos de un solo nucleótido presentes en la matriz se detectaron como la mutación correspondiente en el genoma de la tuberculosis MDR.
También se evidenciaron varios ejemplos de detección de mutaciones de vecinos cercanos. En el protocolo de texto se proporciona una discusión. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en unas tres horas y media a seis horas y media, dependiendo de la concentración de ADN, el ensayo específico, la eficiencia y uniformidad del termociclador, y la sensibilidad y especificidad analítica o clínica deseadas.
Además, el número de ciclos de amplificación y los tiempos de hibridación posteriores a la amplificación se pueden acortar o alargar fácilmente para obtener las características de rendimiento deseadas.
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Resumen
Este estudio presenta un nuevo método de microarreglo con amplificación para la genotipificación de Mycobacterium tuberculosis multirresistente. Al integrar la amplificación mediante PCR asimétrica y la hibridación en microarreglo en una sola cámara, se simplifica significativamente el flujo de trabajo, lo que lo hace adecuado para entornos con recursos limitados.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Genética
- Diagnóstico
Antecedentes
- El microbacterium tuberculosis resistente a múltiples fármacos representa un desafío importante para la salud pública.
- Los métodos tradicionales de detección pueden ser complejos y requerir muchos recursos.
- Existe una necesidad de métodos diagnósticos simplificados en entornos con pocos recursos.
- Este estudio explora un nuevo enfoque mediante el uso de microarreglos de amplificación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la genotipificación de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiples fármacos.
- Simplificar la interacción del usuario con la prueba diagnóstica.
- Combinar los procesos de amplificación e hibridación en una única reacción microfluídica.
Métodos Utilizados
- PCR asimétrica multiplex realizada sobre un microarreglo.
- Amplificación, marcado, selección de tamaño e hibridación simultáneos.
- Lavado del microarreglo tras la hibridación.
- Uso de un lector para detectar la presencia de Mycobacterium tuberculosis y mutaciones asociadas.
Resultados Principales
- El método de microarreglo de amplificación simplifica el proceso diagnóstico.
- Mantiene la sensibilidad analítica de la PCR.
- Permite una capacidad de multiplexado similar a la de los microarreglos tradicionales.
- Los resultados indican una detección eficaz de mutaciones de resistencia a fármacos.
Conclusiones
- El microarreglo de amplificación es una herramienta prometedora para el diagnóstico de la tuberculosis.
- Este método podría mejorar las capacidades de prueba en entornos con recursos limitados.
- Se requieren más validación y optimización para su uso generalizado.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de microarreglo de amplificación agiliza la genotipificación de TB-MDR mediante la integración de PCR asimétrica, etiquetado e hibridación en una única cámara microfluídica, lo que reduce los pasos manuales y permite su implementación en entornos con recursos limitados. El enfoque mantiene la sensibilidad a nivel de PCR mientras permite la detección multiplex de mutaciones que confieren resistencia, ofreciendo una vía hacia diagnósticos simplificados y escalables para la vigilancia de enfermedades infecciosas. Al minimizar la intervención del usuario y el tiempo de procesamiento, aborda brechas críticas en los flujos de trabajo de microbiología traslacional donde la rapidez, la reproducibilidad y la baja dependencia de infraestructura son esenciales para la validación temprana de dianas y el desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar dianas genéticas asociadas con mecanismos de resistencia a fármacos en Mycobacterium tuberculosis.
- Valor operativo: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la detección multiplex de SNP en una sola reacción, reduciendo la variabilidad derivada de la división de muestras.
- Valor traslacional: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar mutaciones que confieren resistencia, ayudando a reducir los riesgos mecanicistas en programas de dianas antiinfecciosas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera señales de hibridación cuantitativas que se correlacionan con variantes alélicos, permitiendo la discriminación específica de alelos.
- Valor operativo: Combina la amplificación y la detección en un sistema cerrado, minimizando el riesgo de contaminación y mejorando la reproducibilidad entre lotes.
- Preparación del ensayo: Utiliza una mezcla maestra asimétrica de 9 plex compatible con matrices de baja densidad, demostrando una multiplexión escalable para paneles de genotipado de patógenos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Genotipifica directamente cepas de TB-MDR utilizando aislamientos de referencia de la OMS, asegurando la relevancia clínica de las mutaciones detectadas.
- Confianza predictiva: Alcanza una relación señal-ruido >3 como umbral de positividad, proporcionando un punto de referencia cuantitativo para la evaluación del rendimiento del ensayo.
- Continuidad del flujo de trabajo: Genera resultados de genotipificación compatibles con algoritmos posteriores de interpretación de resistencia, facilitando la alineación de biomarcadores traslacionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo desde el descubrimiento temprano hasta la etapa preclínica al proporcionar un resultado rápido de genotipificación en un sistema cerrado que orienta las decisiones de validación del blanco y optimización del fármaco líder en programas antiinfecciosos.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la interrogación a nivel de vías de mecanismos de resistencia mediante la detección de múltiples mutaciones en genes como rpoB, katG y embB.
- Tamizaje: Permite el perfilado de cepas de alto rendimiento con un tiempo mínimo de manipulación manual, apoyando el tamizaje de aislamientos clínicos o bibliotecas mutagénicas.
- Análisis: Proporciona lecturas de fluorescencia multiplexadas que cuantifican la eficiencia de hibridación, permitiendo la comparación de la abundancia de alelos mutantes entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Utiliza entradas de ADN clínicamente relevantes (tan bajas como 1.000 equivalentes celulares), conectando pruebas con muestras sintéticas y derivadas de pacientes.
- Reutilización Empresarial: El formato de microarreglo con amplificación microfluídica es adaptable a otros paneles de patógenos, promoviendo la reutilización de la plataforma en diferentes objetivos de enfermedades infecciosas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la genotipificación de resistencia al permitir la detección simultánea y múltiple de mutaciones.
- Valor operativo: Elimina los pasos separados de amplificación e hibridación, lo que disminuye el tiempo de manipulación manual y la variabilidad técnica.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más rápidas de avance o interrupción en la validación de dianas, al entregar perfiles de resistencia en 6,5 horas.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de compuestos dirigidos contra cepas resistentes mediante una genotipificación fiable de aislamientos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de microfluidos y en la optimización de la PCR asimétrica para mantener la uniformidad de la amplificación.
- Depende de termocicladores con ajustes de tapa regulables e imágenes de fluorescencia compatibles para la detección del punto final.
- Necesita protocolos de lavado estandarizados para prevenir la contaminación cruzada entre corridas en modos de procesamiento por lotes.
- Debe tener en cuenta los límites de compatibilidad de los cebadores en mezclas maestras multiplex, ya que el grado de multiplexación está restringido por la compatibilidad de los pares de cebadores, no por la densidad de sondas.
- El rendimiento es sensible a la calidad y concentración del ADN de entrada, lo que requiere un control de calidad del material genómico antes de la amplificación.
