Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de las espinas dendríticas en súper resolución. Esto se logra preparando primero un hipocampo primario de rata, el segundo paso es visualizar las espinas dendríticas mediante transfección y tinción de GFP. A continuación, la adquisición de espinas dendríticas marcadas con GFP se lleva a cabo en superresolución utilizando un microscopio SIM.

El paso final es reconstruir los datos de la imagen sin procesar en 3D, listos para el análisis posterior de la imagen. En última instancia, la GFP que expresa neuronas primarias del hipocampo obstruidas en súper resolución se utiliza para mostrar cambios sutiles en la morfología de la espina dendrítica. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la microscopía confocal convencional, es que permite estudiar con más detalle la morfología de la espina dendrítica.

Este método puede ayudar a examinar cuestiones clave en curso en neurociencia, como las alteraciones moleculares y farmacológicas dependientes en forma de espinas dendríticas. La microscopía de eliminación estructurada se basa en la proyección de patrones de líneas en la muestra, y esto proporciona información adicional que puede ser extraída por un programa informático y proporciona imágenes extra nítidas y que le permite observar las mitocondrias MI y otras estructuras pequeñas en la célula. Una demostración visual de este método es importante para lograr una reconstrucción válida de una imagen SIM, es crucial seguir los pasos que le brindan una buena calidad de los datos sin procesar.

Un paso preparatorio importante consiste en recubrir los cubreobjetos, trabajando en una campana laminar estéril. Use pinzas estériles pequeñas para colocar los cubreobjetos individuales en pocillos individuales de una placa de 12 pocillos. Luego agregue 500 microlitros de solución de polilisina a cada pocillo para sumergir los cubreobjetos.

Después de lavar los pocillos, agregue un mililitro de medio de siembra y deje los cubreobjetos en la incubadora de cultivo de tejidos hasta 24 horas antes de sembrar las celdas. El procedimiento será demostrado por HU es SH, un estudiante de doctorado en nuestro grupo. Después de aislar el embrión de rata, use pinzas finas para extraer y desechar el cerebelo del cerebro.

Separe los dos hemisferios haciendo un corte sagital a lo largo de la línea media bajo un microscopio de disección, use un par de pinzas pequeñas para sostener suavemente el mesencéfalo y extraer el mesencéfalo. Con otro par de pinzas, deje intacto el resto del hemisferio que contiene la corteza y el hipocampo. A continuación, retire con cuidado las meninges, reoriente el tejido para que el hipocampo quede hacia arriba.

El hipocampo se puede identificar por su característica estructura en forma de CS. Con pinzas finas, disecciona el hipocampo y colócalo en un nuevo plato de 30 milímetros que contenga un X-H-B-S-S fresco y frío. Después de quitar los campamentos de hipopótamo de todos los embriones, cuente el número total de campamentos de hipopótamo y luego córtelos en trozos pequeños.

Recoja las piezas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros que contenga tres mililitros de un X-H-B-S-S. Después de centrifugar y eliminar el sobrenadante, agregue seis microlitros de tripsina por hipocampo. Después de incubar y lavar los fragmentos del hipocampo como se describe en el protocolo de texto, tatea lentamente los fragmentos 30 veces con una pipeta de pastor pulida al fuego hasta que todas las piezas de tejido se dispersen homogéneamente en células individuales.

Tenga cuidado de evitar cualquier burbuja. A continuación, agregue cinco mililitros de medio de recubrimiento, previamente advertido a 37 grados centígrados. Después de contar las células usando una semilla de tinción vital de azul triano, 50, 000 células por pocillo de una placa de 12 pocillos en un mililitro de medio de siembra para un volumen total de dos mililitros.

Después de mecer la placa para distribuir las células de manera uniforme, incube las células a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Después de dos o tres días, reemplace 0,5 mililitros del medio de siembra con un medio de cultivo que contenga 10 micromolares FUDR. Para transfectar, las neuronas añaden una lipectomía.

Mezcle gota a gota con una mezcla de ADN e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. En una campana de flujo laminar, 10 minutos antes del final de la mezcla de lipectomía de ADN de 30 minutos, incubación, pipetear el medio acondicionado desde la placa de cultivo original o primera hasta una segunda 12. Coloque y almacene esta placa a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono en la primera placa de cultivo.

Reemplazó rápidamente el medio acondicionado con un mililitro de medio de incubación precalentado para evitar que las células se sequen. Vuelva a colocar ambas placas en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Al final de la incubación de la lipectomía de ADN de 30 minutos, la mezcla de lipectomía de ADN está lista para ser añadida a las células.

Agregue suavemente 200 microlitros de la mezcla de lipectomía de ADN a cada pocillo e incube durante 45 minutos a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación de 45 minutos, use pinzas pequeñas para levantar los cubreobjetos que sostienen las neuronas. Enjuáguelos sumergiéndolos en un plato de tres centímetros que contenga medio neurobasal fresco y tibio y colóquelos en un pozo.

En el segundo 12, placa de pocillo que contiene el medio condicionado. A continuación, incubar las neuronas transfectadas a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Para prepararse para la inmunotinción, aspire suavemente el medio de los pocillos que contienen los cubreobjetos.

Luego agregue 500 microlitros de PFA 4% tibio con cuidado para evitar dañar las dendritas. Después de incubar y lavar el bloque de células con una solución de T-B-S-B-S-A al 1% a temperatura ambiente durante 30 minutos después de lavar nuevamente, agregue el anticuerpo primario diluido en la incubación, mezcle e incube a temperatura ambiente durante una hora. Luego incubar durante la noche a cuatro grados centígrados con una suave agitación.

A la mañana siguiente, retire el anticuerpo primario y vuelva a lavar a partir de aquí, mantenga los cubreobjetos protegidos de la luz. A continuación, agregue el anticuerpo conjugado fluorescente secundario diluido en la incubación. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.

A continuación, retire el anticuerpo secundario y lave las células con pinzas finas. Retire los cubreobjetos de los pocillos y seque el exceso de TBS con un pañuelo de papel. Finalmente, monte los cubreobjetos con un medio de montaje y selle con esmalte de uñas.

Para comenzar la creación de imágenes SIM, encienda el láser de 488 nanómetros, la lámpara de mercurio, el controlador de escenario, el controlador pizo y la lámpara halógena para la luz transmitida. Inicie el software SIM en el modo y o para nsim. Después de poner una gota de aceite de inmersión en el objetivo, verifique que no haya burbujas de aire en la gota de aceite.

Coloque el cubreobjetos con las neuronas del hipocampo en la platina del microscopio. Mueva el objetivo hacia arriba hasta que el aceite toque la muestra. Recuerde colocar una cubierta sobre la platina durante el procedimiento de adquisición para proteger la muestra de la luz ambiental y atenuar la luz de la habitación tanto como sea posible.

En el software SIM, seleccione la configuración óptica IFI y seleccione un bloque de filtro vacío entre uno para la inspección visual con el enfoque de muestra de configuración de luz blanca. A continuación, apague la luz blanca y encienda la lámpara de mercurio. Abra el obturador y seleccione el filtro verde para buscar una dendrita suficientemente brillante.

Al encontrar una dendrita de interés suficientemente brillante y centrar un segmento de interés en el campo de visión, cierre el obturador. Configure el software en la configuración óptica 3D SIM 4 88 y la configuración de la cámara de la siguiente manera. Establezca el modo de lectura en em.

Gana un megahercio de 16 bits. Ajusta el tiempo de exposición a 100 milisegundos. Ajuste la potencia del láser a 5%Establezca la ganancia EM en 200.

Con la velocidad de enfoque ajustada a extra fina, concéntrese en el objeto de interés. Ajuste rápidamente la configuración de la cámara de la siguiente manera. Para obtener un valor de intensidad entre 30, 040 5, 000, configure la potencia del láser entre 0% y 20%Establezca el tiempo de exposición entre 50 milisegundos y dos segundos.

Establezca el modo de lectura en em. Gana un megahercio de 16 bits. Ajuste la ganancia EM de cero a 300.

Establezca la ganancia de conversión en una x a 5.1 x. Establezca el formato para live en no Benning. Establezca el formato de captura en no Benning.

A continuación, configure los ajustes de la pila de tres DZ en el panel de secuencia ND de la siguiente manera, establezca el rango en dos micras. Establezca el tamaño del paso en 120 nanómetros y haga clic en la posición de inicio. A continuación, seleccione la configuración óptica, 3D SIM 4 88 en la sección lambda.

Después de seleccionar 3D SIM como modo de adquisición, ejecute la adquisición de secuencia ND y guarde los datos sin procesar Las dendritas y las espinas dendríticas obstruidas con microscopía confocal y sim se muestran aquí. Las adquisiciones se reconstruyeron a partir de imágenes confocales y SIM. Se trazaron las dendritas y las espinas se clasificaron automáticamente con el software después de ajustar los parámetros principales, como la longitud del cuello, el diámetro del cuello y el diámetro de la cabeza.

Las áreas en caja muestran una espina dendrítica individual de la que se tomaron imágenes con microscopía confocal y sim y se reconstruyeron a partir de sus correspondientes pilas Z, lo que representa las diferencias en la resolución y precisión de las reconstrucciones 3D resultantes. De acuerdo con SIM, el análisis cuantitativo de mayor resolución del diámetro de la cabeza y el cuello reveló que la microscopía SIM mide dimensiones significativamente más pequeñas que la microscopía confocal para las mismas espinas dendríticas, lo que indica que SIM es capaz de detectar cambios más pequeños en la morfología de la columna dendrítica. Mientras asiste a este procedimiento, es importante recordar adquirir imágenes en bruto de alta calidad para una reconstrucción posterior más válida de la misma imagen.

La microscopía de iluminación estructurada también puede ser eficaz para la obtención de imágenes de células vivas, lo que permite investigar la dinámica de células como las células hela, las neuronas o la bacteria E. coli. Después de ver este video, uno debería tener una buena comprensión de cómo preparar, visualizar e imágenes estándar de las neuronas primarias del hipocampo en una súper resolución.