Expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble Biotinylated Proteínas del Tejido Nervioso para regeneración

El objetivo general de este procedimiento es diseñar, expresar y aislar con éxito proteínas biotiniladas recombinantes que puedan incorporarse a una variedad de aplicaciones, como sondas, sensores, administración de fármacos e ingeniería de tejidos. Esto se logra transformando primero el plásmido diseñado a medida en una línea celular huésped bacteriana utilizando cultivos a pequeña escala y luego induciendo la expresión de la proteína objetivo. A continuación, se determina la presencia y solubilidad de la proteína objetivo para formular procedimientos de purificación adecuados.

A continuación, el procedimiento se amplía para producir mayores rendimientos de la proteína objetivo, que luego se aíslan mediante técnicas de cromatografía de afinidad. Finalmente, las proteínas se purifican y luego se concentran para aplicaciones y análisis posteriores. En última instancia, la página SDS y los resultados de FPLC verifican que las proteínas recombinantes se han aislado y purificado con éxito, y las proteínas se someten a pruebas adicionales para determinar su funcionalidad.

La principal ventaja de la ingeniería de proteínas recombinantes es que nos permite crear cantidades a gran escala o a escala de miligramos de proteínas diseñadas a medida para cumplir con nuestras especificaciones científicas exactas. Por ejemplo, podemos añadir nuevas funcionalidades a porciones de estas proteínas para habilitar nuevas propiedades. Hoy le mostraremos cómo puede biotina los extremos de proteínas específicas, y usamos esto para inmovilizar o atar específicamente estas proteínas a las superficies para guiar las funciones celulares, como el crecimiento neuronal o la diferenciación neuronal.

Los individuos nuevos en esta técnica no deberían tener mucha dificultad al seguir los procedimientos para el aislamiento de proteínas nativas o no nativas. Muchos pasos son los mismos, pero requieren un tampón específico formulado para condiciones nativas o no nativas. Cuidadosa atención a los detalles durante el inicio.

Las etapas de transformación y expresión de prueba garantizarán un alto rendimiento de proteína durante el posterior proceso final de escalado. La demostración visual de este método es importante porque muestra cómo se pueden producir proteínas recombinantes utilizando equipos y suministros de laboratorio simples. Utilizando la reacción por lotes simple, la ecualización y los medios de crecimiento se cultivan en escala líder, produciendo 10 miligramos de proteína por cultivo principal.

Además, se pueden utilizar y demostrar técnicas de cromatografía para mostrar cómo se purifican aún más las proteínas para su aplicación posterior. Hoy, Alicia, graduada del Cinema Lab, demostrará el procedimiento después de la clonación y las pruebas de expresión en la proteína objetivo de interés, y el cultivo de un cultivo de 20 mililitros durante la noche. De acuerdo con el protocolo de texto, vierta el cultivo durante la noche en 1,8 litros de medio de crecimiento estéril con ampicilina y use una pipeta de pasta para agregar de seis a ocho gotas de antiespumante estéril 2 0 4 coloque los cultivos en un baño de agua a 37 grados Celsius a través de un filtro de 0,2 micras, burbujee aire comprimido en los cultivos a través de piedras de aireación. Cuando el cultivo alcanza una DO 600 de 0,7 a 0,8 en un milimolar IPTG e induce durante cuatro horas a 37 grados Celsius o toda la noche a 18 grados Celsius, dependiendo de si la proteína se encontró en la fracción soluble o insoluble en la expresión de prueba.

Experimentos para recolectar las células, transferir el cultivo a botellas de centrífuga de un litro y girarlo durante 15 minutos a 14.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados. Vierta la súper natina y, con una espátula fina, coloque la pastilla bacteriana en dos tubos de 50 mililitros. Vuelva a granular las células por centrifugación durante unos minutos antes de almacenar los gránulos a menos 80 grados centígrados.

Para realizar proteínas no nativas. Aislamiento de una proteína insoluble en cada pellet de ecoli congelado. Agregue 20 mililitros de lisis, tampón de lavado y vórtice y agite para volver a suspender y eliminar los trozos grandes.

Después de incubar en un mutador durante la noche, la solución se verá como una centrífuga de lodo viscoso. El purín a 20, 500 veces la gravedad y la temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el pellet para el aislamiento de proteínas nativas.

Resus suspende los pellets en tampón de lisis a un volumen final de 30 mililitros con el pellet resuspendido en hielo. Configure el sonicate a una amplitud del 30% con un pulso de 30 segundos en 30 segundos apagado y sonique durante cinco minutos. Mover el tubo hacia arriba y hacia abajo durante la sonicación para romper completamente la célula de la célula.

Centrifugar la lechada a 20, 500 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Luego transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el pellet. Para realizar la cromatografía de afinidad en una proteína aislada no nativa, agregue un mililitro de solución de resina NTA de níquel a cada tubo de centrífuga e incube en un mutador o agitador a temperatura ambiente durante al menos una hora.

Vierta la lechada en una columna de afinidad y deje que la solución gotee completamente a través de la válvula de cierre en un vaso de precipitados. Agregue 10 mililitros de tampón de lavado al tubo de centrífuga para eliminar la resina residual y agregue la solución a la columna después de que la solución haya goteado. Usa una varilla de vidrio para remover la resina y deja que termine de gotear antes de agregar otro lavado.

A continuación, utilice 10 mililitros de tampón de lavado para repetir el enjuague del tubo de centrífuga y transferirlo a la columna. A continuación, realice ocho lavados más de la columna con 10 mililitros de tampón de lavado de lisis para cada lavado. Una vez finalizados los lavados, cierre la llave de paso y sustituya el vaso de precipitados de residuos por el tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Añade 15 mililitros de tampón elucian a la columna, remueve la resina y deja reposar la solución durante cinco minutos. A continuación, abra la llave de paso y recoja el EIT antes de repetir con 15 mililitros adicionales de tampón de elución para purificar una proteína nativa. Después de agregar la resina NTA de níquel a la solución de proteína, se incubó en un mutador a cuatro grados centígrados durante al menos una hora.

Después de usar el tampón de lavado para lavar la columna 10 veces, agregue cinco mililitros de tampón de elución e incube la resina durante cinco minutos antes de usar un tubo nuevo para recolectar la mayor parte del EIT mientras el EIT gotea de la columna, agregue 90 microlitros por pocillo de reactivo Bradford a una placa clara de 96 pocillos. Después de cada cinco mililitros de elucian con tampón, deje que 10 microlitros de solución goteen de la columna a un pocillo que contenga 90 microlitros de reactivo Bradford. Continúe con la EEU hasta que ya no se detecte proteína para dializar y/o Rena.

Las proteínas transfieren cada EIT a los tubos de diálisis y se dializan contra el tampón adecuado, una durante cuatro horas a cuatro grados centígrados antes de reemplazarla con el tampón respectivo. Dos durante la noche a cuatro grados centígrados. Utilice concentradores de espín para concentrar las proteínas dializadas a menos de cinco mililitros y purifique aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño si lo desea mediante atin eight.

De acuerdo con el protocolo de texto, durante la expresión de la prueba, NGF y SE tres A se indujeron primero durante cuatro horas a 37 grados Celsius y el análisis de la página SDS determinó que ambas proteínas se encontraban en esta fracción soluble. La expresión de la proteína pareció regular y, por lo tanto, se examinó otra expresión de prueba con inducción nocturna a 18 grados centígrados. La expresión de NGF mejoró en la fracción soluble, mientras que no hubo diferencia notable con SEMA tres.

Se aisló un NGF en condiciones nativas y no nativas y se pasó a través de la columna de FPLC para su purificación. Aunque el NGF estaba en la fracción soluble durante la expresión de la prueba, el aislamiento nativo produjo un bajo rendimiento tanto a 37 grados Celsius como a 18 grados Celsius en las inducciones. Sin embargo, se obtuvo un mayor rendimiento de NGF a través del aislamiento no nativo con renaturalización.

Como resultado, el NGF se aisló en condiciones no nativas. Después de la inducción durante la noche a 18 grados centígrados, el aislamiento no nativo resultó en una producción de SEMA tres con 8.61 más o menos 3.1 miligramos por cultivo principal de dos litros para el aislamiento nativo. Por lo tanto, se indujo SEMA tres A durante cuatro horas a 37 grados centígrados y se aisló utilizando parámetros de aislamiento nativos.

Se recogieron los picos de FPLC y se analizaron las muestras de NGF y SEMA tres A con la página SDS. Los picos de proteínas adicionales encontrados en la salida de FPLC para SEMA tres A se recolectaron y analizaron con la página SDS y no se localizaron en la región de peso molecular SEMA tres a. Lo más probable es que estas fracciones sean productos de degradación porque no se comportaron funcionalmente en los ensayos basados en células, como lo hicieron los tres SEMA.

Un pico indicado aquí. Una vez establecida y dominada la proteína recombinante, el aislamiento y la purificación solo deberían llevar unos días si se realizan correctamente. Sin embargo, las etapas iniciales de transformación de bacterias y expresión de la prueba llevan más tiempo para identificar correctamente la solubilidad de la proteína.

Una vez que se determina la solubilidad, se puede almacenar una biblioteca de las bacterias transformadas en menos 80. Además, después de la expresión de la proteína, los gránulos de E. coli también se pueden almacenar en menos 80 hasta un mayor aislamiento y experimentación. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que los tampones estén esterilizados y frescos para evitar que las proteasas se desnaturalicen y descompongan las proteínas.

Los tampones de aislamiento deben fabricarse y esterilizarse cada cuatro a seis semanas, y los tampones de diálisis deben fabricarse el día antes del aislamiento. Las columnas N-I-N-T-A y FPLC deben limpiarse de acuerdo con los protocolos del fabricante para evitar la contaminación cruzada de múltiples proteínas biotiniladas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar, aislar y purificar proteínas biotiniladas diseñadas a medida utilizando un sistema de expresión de huésped bacteriano.

Esto es similar a lo que se hace tanto científica como comercialmente a pequeña y gran escala. Por lo tanto, esto tiene una amplia aplicación.