Name: Expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble Biotinylated Proteínas del Tejido Nervioso para regeneración (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende a expresar y purificar proteínas recombinantes biotiniladas solubles e insolubles mediante cromatografía de afinidad en células bacterianas. Este método permite obtener rendimientos elevados para aplicaciones en ingeniería de tejidos nerviosos.

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Los autores desean agradecer a la Universidad de Akron para el financiamiento que apoya este trabajo.

<ol><li>Itakura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+a+chemically+synthesized+gene+for+the+hormone+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin.</a> Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).</li>
<li>Goeddel, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+in+Escherichia+coli+of+chemically+synthesized+genes+for+human+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).</li>
<li>Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+nanoscale+mimics+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).</li>
<li>Sengupta, D., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-engineered+biomaterials%3A+highly+tunable+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).</li>
<li>Kamionka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+therapeutic+proteins+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).</li>
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<li>Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein+engineering+to+immobilization%3A+promising+strategies+for+the+upgrade+of+industrial+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).</li>
<li>Bernaudat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+of+membrane+proteins%3A+choosing+the+appropriate+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
<li>McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+immobilization+of+biotinylated+fusion+proteins+NGF+and+Sema3A+utilizing+a+photo-cross-linkable+diazirine+compound+for+controlling+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension.</a> Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).</li>
<li>Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+differences+between+genome+sequences+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22B+strains+REL606+and+BL21%28DE3%29+and+comparison+of+the+E.+coli+B+and+K-12%22%5BJournal%5D)">Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli.</a> B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novagen+pET+System+Manual%22">Novagen pET System Manual</a>. Merck KGaA, , 11, User Protocol TB055 Rev. C 0611JN. Darmstadt, Germany. 1-63 (2011).</li>
<li>Balbas, P., Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back+to+basics%3A+pBR322+and+protein+expression+systems+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli.</a> Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Dubendorff, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+T7+RNA+polymerase+to+direct+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.</a> Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).</li>
<li>Tucker, J., Grisshammer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+rat+neurotensin+receptor+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J.%22%5BJournal%5D)">Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli.</a> Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).</li>
<li>Schatz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+peptide+libraries+to+map+the+substrate+specificity+of+a+peptide-modifying+enzyme%3A+a+13+residue+consensus+peptide+specifies+biotinylation+in+Escherichia+coli%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli).</a> Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).</li>
<li>Anfinsen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+that+govern+the+folding+of+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Principles that govern the folding of protein chains.</a> Science. 181 (4096), 223-230 (1973).</li>
<li>Villaverde, A., Carrio, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+recombinant+bacteria%3A+biological+role+of+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies.</a> Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).</li>
<li>Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+neural+stem+cells+in+three-dimensional+growth+factor-immobilized+chitosan+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).</li>
<li>Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+covalently+modified+hydrogel+blend+of+hyaluronan-methyl+cellulose+with+peptides+and+growth+factors+influences+neural+stem%2Fprogenitor+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate.</a> J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).</li>
<li>Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Differentiation+of+Neural+Stem+Cells+in+Macroporous+Photopolymerizable+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds.</a> PLoS One. 7 (11), (2012).</li>
<li>McCormick, A. M., Leipzig, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regenerative+strategies+incorporating+biomolecular+axon+guidance+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals.</a> Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).</li>
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<li>Li, Y., Sousa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+E.+coli+BirA+biotin+ligase+for+in+vitro+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation.</a> Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Ingeniería de proteínas recombinantes es una técnica muy poderosa que abarca muchas disciplinas. Es rentable, sintonizable y un procedimiento relativamente simple, lo que permite la producción de altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado. Es importante tener en cuenta que el diseño y la expresión de proteínas diana no siempre es sencillo. La expresión basal y estabilidad de la proteína recombinante dependen de opciones específicas de vector, E. cepas de E. coli de células, adiciones etiqu...

Proteínas cubren una amplia gama de biomoléculas que son responsables de muchas funciones biológicas, en última instancia conduce a la formación de tejido adecuado y la organización. Estas moléculas inician miles de vías de señalización que controlan la regulación y / o baja regulación de genes y otras proteínas, mantener el equilibrio en el cuerpo humano. La interrupción de una sola proteína afecta a toda esta red de señales, que puede conducir a la aparición de trastornos o enfermedades devastadoras. Ingeniería de proteínas individuales en el laboratorio ofrece una solución para combatir estos efectos adversos y ofrece una alternativa a los fármacos de moléculas pequeñas. En 1977, un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la somatostatina 14 fue uno de los primeros polipéptidos creados por ingeniería utilizando E. coli 1. Poco después, en 1979, la insulina fue clonado en el plásmido pBR322, transformada, expresó, y purificado 2. Desde entonces, las proteínas recombinantes han ampliado su influencia en varios campos de la research como biomateriales, la administración de fármacos, ingeniería de tejidos, productos biofarmacéuticos, la agricultura, enzimas industriales, biocombustibles, etc (para revisiones ver referencias 3-8). Esto se debe en gran parte a la versatilidad que ofrece la técnica a través de la adición de restos químicos específicos de la aplicación o las secuencias de proteínas para propósitos incluyendo, pero no limitado a, la identificación de proteínas diana, estabilización y purificación. A través de la tecnología del ADN recombinante, las proteínas recombinantes se pueden expresar en una variedad de sistemas de huésped eucariotas y procariotas incluyendo mamíferos, plantas, insectos, levaduras, hongos o bacterias. Cada anfitrión ofrece diferentes ventajas y por lo general el mejor sistema es determinado con base en la función de la proteína, el rendimiento, la estabilidad, el coste total, y la escalabilidad. Las células bacterianas a menudo carecen de los mecanismos de modificación después de la traducción que proporcionan huéspedes eucariotas (es decir, la glicosilación, disulfuro de transición, e<html> tc.) 5. Como resultado, los sistemas de mamíferos y de insectos generalmente resultan en una mejor compatibilidad y la expresión de proteínas eucarióticas, sin embargo estos anfitriones son típicamente más caro y consume mucho tiempo 9. Por lo tanto, E. coli es el anfitrión favorito para nuestro sistema de expresión porque las células se expanden rápidamente en condiciones de crecimiento de bajo costo y los mecanismos de expresión genética se entienden bien 5,9. Además, este sistema es fácil de escalar-para fines de producción y los resultados en las proteínas funcionales a pesar de la falta de modificaciones post-traduccionales 10. La E. coli cepa K12 se elige en este protocolo para la clonación porque esta cepa ofrece excelentes rendimientos de plásmido basado en la alta eficiencia de transformación. Además, una E. coli cepa BL21 se utiliza para la expresión, porque esta cepa huésped contiene el gen de la polimerasa de ARN de T7, que proporciona expresión de la proteína controlada y la estabilidad 11. tienda de campaña &quot;&gt; Después de la selección de acogida, además se debe tener cuidado en la selección del vector de expresión ideal para facilitar la expresión de la proteína seleccionada y controlada. síntesis de proteínas recombinantes comienza con una secuencia de ADN diana que se clona bajo la dirección de las señales de traducción de la transcripción del bacteriófago T7 y, y expresión es inducida en las células huésped que contienen copias cromosómicas del gen de ARN polimerasa de T7 12. Estos vectores, derivados de pBR322 plásmido vector (para una revisión véase la referencia 13), están estrechamente controlada por el promotor de T7 desarrollado inicialmente por Studier y colegas 14 y proporcionar adicional control a través de la inclusión del operador lac y represor lac (LAC1) 15,16. Para la ingeniería de proteínas recombinantes, este sistema de expresión ofrece la posibilidad de adaptar una secuencia específica de aminoácidos de una proteína deseada mediante la inserción de diferentes secuencias de ADN diana o para crear proteínas de fusión compuesto por dominio combinados de proteínas individuales. Además, algunas series de vectores incluyen modificaciones de etiquetas peptídicas que ser colocados en el extremo N o C. Para nuestros fines de diseño, se añadió una histidina (His) de etiquetas a la secuencia diana de ADN para la purificación y una secuencia de biotinylatable 15 aminoácidos se incluyó para biotinilación 17,18. En este protocolo un plásmido que contiene un gen de resistencia a ampicilina, fue elegido para llevar las secuencias de proteínas de fusión biotinylatable. Expresión se controla en este vector a través del promotor lac de T7 y es fácilmente indujo con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Expresiones de ensayo (cultivos a pequeña escala) se utilizan para determinar la presencia y la solubilidad de la proteína diana, que se puede expresar en cualquiera de una forma soluble o insoluble para formular procedimientos de purificación. Una proteína soluble expresado dentro de la célula de las bacterias se someterá plegado espontánea para mantener su estructura nativa 19. Por lo general el nativoestructura es termodinámicamente favorable. En muchos casos, la actividad metabólica del anfitrión no es propicio para la proteína diana, la colocación de la tensión en el sistema que conduce a la producción de proteína insoluble y la formación de cuerpos de inclusión compuestas de agregados de proteínas insolubles. Por lo tanto la proteína diana se desnaturaliza, haciéndolos generalmente biológicamente inactivo 20. Ambas expresiones de prueba se escalan en marcha, y los procedimientos de aislamiento se determinan por la solubilidad de la proteína diana. Se requiere una renaturalización adicional o replegamiento paso para proteínas insolubles. Las proteínas recombinantes resultantes se pueden purificar adicionalmente usando cromatografía de exclusión de tamaño. En la casa de producción de proteínas recombinantes ofrece ventajas de costes sobre los productos comerciales desde miligramos de proteína diana se pueden aislar por litro de cultivo principal. La mayor parte del equipo necesario está disponible en un laboratorio biológico o químico típico. La ingeniería de proteínas permite la creaciónde proteínas de fusión de encargo con funcionalidades adicionales que no siempre están disponibles comercialmente. La Figura 1 representa los principales procedimientos involucrados en la ingeniería de proteínas recombinantes. Con este sistema de expresión que hemos creado muchas proteínas biotinylatable, como el interferón gamma, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, y la proteína morfogenética ósea-21-23, pero nos centraremos en dos proteínas que hemos diseñado para el guiado de los axones, NGF (29 kDa ) y Sema3A (91 kDa) 10 (para una revisión véase la referencia 24). La biotinilación es una técnica común para la identificación, la inmovilización y el aislamiento de proteínas marcadas que utilizan la interacción biotina-estreptavidina bien conocido 25-27. Sondas biofísicos 28,29, biosensores 30 y 31 puntos cuánticos son algunos ejemplos de sistemas que utilizan la alta afinidad de la conjugación de biotina-estreptavidina con una K d del orden de 10 -15 M 27. La E. bio coliligasa estaño, BirA, ayuda en la unión covalente de biotina a la cadena lateral de lisina se encuentra dentro de la biotina etiquetada secuencia de 18,32. Tethering biotina a los materiales y biomoléculas ha producido la liberación sostenida de factores de crecimiento a los teléfonos para múltiples aplicaciones de ingeniería de tejidos 21,33-35. Por lo tanto, la ingeniería de estas proteínas biotinylatable de diseño personalizado es una herramienta poderosa que puede trascender los múltiples intereses de investigación.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%</td><td>Chem-Impex International</td><td>127</td><td>100 g</td></tr><tr><td>2-Hidroxietilmercaptano &beta;-Mercaptoetanol</td><td>Chem-Impex International</td><td>642</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td>2.5 L</td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td>Bioshop AGR001.500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ampicilina sal sódica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Antiespumante 204</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6426</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Barstar-NGF pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 y micro; g</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Células Competentes</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>1 ml; Expression Host</td></tr><tr><td>Bradford reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>BugBuster</td><td>Novagen</td><td>70922-3</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Estándar de filtración en gel</td><td>Bio-Rad</td><td>151-1901</td><td>6 viales</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Hidrodioruro de guanidina clorhidrato de amioformamidina</td><td>Chem-Impex International</td><td>152</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>His-Pur Ni-NTA Resina</td><td>Thermo Scientific</td><td>88222</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>2,5 L</td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td><td>Chem-Impex International</td><td>418</td><td>250 g</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Chem-Impex International</td><td>194</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Tampón de muestra Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>30 ml</td></tr><tr><td>Lauril sulfato sódico sal, Superficie dodecilo de sodio</td><td>Chem-Impex International</td><td>270</td><td>500 g</td></tr><tr><td>LB Caldo&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Células Competentes NovaBlue</td><td>Novagen</td><td>69825</td><td>1 ml; Clonación Huésped</td></tr><tr><td>Fosfato tamponado solución salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td>10 paquete</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Chem-Impex International</td><td>01247</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sema3A-pET-21a(+)</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td><td>4 y micro; g</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio diabásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Caldo Terrific</td><td></td><td>Bioshop TER409.5</td><td>5 kg</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tetraciclina</td><td>Chem-Impex International</td><td>667</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Tampón Tris/Glicina/SDS, 10x</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Triptona, pancreática</td><td>EMD</td><td>1.07213.1000</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Extracto de levadura, granulado</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &Auml; KTApurificador10</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td>Incluye kits y accesorios</td></tr><tr><td>Agitador orbital de sobremesa</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>SHKE4000 MAXQ 4000</td></tr><tr><td>BirA500</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Enzyme viene con tampones de reacción y solución de biotina</td></tr><tr><td>Casette de diálisis</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td>Slide-A-Lyzer (Extra Strength)</td></tr><tr><td>Tubo de</td> <td>diálisisSpectrum Laboratories</td><td>132127, 132129</td><td>MWCO: 25.000 y 50.000</td></tr><tr><td>Válvula de desvío de flujo FV-923</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0011-70</td><td></td></tr><tr><td>FluoReporter Kit de ensayo de cuantificación de biotina</td><td>Invitrogen 1094598</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frac-950 Bastidores de tubos, bastidor C</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-13</td><td></td></tr><tr><td>Colector de fracciones Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td>Incluye kits y accesorios</td></tr><tr><td>Circulador calefactado/refrigerado&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13271-102</td><td>Modelo 1156D</td></tr><tr><td>Horno de calentamiento Serie FD</td><td>Aglutinante</td><td></td><td>Modelo FD 115</td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td>Descontinuado--Producto de reemplazo: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td></tr><tr><td>J-26 XPI Centrífuga Avanti Beckman</td><td>Coulter</td><td>393126</td><td></td></tr><tr><td>JA 25.50 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>363055</td><td></td></tr><tr><td>JLA 8.1 Rotor</td><td>Beckman Coulter 969329</td><td></td><td>Incluye botellas de poliporpileno de 1 L</td></tr><tr><td>JS 5.3 Rotor Beckman</td><td>Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>Themo Scientific</td><td>1849</td><td>Forma 1800 Series Clean Bench Lector</td></tr> de <tr><td>microplacas</td><td>TECAN</td><td></td><td>infinite M200</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td>4 geles verticales sistema de electroforesis</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Geles prefabricados</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td>Cualquier kDa, peine de 15 pocillos</td></tr><tr><td>Columna de Ni-NTA</td><td>Bio-Rad</td><td>737-2512</td><td>49 ml&nbsp; volumen ECONO-Kit de</td></tr><tr><td>minipreparación de plásmido de columna</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Fuente</td><td>de alimentación Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td>250 V, 3 A, 300 W</td></tr><tr><td>Tubos de copolímero de polipropileno de fondo redondo</td><td>VWR</td><td>3119-0050</td><td>50 ml&nbsp; tubos para rotor JA 25.50</td></tr><tr><td>Spin-X UF Concentrators</td><td>Corning</td><td>431488, 431483</td><td>&nbsp; 20 y 6 ml; MWCO: 10.000 da</td></tr><tr><td>Servicio de subclonación</td><td>GenScript USA Inc.</td><td></td> Procesador ultrasónico de <td>servicios de proteínas</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>18910445A</td><td>Modelo CV18</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Modelo G560</td></tr></tbody></table>

expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble biotinylated proteínas del tejido nervioso para regeneración

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

La ingeniería de proteínas recombinantes ha utilizado la Escherichia coli (E. coli) sistemas de expresión para casi 4 décadas, y en la actualidad E. coli es todavía el organismo huésped más utilizado. La flexibilidad del sistema permite la adición de restos tales como una etiqueta de biotina (para las interacciones de estreptavidina) y proteínas funcionales más grandes, como la proteína verde fluorescente o la proteína rojo cereza. Además, la integración de los aminoácidos no naturales tales como quelantes de iones metálicos, grupos funcionales reactivos de forma única, sondas espectroscópicas, y moléculas que imparten las modificaciones post-traduccionales ha permitido una mejor manipulación de propiedades de la proteína y funcionalidades. Como resultado de esta técnica crea proteínas de fusión adaptables que ofrecen una utilidad significativa para los distintos ámbitos de investigación. Más específicamente, la secuencia de la proteína biotinylatable se ha incorporado en muchos proteínas diana debido a la alta interacción de afinidad entre la biotina con la avidina y estreptavidina. Esta adición ha ayudado a mejorar la detección y purificación de proteínas etiquetadas, así como abrir el camino para aplicaciones secundarias como la clasificación de células. Así, las moléculas marcadas con biotina muestran una influencia creciente y generalizada en los campos bioindustriales y biomédicas. Para el propósito de nuestra investigación hemos diseñado proteínas de fusión biotinilada recombinantes que contienen el factor de crecimiento nervioso (NGF) y semaphorin3A (Sema3A) regiones funcionales. Hemos informado anteriormente de cómo estas proteínas de fusión biotinilada, junto con otras secuencias de proteínas activas, pueden ser atados a biomateriales para la ingeniería de tejidos y propósitos de regeneración. Este protocolo describe los conceptos básicos de las proteínas biotinylatable ingeniería en la escala de miligramos, utilizando un vector lac inducible T7 y E. Los huéspedes de expresión de E. coli, a partir de la transformación a escala de tratamiento y purificación.

<html> Clonación y expresión de prueba Cuando chapado se realiza correctamente, colonias aisladas individuales deben formar para aumentar las posibilidades de que el desplume bacterias transformadas clonal de células (Figura 2A). Sin embargo, si se colocan demasiadas células, las placas se incubaron demasiado tiempo a 37 ° C o transformación es cuestionable, las colonias pueden cubrir la placa de agar o formar agregados más grandes de las células (Fig...

El desarrollo de las proteínas de fusión biotinylatable tiene muchas aplicaciones potenciales en diversos campos de la investigación. La ingeniería de proteínas recombinantes es un procedimiento recta hacia adelante que es rentable, proporcionando altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado.

Expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble Biotinylated Proteínas del Tejido Nervioso para regeneración

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

El objetivo general de este procedimiento es diseñar, expresar y aislar con éxito proteínas recombinantes biotiniladas que puedan incorporarse en diversas aplicaciones, como sondas, sensores, entrega de fármacos e ingeniería de tejidos. Esto se logra primero transformando el plásmido diseñado personalizado en una línea celular bacteriana mediante cultivos a pequeña escala, e induciendo luego la expresión de la proteína diana. A continuación, se determina la presencia y solubilidad de la proteína diana para formular los procedimientos adecuados de purificación.Luego, el procedimiento se amplía para producir mayores rendimientos de la proteína diana, que se aíslan posteriormente mediante técnicas de cromatografía de afinidad. Finalmente, las proteínas se purifican y luego se concentran para aplicaciones y análisis posteriores. En última instancia, los resultados de electroforesis SDS-PAGE y FPLC verifican que las proteínas recombinantes han sido aisladas y purificadas con éxito, y las proteínas se someten a pruebas adicionales para evaluar su funcionalidad.La principal ventaja de la ingeniería de proteínas recombinantes es que nos permite crear cantidades a gran escala o en escala de

expression-isolation-purification-soluble-insoluble-biotinylated

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Este video muestra el aislamiento de proteínas intracelulares y de superficie celular a partir de un cultivo de astrocitos. El cultivo de astrocitos se coloca en hielo para inhibir la endocitosis y, a continuación, las proteínas de la superficie celular se marcan con un reactivo de biotinilación. Las células se lisan para liberar las proteínas biotiniladas de la superficie celular y las proteínas intracelulares no biotiniladas. Por último, las perlas recubiertas de estreptavidina se utilizan...

Aislamiento de proteínas intracelulares y de superficie celular a partir de un cultivo de astrocitos

El tráfico de membrana neuronal controla dinámicamente la membrana plasmática y la disponibilidad de proteína significativamente impactos neurotransmisión. Hasta la fecha, ha sido un desafío para medir el tráfico endocítica neuronal en las neuronas adultas. Aquí se describe un método altamente efectivo, cuantitativa para medir los cambios rápidos en la superficie de la proteína expresión ex vivo en rodajas de cerebro agudas.

Cerebro Slice Biotinilación: Una<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque medir tráfico de proteínas específicas Región membrana plasmática en adultos las neuronas

El transporte axonal de BDNF, un factor neurotrófico, es crítico para la supervivencia y la función de varias poblaciones neuronales. Algunos trastornos degenerativos están marcadas por disrupción de la estructura y la función axonal. Hemos demostrado las técnicas utilizadas para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias.

Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

Este protocolo presenta un método para la recuperación morfológica de las neuronas parcheado durante registros electrofisiológicos usando llenado biocitina y posterior procesamiento posterior inmunohistoquímico. Se demuestra que las secciones biocitina llenas de gruesos que se tiñeron y se pueden coverslipped restained con un segundo anticuerpo primario días o meses más tarde.

La inmunotinción de las secciones llenas de Biocitina y se procesaron para neuroquímicos Marcadores

Se utilizó una metodología basada en gradiente de densidad de densidad modificada para aislar células epiteliales del tejido intestinal de Rhipicephalus microplus . Las proteínas unidas a la superficie se biotinilaron y se purificaron a través de perlas magnéticas de estreptavidina para su utilización en aplicaciones aguas abajo.

Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

En este informe se presentan dos métodos basados ​​en la biotinilación, diseñados para determinar la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas expresadas en la membrana plasmática.

Determinación de la expresión de la superficie celular y la tasa endocítica de proteínas en cultivos de astrocitos primarios usando biotinilación

Aquí presentamos un protocolo para murino en vivo etiquetado de proteínas de la superficie celular glomerular con biotina. Este protocolo contiene información sobre la perfusión de los riñones de ratón, aislar glomérulos y realizar endógena inmunoprecipitación de la proteína de interés.

Aislamiento de glomérulos y en Vivo de etiquetado de proteínas de la superficie celular Glomerular

Aquí se presenta un protocolo que combina un sistema de cocultivo endotelial neuronal in vitro e incorporación metabólica de sialoglicano con grupos funcionales bioortogonales para expandir las células primarias del tallo neural y del progenitor y etiquetar su superficie sialoglycoproteínas para el análisis de imágenes o espectrometría de masas de marcadores de superficie celular.

Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

BDNF recombinante que contiene una secuencia Avi (BDNFAvi) se produce en células HEK293 de una manera rentable y se purifica mediante cromatografía de afinidad. BDNFavi es entonces directamente monobiontilado con la enzima BirA en un tubo. BDNFavi y BDNFavi monobionicionados conservan su actividad biológica en comparación con BDNF disponible comercialmente.

Un protocolo mejorado para purificar y directamente monobiocalinato recombinante BDNF en un tubo para estudios de tráfico celular en neuronas

El protocolo presenta un método para la unión covalente in vivo de biotina a proteínas basado en su proximidad a una biotina ligasa fusionada con una proteína de interés. Esta modificación permite un enriquecimiento selectivo de las proteínas utilizando perlas de estreptavidina según sea necesario en los estudios de interacción de proteínas.

In vivo Biotinilación de proximidad para estudios de interacción de proteínas en Paramecium tetraurelia

Aprende a expresar y purificar proteínas recombinantes biotiniladas solubles e insolubles mediante cromatografía de afinidad en células bacterianas. Este método permite obtener rendimientos elevados para aplicaciones en ingeniería de tejidos nerviosos.

Expresión, aislamiento y purificación de soluble e insoluble Biotinylated Proteínas del Tejido Nervioso para regeneración

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