Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes y análisis de la mitosis en progenitores neuronales en cortes cerebrales vivos de ratón. Esto se logra primero mediante la disección de cerebros de embriones. El segundo paso consiste en preparar cortes cerebrales con un vibrátomo.

A continuación, se realiza la imagen en vivo de cortes cerebrales. El paso final consiste en extraer información de las películas para analizar los parámetros de mitosis de interés. En definitiva, se utiliza la microscopía de intervalos de tiempo para mostrar cómo las poblaciones de progenitores del cerebro se dividen en tiempo real.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis fijo, es que permite obtener una comprensión significativa de la dinámica temporal de la división de progenitores neuronales en cortes cerebrales vivos. También puede utilizarse para comprender cómo las perturbaciones genéticas podrían influir en la división de progenitores neuronales. Aunque empleamos este método para entender el desarrollo cortical, el análisis que describimos puede aplicarse al estudio de la mitosis de células madre en otras regiones del cerebro o incluso fuera del cerebro.

El encargado de demostrar este procedimiento será Louis y, un investigador posdoctoral de mi laboratorio. Comience este procedimiento recolectando los embriones de ratón y diseccionando los cerebros embrionarios, incluyendo los cerebros posteriores y los cuatro cerebros con los dos hemisferios cerebrales. En un recipiente con hielo, haga un orificio en el hielo para los moldes de inclusión.

A continuación, vierta medio aros al 3% en un molde de plástico y coloque dicho molde en el agujero del hielo. Agite el medio aros con la punta de un termómetro digital hasta que la temperatura alcance 35 grados Celsius. Luego, transfiera inmediatamente el cerebro al medio de inclusión para eliminar el exceso de HBSS en la interfase entre el cerebro y el aros.

Gire cuidadosa y suavemente el cerebro repetidamente en la solución de inclusión. Con la pinza, se formará un cojín de aros gelificado en la parte inferior del molde en contacto con el hielo. Una vez que se pueda sentir el cojín con la punta de la pinza mientras se agita el cerebro, coloque el cerebro con la cara dorsal hacia arriba; el cerebro no debe hundirse hasta el fondo mismo del molde.

Deje que los bloques de aros se endurezcan en el hielo durante al menos cinco minutos antes de cortar las esquinas del molde con una cuchilla de afeitar. Taladre cuidadosamente un bloque de aros alrededor del cerebro e intente minimizar el número de cortes para evitar perturbar el cerebro embebido. Con el VT 1000 s Viome, genere cortes de 200 a 250 micrones.

Ahora diluya el citocromo 11 hasta una concentración final de 0,5 a 1 micromolar en el medio de cultivo de rebanadas suplementado con factores de crecimiento y, en una placa de 12 pocillos, incube las rebanadas de un cerebro en 2,5 mililitros de la solución de tinción en cada pocillo durante una hora a 37 grados Celsius. Luego, lave las rebanadas con 2,5 mililitros de medio de cultivo de rebanadas sin solución de tinción durante 20 minutos. Para montar las secciones cerebrales, coloque una gota de solución de colágeno en el fondo de un recipiente micropocillo de 35 milímetros con fondo de vidrio.

Extiéndalo con la punta de una pipeta para que coincida con el tamaño del corte. Luego, transfiera un corte a una gota de colágeno. Deje que los cortes incuben a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de transferirlos a un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Después de 20 minutos, añadir un volumen total de 1,2 mililitros de medio de cultivo de tejido a la placa microscópica de fondo de vidrio, agregando 600 microlitros de medio cada vez y distribuyéndolo con la punta de una pipeta. Dejar que los tejidos se recuperen en el incubador durante al menos una hora y 30 minutos a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono antes de transferirlos a la cámara de incubación del microscopio confocal de disco giratorio, manteniendo las mismas condiciones. Para la adquisición de imágenes en vivo, utilice un objetivo de aceite de silicona de 60 x con una distancia de trabajo de 300 micrones y una apertura numérica de 1,3.

Para la imagen de imágenes celulares, las células en una pila Z de 30 micrómetros con el centro de la pila Z, ubicado aproximadamente a 40 micrómetros por debajo de la superficie del corte. Si es necesario, ajuste la potencia del láser y los tiempos de exposición para limitar el fotoblanqueo y utilice un tiempo de exposición que varíe entre 30 y 200 milisegundos según la intensidad de la señal de cyto 11. A continuación, se muestra un ejemplo de datos que se pueden obtener mediante este análisis para identificar las figuras mitóticas en la imagen J. Después de abrir el conjunto de datos para una posición como una pila hiperespectral, seleccione un plano Z en el que el tejido y las células parezcan sanos.

Desplácese hacia atrás en el tiempo para identificar el punto temporal en el que la célula entra en mitosis. La célula puede moverse a través de planos Z, pero la resolución temporal y los parámetros de Zack descritos anteriormente han sido optimizados para permitir este proceso. En una hoja de cálculo, registre las cuatro coordenadas D de la célula en la pila hipertridimensional cuando entra en mitosis.

Conocer estas coordenadas evitará contar la misma célula varias veces. Avance en el tiempo y registre el momento en que la célula progrese de una fase a otra. Documente la duración de cada fase mitótica para una célula dada para realizar la reconstrucción 3D de las células y la cuantificación de la rotación durante la metafase.

Después de haber identificado múltiples células mitóticas, utilice las coordenadas de una célula y avance en el tiempo hasta el comienzo. En metafase, gire toda la pila hiperpara que el borde ventricular quede en un plano. Utilice la herramienta de ángulo para determinar el ángulo que debe aplicarse para esta rotación.

Identifique el plano Z en el que la célula de interés sea más visible en ese plano. Utilice la herramienta de selección rectangular para dibujar una selección que incluya toda la célula. Luego, identifique los planos Z que incluyen la célula de interés y use el comando de duplicado de imagen para crear una subpila.

En el cuadro de diálogo, deje seleccionada la opción de hiperpila duplicada para las secciones. El parámetro Z corresponde a los planos Z, que incluyen toda la célula, y el parámetro de cuadros T corresponde al punto de tiempo actual. A continuación, genere una reconstrucción tridimensional de la célula.

En el momento temporal actual, la separación de cortes corresponde al intervalo entre cada una de las imágenes del plano Z en micrómetros. Utilizando la barra de desplazamiento, gire la reconstrucción tridimensional resultante de modo que el borde de la placa metafásica sea visible.

El número del cuadro corresponde al ángulo beta. Registre este número. Luego mida el ángulo entre la horizontal y las líneas de alineación.

Disecar la placa metafásica perpendicularmente. Este es el registro del ángulo alfa. Estos ángulos para todos los puntos temporales de la metafase de la célula de interés.

El ángulo de rotación entre los puntos temporales t y t menos uno equivale al valor absoluto de la diferencia entre un ángulo en t y este ángulo en T menos uno a lo largo del eje dorsal-ventral. La mitosis se visualiza más fácilmente en regiones dorsales de cortes cerebrales porque el proceso basal de las CRG es más corto y, por lo tanto, menos propenso a ser seccionado por un vioma. A lo largo del eje ROS, los cortes en las regiones dorsales de la corteza proporcionan los resultados más consistentes.

Estos son ejemplos de una región adecuada y una región inadecuada para la obtención de imágenes. En una región adecuada, los núcleos tienen forma elíptica y se observan muchas células mitóticas en el borde del ventrículo antes de la adquisición de imágenes de lapso de tiempo; en una región inadecuada, se observan muy pocas células mitóticas en el borde del ventrículo y los núcleos son redondos.

Aquí se muestra un ejemplo de un buen corte observado con un microscopio de baja magnificación antes de la obtención de imágenes en vivo, y aquí hay algunos ejemplos de células marcadas con cyto 11 en diferentes fases de la mitosis. Se presenta un mosaico de una región en el borde del ventrículo donde dos progenitores neurales atraviesan las diferentes fases de la mitosis marcadas con distintos colores siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como la electroforesis neutral de constructos de ADN, pueden realizarse para responder preguntas adicionales, como cuál es el destino de las células en división y cómo se comporta el citoesqueleto.

También es recomendable utilizar métodos secundarios adicionales al CY 11 para seguir la mitosis, como los ratones transgénicos H two VGFP. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular secciones cerebrales, cuáles son los parámetros de coincidencia óptimos y cómo analizar los datos.