Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes y análisis de la mitosis de los progenitores neurales en cortes de cerebro de ratón vivos. Esto se logra diseccionando primero los cerebros de los embriones. El segundo paso es preparar rebanadas de cerebro con un vibrato.

A continuación, se realizan las imágenes en vivo de los cortes de cerebro. El paso final es extraer información de las películas para analizar los parámetros de mitosis de interés. En última instancia, la microscopía de lapso de tiempo se utiliza para mostrar cómo se dividen las poblaciones progenitoras del cerebro en tiempo real.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis fijo, es que se puede obtener una visión significativa de la dinámica temporal de la división de los neuroprogenitores en cortes de cerebro vivos. También se puede utilizar para comprender cómo las perturbaciones genéticas pueden influir en la división de los progenitores neurológicos. Aunque utilizamos este método para comprender el desarrollo cortical, el análisis que describimos se puede aplicar al estudio de la mitosis de las células madre en otras regiones del cerebro o incluso fuera del cerebro.

El responsable de este procedimiento será Louis y, becario postdoctoral de mi laboratorio. Comience este procedimiento recogiendo los embriones de ratón y diseccione los cerebros embrionarios, incluidos los cerebros posteriores y los cuatro cerebros con los dos hemisferios cerebrales. En un cubo de hielo, crea un agujero en el hielo para los moldes de inclusión.

A continuación, vierta el medio 3%aros en un molde de plástico y coloque ese molde en el agujero del hielo. Revuelva el medio aros con la punta de un termómetro digital hasta que la temperatura alcance los 35 grados centígrados. Luego, transfiera rápidamente el cerebro al medio de inclusión para eliminar el exceso de HBSS en la interfaz entre el cerebro y el aros.

Gire con cuidado y suavidad el cerebro repetidamente en la solución de inclusión. Con las pinzas, se formará un cojín de aros gelificados en el fondo del molde en contacto con el hielo. Una vez que se pueda sentir la almohadilla con la punta de las pinzas mientras se agita el cerebro, coloque el cerebro con el lado dorsal hacia arriba, el cerebro no debe hundirse hasta el fondo del molde.

Deje que los aros se endurezcan en el hielo durante al menos cinco minutos antes de cortar las esquinas del molde con una cuchilla de afeitar. Talla con cuidado un bloque aros alrededor del cerebro y trata de minimizar el número de cortes para evitar perturbar el cerebro incrustado. Con el VT 1000 s Viome genere cortes de 200 a 250 micras.

Ahora diluya cyto 11 hasta una concentración final de 0,5 a un micromolar en el medio de cultivo en rodajas suplementado con factores de crecimiento y una placa de 12 pocillos, incube cortes de un cerebro en 2,5 mililitros de la solución de tinción en cada pocillo durante una hora a 37 grados Celsius. A continuación, lavar las rodajas en 2,5 mililitros de medio de cultivo para rodajas sin solución de tinción durante 20 minutos. Para montar las secciones del cerebro, coloque una gota de solución de colágeno en el fondo de una placa de micropocillos con fondo de vidrio de 35 milímetros.

Extiéndalo con la punta de una pipeta para que coincida con el tamaño de la rebanada. Luego transfiera una rodaja a una gota de colágeno. Deje que las rodajas se incuben a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de transferirlas a una incubadora de 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.

Después de 20 minutos con un total de 1,2 mililitros de medio de cultivo en rodajas en el micro con fondo de vidrio, coloque 600 microlitros de medio a la vez y extiéndalo con la punta de una pipeta. Deje que las rodajas se recuperen en la incubadora durante al menos una hora y 30 minutos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono antes de transferirlas a la cámara de incubación del microscopio confocal de disco giratorio con las mismas condiciones. En cuanto a las imágenes en vivo, utilice un objetivo de aceite de silicona de 60 x con una distancia de trabajo de 300 micras y una apertura numérica de 1,3.

Para la imagen de imágenes celulares, las células en una pila Z de 30 micras con el centro de la pila Z, ubicada a unas 40 micras por debajo de la superficie de la rebanada. Si es necesario, ajuste la potencia del láser y los tiempos de exposición para limitar el fotoblanqueo y utilice el tiempo de exposición que oscila entre 30 y 200 milisegundos, dependiendo de la intensidad de la señal cyto 11. Aquí hay datos representativos que se pueden obtener de este análisis para identificar las figuras mitóticas en la imagen J. Después de abrir el conjunto de datos para una posición como una hiperpila, seleccione un plano Z donde el tejido y las células se vean saludables.

Desplácese hacia atrás en el tiempo para identificar el punto de tiempo en el que la célula entra en mitosis. La celda puede moverse a través de planos Z, pero la resolución temporal y los parámetros de Zack descritos anteriormente se han optimizado para permitir este proceso. En una hoja de cálculo, registre las cuatro coordenadas D de la célula en la hiperpila a medida que ingresa a la mitosis.

Conocer estas coordenadas evitará contar la misma celda varias veces. Desplácese hacia adelante en el tiempo y registre el tiempo en que la celda progresa de una fase a otra. Documentar la duración de cada fase mitótica para que una célula determinada realice la reconstrucción 3D de las células y la cuantificación de la rotación durante la metafase.

Después de que se hayan identificado varias células mitóticas, use las coordenadas de una celda y desplácese hacia adelante en el tiempo hasta el principio. La metafase gira toda la pila de hiperactividad para que el borde ventricular sea más plano. Utilice la herramienta de ángulo para determinar el ángulo que se aplicará para esta rotación.

Identifique el plano Z donde la celda de interés es más visible en ese plano. Utilice la herramienta de selección de rectángulo para dibujar una selección que incluya toda la celda. A continuación, identifique los planos Z que incluyen la celda de interés y utilice el comando de duplicación de imagen para crear una subpila.

En el cuadro de diálogo, deje marcada la pila de hyper duplicada en los segmentos. El parámetro Z corresponde a los planos Z, incluida la celda completa, y el parámetro T de fotogramas corresponde al punto de tiempo actual. Después de eso, genere una reconstrucción 3D de la celda.

En el momento actual. El espaciado de corte corresponde al intervalo entre cada una de las imágenes del plano Z en micras. Con la barra de desplazamiento, gire la reconstrucción 3D resultante para que el borde de la placa metafásica sea visible.

El número de la trama corresponde al ángulo beta. Registre este número. A continuación, mida el ángulo entre la horizontal y alinee por.

Disección perpendicular de la placa metafásica. Este es el registro del ángulo alfa. Estos ángulos para todos los puntos de tiempo de metafase de la celda de interés.

El ángulo de rotación entre los puntos de tiempo t y t menos uno es igual al valor absoluto de la diferencia entre un ángulo en t y este ángulo en T menos uno a lo largo del eje ventral dorsal. La mitosis se visualiza más fácilmente en las regiones dorsales de los cortes de cerebro porque el proceso basal de los GC R es más corto y, por lo tanto, es menos probable que un vioma lo corte. A lo largo del eje de mimo de las ROS, los cortes en las regiones de mimo de la corteza dorsal dan los resultados más consistentes.

Estos son ejemplos de una región buena y una mala región para la obtención de imágenes. En una buena región. Los núcleos tienen forma elíptica y muchas células mitóticas se observan en el borde del ventrículo antes de la obtención de imágenes de lapso de tiempo en una región mala, se observan muy pocas células mitóticas en el borde del ventrículo y los núcleos son redondos.

Aquí hay un ejemplo de un buen corte observado con un microscopio de bajo aumento antes de la toma de imágenes en vivo, y aquí hay algunos ejemplos de células marcadas con cyto 11 en diferentes fases de la mitosis. Aquí se muestra un montaje de una región en el borde del ventrículo donde dos progenitores neuronales pasan por las diferentes fases de la mitosis marcadas en diferentes colores siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la electroporación neutra de construcciones de ADN, para responder a preguntas adicionales, como ¿cuál es el destino de las células en división y cómo se comporta el citoesqueleto?

También es mejor utilizar métodos secundarios más allá de CY 11 para el seguimiento de la mitosis, como H dos ratones transgénicos VGFP. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular cortes de cerebro, qué parámetros coincidentes son los mejores y cómo analizar los datos.