Name: Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-04T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende a realizar imágenes en vivo de la mitosis de progenitores neuronales en cortes cerebrales de embriones de ratón. Esta técnica de microscopía de tiempo real permite analizar la dinámica de división celular con alta resolución temporal y espacial.

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Los autores agradecen la financiación de NINDS / NIH, R00-NS064197 y NINDS / NIH, R01NS083897 (tanto para DLS).

1. Preparación de Medios (figura 1, paso 1) <ol><li> Slice Medio de Cultivo <ol><li> 25 ml de medio de cultivo rebanada es suficiente para preparar platos de fondo 5 de vidrio con 2 rebanadas por pocillo. </li><li> En un tubo cónico de 50 ml, añadir 250 l de una solución de N2 100x y 500 l de una solución 50x B27 sin vitamina A. Añadir DMEM/F12 a un volumen de 22,5 ml. </li><li> Filtro de esterilizar la solución y, posteriormente, añadir 1,25 ml de suero de caballo inactivado por calor y 1,25 ml de suero fetal bovino. </li><li> Incubar solución en un baño de agua a 37 ° C durante la duración de la preparación de las rodajas. </li><li> Añadir los factores de crecimiento (FGF y EGF, concentración final de 10 ng / ml y 20 ng / ml, respectivamente) inmediatamente antes del comienzo de la cultura. La composición de este medio ha sido optimizado para promover la supervivencia de las células en cultivo y para aumentar la tasa de proliferación de los progenitores neurales. Esto por lo tanto maximizar la probabilidad aobservar las células mitóticas en el corte. </li></ol></li><li> Solución Disección HBSS completo <ol><li> Preparar 500 ml de HBSS completo mediante la adición de 50 ml de 10x HBSS, 1,25 ml de Hepes 1 M (pH 7,4, 2,5 mM de FC), 6 ml de 2,5 M de D-glucosa (FC 30 mM), 2,2 ml de 0,9 M de NaHCO3 (FC 4 mM) y tratado en autoclave diH 2 O para un volumen final de 500 ml. </li><li> Solución esterilizar Filtrar y almacenar a 4 ° C hasta que la colección de cuernos uterinos del ratón embarazada. Esta solución puede mantenerse a 4 ° C durante semanas. </li><li> Mantenga HBSS en hielo durante todo el procedimiento de disección. </li></ol></li><li> Incorporación de solución <ol><li> Para la incorporación de 4 cerebros embrionarios, preparar 30 ml de 3% de agarosa de bajo punto de fusión de la solución completa HBSS. En un tubo de 50 ml Erlenmeyer y añadir 0,9 g de bajo punto de fusión de agarosa y lleno HBSS a 30 ml. </li><li> Mezclar la solución con un vórtex, y se funden en un horno de microondas con la posición del tubo y la tapa abierta. </li><li> Mientras que en el horno de microondas, controlar la solución a pdesbordamiento Revent debido a la excesiva de ebullición. Cuando hierva se inicia, detenga el microondas y agite la solución. </li><li> Repita estos pasos hasta que toda la agarosa se haya derretido. </li><li> Guarde el tubo en un baño de agua a 42 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Disección de los embriones (Figura 1, Paso 2) <ol><li> Después de una cuidadosa eutanasia del ratón embarazada, recoger los cuernos uterinos y transferirlos a una placa de 10 cm 2 de Petri que contiene HBSS frío lleno 1x. La edad del embrión puede variar dependiendo del estudio. Este protocolo ha sido utilizado con éxito para el cultivo de cortes de cerebro de días embrionarias E12.5 a E17.5. Debido a su tamaño, los cerebros más jóvenes tienden a ser más difícil de trabajar. </li><li> Recoger los embriones y diseccionar el cerebro embrionarias como se describió anteriormente en la rata y el ratón 26,27, hasta que se obtiene un cerebro embrionario completo, incluyendo el cerebro posterior y el cerebro anterior con los dos hemisferios cerebrales. Estos pueden sermantenerse a temperatura ambiente hasta que todos los cerebros han sido disecados. </li><li> Recoger los embriones y diseccionar el cerebro embrionarias como se describió anteriormente en la rata y el ratón 26,27, hasta que se obtiene un cerebro embrionario completo, incluyendo el cerebro posterior y el cerebro anterior con los dos hemisferios cerebrales. Estos se pueden mantener a temperatura ambiente hasta que todos los cerebros han sido disecados. </li></ol> 3. Incorporación de los cerebros de embriones (Figura 1, Paso 3) <ol><li> En un cubo con hielo, crear un agujero en el hielo para insertar los moldes que encajan en los. </li><li> Verter el medio de agarosa al 3% en un molde de plástico y colocar ese molde en el agujero preparado en el hielo. </li><li> Se agita el medio de agarosa con la punta de un termómetro digital hasta que la temperatura alcanza 35 ° C. </li><li> Transferir rápidamente la zona del cerebro en el medio de inclusión. </li><li> Paso Crítico: Para eliminar el exceso de HBSS en la interfase entre el cerebro y la agarosa, cuidadosamente y secar con cuidado / rotar el cerebro en varias ocasionesen la solución de la incrustación con los fórceps. </li><li> Un amortiguador de agarosa gelificada se forma en la parte inferior del molde en contacto con el hielo. Una vez que el cojín se puede sentir con la punta del fórceps mientras se agita el cerebro, posicionar el cerebro con el lado dorsal hacia arriba. El cerebro no debe hundirse hasta el fondo del molde. </li></ol> 4. Preparación de agarosa Bloquear (Figura 1, Paso 4) <ol><li> Deje que la agarosa se endurezca en el hielo durante al menos 5 min. </li><li> Uso de una hoja de afeitar, la sección de las esquinas del molde. </li><li> Tallar cuidadosamente un bloque de agarosa alrededor del cerebro usando una cuchilla de afeitar. Trate de minimizar el número de cortes para evitar perturbar el cerebro incrustado. </li><li> Asegúrese de que el bloque tiene un área de superficie más grande en la región caudal del cerebro (en comparación con la región rostral, ver Figura 1, Paso 4) para aumentar la estabilidad del bloque en el pedestal de seccionamiento. </li><li> El último corte debe ser el uno en el lado caudal del cerebro;este corte definirá el plano de corte correcta con el vibratome. </li><li> Hacerlo mediante la alineación de la cuchilla perpendicular al eje rostro-caudal del cerebro y el bloque de agarosa. Deslice hacia abajo la cuchilla en sentido caudal a lo largo del eje rostro-caudal y hacer el corte final de unos 5 mm de la región más caudal del cerebro. </li><li> Ajuste el bloque de agarosa / cerebro de lado y repita la incrustación de otros cerebros. </li></ol> 5. Transferencia de los cerebros incrustados en la bandeja del Vibratome (figura 1, paso 5) <ol><li> Añadir una gota de pegamento en la parte inferior de la bandeja de vibratomo. Coloque pegamento de modo que los bloques de agarosa se colocarán dentro de alcance de la cuchilla que vibra. </li><li> Coloque el lado caudal de bloques de agarosa / cerebro hacia abajo en el borde de la espátula, con aproximadamente 50% de la inflexión bloque sobre el borde de la espátula. </li><li> Aplicar la cara caudal del bloque de agarosa para el pegamento y deslice la espátula de distancia, manteniendo el bloque de agarosa a la parte inferior de la bandeja con la shoulder de un par de pinzas. No deje que la espátula en contacto directamente con el pegamento. </li><li> Deje que el pegamento se solidifica a temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol> 6. Seccionamiento de los cerebros Embedded (figura 1, paso 6) <ol><li> Llene la bandeja vibratome con HBSS. </li><li> Defina las posiciones inicial y final de la hoja vibratome. </li><li> Generar 200-250 micras rodajas. Con el vibratome VT1000S, utilice los siguientes parámetros: velocidad 2-4, frecuencia 8. </li><li> Retire con cuidado los trozos de la vibratome ya que se cortan. Transfiera las rebanadas con una espátula y el back-end de pinzas en placas de 12 pocillos llenos de plena HBSS. Alternativamente, algunos investigadores han utilizado un pincel en lugar de pinzas Punto clave:. Durante el traslado, tenga cuidado de que siguen siendo los cortes de cerebro asociadas a la agarosa circundante. </li></ol> 7. Syto11 La tinción de las rebanadas (Figura 1, Paso 7) <ol><li> Diluir Syto11 a una concentración final de0,5 a 1 mM en el medio de cultivo rebanada complementan con factores de crecimiento. </li><li> En el pocillo de una placa de 12 pocillos, se incuban las rebanadas de un cerebro en 2,5 ml de la solución de tinción durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar las rodajas en 2,5 ml de medio de cultivo de cortes sin manchar solución durante 20 min. </li></ol> 8. Montaje del Slices en un plato de fondo de vidrio (Figura 1, los pasos 8, 9) <ol><li> Preparar 15 l de la incrustación de solución de colágeno por porción. Preparar una solución de 1,5 mg / ml de colágeno mediante la mezcla de 375 l de 3 mg de solución de I / ml de colágeno de tipo con 75 l de 10x DMEM, 9,4 l de NaOH 1 M, y 290 l de H 2 O. Almacenar en hielo. </li><li> Coloque una gota 15 l de la solución de colágeno en la parte inferior de una parte inferior de 35 mm de cristal de micropocillos de plato. Corre con una punta de pipeta para que coincida con el tamaño de la porción. </li><li> Transfiera la rebanada en la gota de colágeno con una espátula y pinzas Punto clave:. Montaje varios sectores en diferirplatos rentes aumenta la probabilidad de adquirir rebanadas adecuados para la imagen. Pantalla a través de diferentes sectores y seleccionar las que mejor se adaptan a los criterios descritos a continuación en la sección &quot;Resultados representante&quot;. </li><li> Deje que los cortes se incuban a temperatura ambiente durante 10 min antes de transferirlos a una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Después de 20 minutos, añadir 1,2 ml de medio de cultivo rebanada en el fondo del plato de micropocillos Glass. Añadir 600 l de medio a la vez y se extendió con una punta de pipeta. </li><li> Captura de una imagen de bajo aumento de la rebanada de cerebro para registrar el nivel anatómico y la integridad de la rebanada. </li></ol> 9. Imágenes en vivo de las rebanadas (Figura 1, los pasos 10, 11) <ol><li> Deje que las rodajas se recuperan en la incubadora por lo menos durante 1 hora y 30 minutos a 37 ° C con 5% de CO 2 antes de imágenes en directo. </li><li> Imagen de las rebanadas con el microscopio de elección, teniendo en cuenta que Syto11 es muy propenso a photobleaching. Aquí una inverted disco giratorio microscopio confocal se utiliza (Andor XD revolución hilado microscopio confocal de disco). Alternativamente, un microscopio confocal de barrido láser puede ser utilizado. Los siguientes parámetros son para el microscopio de disco giratorio de configuración. </li><li> Durante toda la sesión de formación de imágenes en vivo, mantener las rebanadas a 37 ° C, 5% de CO 2 en una cámara de incubación humidificada adjunta al microscopio. </li><li> Celdas de imagen con un objetivo 60X de silicio de aceite con una distancia de trabajo de 300 micras, y una apertura numérica de 1,3 (para ejemplos véase las figuras 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Un objetivo aceite 100X con una distancia de trabajo de 130 micras y una apertura numérica de 1,4 (por ejemplo, véase la Figura 4C) también se puede utilizar. La resolución de la cámara es de 512 x 512. </li><li> Imagen de las células en un z-pila 30 micras, con el centro de la Z-pila situada a unos 40 m por debajo de la superficie de la rebanada. Tratando de imagen más profundamente en el tejido puede causar que el objetivo de añadirpresión mecánica en la rebanada. Esto puede afectar a la integridad de la rebanada de cerebro. Si la planificación para hacer reconstrucciones en 3D de las celdas, utilice un z-intervalo de no más de 2 m. </li><li> Ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición para limitar fotoblanqueo. Utilice tiempos de exposición que van de 30 a 200 mseg, dependiendo de la intensidad de la señal de Syto11. </li><li> Con una plataforma motorizada, imágenes múltiples posiciones a través de múltiples cortes montados en 1 plato. Por ejemplo, la imagen de hasta 20 puestos repartidos en 4 rebanadas diferentes en 1 solo plato. </li><li> Para imágenes en directo, utilice una resolución temporal de menos de 5 minutos para permitir la identificación de las diferentes fases de la mitosis. Usando Syto11 y / o histona H2B-EGFP, 4 - 5 horas de imágenes en vivo son suficientes para observar un número significativo de células mitóticas. Sin embargo, si la etiqueta de formación de imágenes escasamente células mitóticas (tales como los conseguidos mediante electroporación en el útero), a continuación, un parámetro de formación de imágenes más larga (durante la noche) es apropiado y funciona nosll. Nota: El uso de este protocolo, se suele observar una media de 10 células mitóticas por posición. Como se indicó anteriormente, múltiple de imágenes montado rebanadas aumenta la probabilidad de tener un experimento exitoso. Con este enfoque suele identificar células mitóticas en prácticamente todos los experimentos realizados con Syto11 o histona H2B-EGFP. </li></ol> 10. Post-adquisición Análisis de la mitosis (Figura 2) Todos los procedimientos de esta sección han sido optimizados en Fiji (ImageJ), que es una ventaja, ya que es un software gratuito de código abierto. Otras soluciones de software están disponibles para realizar las mismas tareas, como Metamorph, Imaris y Amira. <ol><li> Identificación de mitótico Figuras en Fiji <ol><li> Después de abrir el conjunto de datos para una posición como &quot;HyperStack&quot;, seleccione un plano z (ver figura 2A para la ubicación de la barra de desplazamiento), donde el tejido y las células se ven saludables (véanse los criterios en la sección de discusión).Desplazarse a través de la dimensión temporal para identificar las células que van a través de la anafase, como lo es la fase mitótica más fácil de identificar. </li><li> Desplácese hacia atrás en el tiempo para identificar el punto en el tiempo en que la célula entra en mitosis (condensación del ADN). La célula puede moverse a través de Z-planos, pero la resolución temporal y los parámetros de pila Z descritos anteriormente se han optimizado para permitir este proceso. </li><li> En una hoja de cálculo, grabar el 4D coordenadas de la celda en el HyperStack (X, Y, Z y tiempo, véase la Figura 2A para visualizar la ubicación de estas cifras en la interfaz de Fiji) cuando entra en la mitosis. Conociendo estas coordenadas evitará contando la misma célula varias veces. </li><li> Desplácese hacia adelante en el tiempo y registrar el momento en que la célula pasa de una fase a otra. Documentar la duración de cada fase mitótica de una célula dada. </li><li> Proceda con otras células, a través del conjunto de datos completo (células múltiples dentro y fuera de las posiciones). </li></ol></li><li> 3D Reconstruction de las células y la cuantificación de la rotación durante la metafase (Adaptado de Haydar et al, 2003) (Figura 2B). <ol><li> Después de haber identificado varias células mitóticas, utilice las coordenadas de una célula y desplazarse hacia adelante en el tiempo hasta el inicio de la metafase. </li><li> Gire todo el &quot;HyperStack&quot; para que la frontera ventricular es plana (con el comando &quot;Imagen / Transformar / Rotar ...&quot;). Utilice la herramienta de &quot;ángulo&quot; para determinar el ángulo de solicitar esta rotación. </li><li> Identificar el plano z, donde la célula de interés es la más visible. En ese plano, utilice la herramienta &quot;rectángulo de selección&quot; para dibujar una selección que incluye toda la celda. </li><li> Identificar los Z-planos que incluyen la célula de interés. Utilice la opción &quot;Imagen / Duplicar&quot; para crear un &quot;sub-stack&quot;. En el cuadro de diálogo, deje &quot;HyperStack Duplicate&quot; marcada. El &quot;Slices (z)&quot; parámetro corresponde a los z-aviones incluyendo toda la cell, y los &quot;Marcos (t)&quot; parámetro se corresponde con el punto de tiempo actual. </li><li> Si la resolución es pobre, aumente el tamaño de la &quot;sub-stack&quot; con la &quot;Imagen / Ajustar / tamaño ...&quot; comando. </li><li> Generar una reconstrucción en 3D de la célula en el instante actual, usando el &quot;proyecto Image/Stacks/3D ...&quot; comando. Los parámetros para este comando se muestran en la Figura 2B. La &quot;separación de la rebanada&quot; corresponde al intervalo entre cada una de las imágenes plano z (M). Importante: asegúrese de que la dimensión física (m) de la sub-pila se ha conservado. Si no, la interpolación de los píxeles en la dimensión Z será incorrecta, y la reconstrucción 3D será inexacta. </li><li> Uso de la barra de desplazamiento, girar la reconstrucción 3D resultante de manera que el borde de la placa de la metafase es visible. El número de la trama corresponde al ángulo beta se describe en la Figura 3B, registrar este número. Usola función &quot;ángulo&quot; y el &quot;Analizar / Medida ...&quot; de comandos, medir el ángulo entre la horizontal y una línea bisectriz la placa de metafase perpendicularmente (Figura 2B). Este es el ángulo alfa. </li><li> Anote estos ángulos para todos los puntos de tiempo en metafase de la célula de interés. El ángulo de rotación entre los puntos de tiempo (t) y (t-1) es igual al valor absoluto de la diferencia entre un ángulo a (t) y este ángulo a (t-1). </li></ol></li><li> Medición de la orientación de la escisión del avión <ol><li> 3D reconstruir una célula de interés en un punto de tiempo durante la anafase siguiendo las instrucciones descritas para la reconstrucción 3D de placas de metafase. </li><li> Girar la reconstrucción hasta que los bordes de las dos placas formadas por los cromosomas segregantes son visibles. </li><li> Utilice la herramienta de ángulo para medir el ángulo entre la horizontal (el borde ventricular) y una línea paralela a las dos placas formadas por los cromosomas segregantes. Este es el ángulo del plano de clivaje (Figura 2C). </li></ol></li><li> Generación de Películas <ol><li> A medida que las células se mueven a menudo a través de diferentes z aviones, identificar los z aviones ocupados por la célula durante la sesión de imágenes en directo. Generar una &quot;proyección de intensidad máxima&quot; de estas z aviones utilizando el &quot;/ Pilas Z proyecto Imagen / ...&quot; comando. Guarde la pila resultante como un archivo &quot;. TIF&quot;. </li><li> Abra el archivo en la versión 1.45 de ImageJ como Fiji no incluye un plugin estable para la generación de &quot;. Mov&quot; o &quot;. Avi&quot; archivos. </li><li> Utilice la opción &quot;Archivo / Guardar como / ...&quot; comando de ImageJ para generar una película en un formato compatible con las aplicaciones de aguas abajo. </li></ol></li></ol>

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<li>Shu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublecortin-like+kinase+controls+neurogenesis+by+regulating+mitotic+spindles+and+M+phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression.</a> Neuron. 49, 25-39 (2006).</li>
<li>Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Interactions+between+Intermediate+Neurogenic+Progenitors+and+Radial+Glia+in+Embryonic+Mouse+Neocortex%3A+Potential+Role+in+Dll1-Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).</li>
<li>Hu, D. J. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+recruitment+to+nuclear+pores+activates+apical+nuclear+migration+and+mitotic+entry+in+brain+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells.</a> Cell. 154, 1300-1313 (2013).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).</li>
<li>Tyler, W. A., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genetic+Fate+Mapping+Reveals+a+Novel+Route+of+Neocortical+Neurogenesis%2C+Which+Is+Altered+in+the+Ts65Dn+Mouse+Model+of+Down+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).</li>
<li>Noctor, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Imaging+of+Fluorescently+Labeled+Live+Cells+in+the+Embryonic+Mammalian+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain.</a> CSH Protoc. , (2011).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li>
<li>Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique+radial+glial+divisions+in+the+developing+mouse+neocortex+induce+self-renewing+progenitors+outside+the+germinal+zone+that+resemble+primate+outer+subventricular+zone+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors.</a> Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).</li>
<li>Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+and+cell+tracking+using+a+histone+fluorescent+protein+fusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice.</a> BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOCK7+interacts+with+TACC3+to+regulate+interkinetic+nuclear+migration+and+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis.</a> Nat Neurosci. 15, (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+Acid+from+the+meninges+regulates+cortical+neuron+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation.</a> Cell. 139, 597-609 (2009).</li>
<li>Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+is+required+for+interkinetic+nuclear+migration+of+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La principal ventaja del protocolo que hemos descrito es que proporciona una resolución temporal dinámica de la mitosis de células progenitoras neurales. Por lo general, los ensayos de visualizar la mitosis en el cerebro en desarrollo se realizan utilizando inmunofluorescencia de secciones de tejido fijadas. Pero este enfoque sólo ofrece una instantánea de la mitosis en un punto del tiempo. Hay varios pasos que son más críticos para obtener imágenes de mitosis en rodajas de cerebro: 1) Los c...

El objetivo general de este protocolo es describir cómo realizar imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales en rodajas de cerebro de embriones. El uso de imágenes en vivo de cortes de cerebro en cultivo, este protocolo proporciona un método simple para ensayar múltiples aspectos de la mitosis en células progenitoras neurales en un entorno altamente similar a un entorno in vivo. Se puede aplicar a los cerebros de los animales y / o cerebros mutantes que han sido manipulados con la electroporación en el útero) 1-5. Esta técnica también es ideal para probar el efecto de agentes farmacológicos en la mitosis precursores neuronales &#39;, por la simple adición de un agente al medio de cultivo. En suma, este artículo hará un protocolo técnicamente difícil acceso para los que estudian la neurogénesis. Durante la neurogénesis, poblaciones progenitoras neuronales distintas someten a divisiones precisas para generar neuronas que finalmente contribuyen a las seis capas corticales del neocórtex 6-8 adultos. Temprano en el desarrollo cortical, la piscina precursor neuronal se expande como células neuroepiteliales (NE) se dividen simétricamente de auto-renovación. Células NE a continuación, se convierten en células gliales radiales (CGR). Inicialmente CGR división simétrica para producir dos nuevos CGR, sin embargo, durante la mayor parte de la neurogénesis, el modo principal CGR &#39;de la división es asimétrica. En la división asimétrica, 1 RGC da lugar a un nuevo RGC y, o bien una neurona post-mitótico, o un progenitor más especializado (ya sea un precursor neuronal corto (SNP), un glía radial exterior (ORG), o un progenitor intermedio (INP) 2,3,7,9. INP, SNPs, y orgs luego pueden generar neuronas en el sub-ventricular, ventricular, y las regiones basales de la corteza, respectivamente. Por lo tanto, la división celular de los progenitores es un proceso fundamental para la generación de neuronas de la neocórtex. Numerosos estudios apuntan a una correlación entre los rasgos mitóticas específicas de la CGR y el destino de las células hijas. Haydar et al., Y Takahashi et al.han demostrado que la RGC duración mitótico y aumento de la duración del ciclo celular como neurogénesis continúa, un hallazgo se hizo eco en el seguimiento de los estudios de 10 a 13. Un número de estudios han sugerido que huso mitótico orientación relativa al ventrículo influye en los aspectos de la neurogénesis y corticogenesis, incluyendo tipos de neuronas generadas y ubicación de la progenie en el cerebro, respectivamente 3,10,14-16. Si la orientación plano de clivaje influye directamente en el destino celular es controversial, pero la conclusión es que este mitótico impactos parámetros neurogénesis. Subraya además la importancia de la mitosis es la observación de que muchos genes implicados en la mecánica de la mitosis son cruciales para la neurogénesis y para el desarrollo adecuado del cerebro 17-20. La mitosis es un proceso dinámico, sin embargo, hasta la fecha la mayoría de los estudios que detallan la mitosis progenitora neural utilizar el análisis de secciones de tejido de imágenes fijas o de progenitores neurales a través de cultivo celular in vitro. Por lo tanto, los métodos convencionales para evaluar la mitosis sólo proporcionan una instantánea de este proceso y no logran descubrir cómo se comportan las células en un tejido. Imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales se ha convertido en una herramienta fundamental para la comprensión de la función de progenitores neurales. Para ejemplos vea estas referencias 4,8,10,21-25. Varios protocolos pendientes se han publicado para la preparación y obtención de imágenes de cortes de cerebro 26,27. Sin embargo hasta la fecha, un protocolo completo para la formación de imágenes y el análisis de la mitosis no se ha descrito ni demostrado en vídeo. Esta técnica ofrece varias ventajas significativas sobre análisis fija de secciones de cerebro. Time-lapse análisis de cortes de cerebro permite la generación de un número significativamente mayor de puntos de datos que pueden ser analizados de una manera flexible. En primer lugar, los datos se reunieron en puntos de tiempo individuales en el transcurso de varios minutos o varias horas. Uno puede analizar los puntos temporales individuales (para crear un montaje estático) opueden combinar diferentes puntos de tiempo en películas. En segundo lugar, la imagen confocal de rebanadas permite la generación de los datos en diferentes secciones Z en rodajas de cerebro. Como resultado, las secciones individuales se pueden analizar. Alternativamente, las pilas de secciones individuales se pueden combinar en una proyección de intensidad máxima. En tercer lugar, el análisis se realiza en el contexto de un tejido, que revela cómo las células se dividen con respecto a las células y estructuras vecinas. En cuarto lugar, es ideal para el análisis de mutantes que muestran alguna evidencia de defectos mitótico. Juntos este protocolo ayudará a clarificar los pasos críticos para ayudar a los investigadores que deseen realizar imágenes en vivo de la mitosis progenitoras neurales en sus propios laboratorios.

<table><tbody><tr><td>100X N2</td><td>Life technologies</td><td>17502048</td><td>para medio de cultivo</td></tr><tr><td>50X B27 sin vitamina A</td><td>Life technologies</td><td>12587010</td><td>para medio de cultivo</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technologies</td><td>11320033</td><td>para medio</td></tr><tr><td>de cultivo Suero de caballo inactivado por calor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1138-500ml</td><td>para medio</td></tr><tr><td>de cultivo Suero de ternera inactivado por calor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>para medio de cultivo</td></tr><tr><td>FGF</td><td>R& D Sytems</td><td>3139-FB-025</td><td>para medio de cultivo</td></tr><tr><td>EGF</td><td></td><td></td><td>para medio de cultivo</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14065-056</td><td>para la disección de los embriones</td></tr><tr><td>Hepes Free Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>diluido a 1 M (pH 7,4)</td></tr><tr><td>2,5 M D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>para la disección de los embriones</td></tr><tr><td>0,9 M NaHCO3</td><td>Life technologies</td><td>25080-094</td><td>para la disección de los embriones</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td>para la generación de rodajas</td></tr><tr><td>Syto11</td><td>Life technologies</td><td>S7573</td><td>Make 5&micro; l alícuotas</td></tr><tr><td>3 mg/ml colágeno tipo I</td><td>Life technologies</td><td>A1048301</td><td>para el cultivo de rodajas</td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>para el cultivo de rodajas Placas</td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>Petri</td><td>para la disección de los embriones</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td></td><td></td> digital <td>para medir la temperatura de la agarosa</td></tr><tr><td>Espátula</td><td></td><td></td><td>para Transferencia de cerebros</td></tr><tr><td>Pincel</td><td></td><td></td><td>alternativo a los cerebros de transferencia</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000s</td><td>para generar rebanadas</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td>de disección Diseccionar embriones</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> de imagen <td>Se requiere un microscopio confocal, debe estar equipado con una cámara de incubación</td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Aunque de corta duración, la mitosis es un proceso de múltiples pasos complejo y dinámico fundamental para el desarrollo de órganos, incluyendo el cerebro. En la corteza cerebral en desarrollo, la mitosis anormal de progenitores neurales puede causar defectos en tamaño y la función del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad crítica de herramientas para entender los mecanismos de la mitosis progenitora neural. Desarrollo cortical en los roedores es un modelo excelente para el estudio de este proceso. La mitosis progenitoras neurales se examina comúnmente en las secciones del cerebro fijos. Este protocolo se describen en detalle un enfoque para la formación de imágenes en directo de la mitosis en ex vivo rodajas de cerebro de embriones. Vamos a describir los pasos críticos para este procedimiento, que incluyen: la extracción del cerebro, la incrustación de cerebro, vibratome seccionamiento de cortes de cerebro, la tinción y el cultivo de las rebanadas, y time-lapse. A continuación, vamos a demostrar y describir en detalle cómo realizar el análisis posterior a la adquisición de la mitosis. Incluimos resultados representativos frOM este ensayo usando el colorante vital Syto11, ratones transgénicos (histona H2B-EGFP y EGFP-centrin), y en el útero de electroporación (mCherry-α-tubulina). Vamos a discutir cómo se puede optimizar mejor este procedimiento y la forma en que se puede modificar para el estudio de la regulación genética de la mitosis. Imágenes en vivo de la mitosis en rodajas de cerebro es un enfoque flexible para evaluar el impacto de la edad, la anatomía y la perturbación genética en un ambiente controlado, y para generar una gran cantidad de datos con una alta resolución temporal y espacial. De ahí que este protocolo complementa las herramientas existentes para el análisis de la mitosis progenitoras neurales.

El éxito de este ensayo y la observación de múltiples células mitóticas durante una sesión de formación de imágenes en vivo dependen en gran medida de tanto la integridad y nivel anatómico de la rebanada de donde se toman las adquisiciones. Como veremos más adelante, el nivel anatómico de un sector es un factor importante. Figura 3A muestra rostro-caudal y medial-lateral lugares en los que hemos tenido más éxito. Para la discusión adicional de este tema consulte Noctor 26. La integridad de la...

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar imágenes y análisis de la mitosis en progenitores neuronales en cortes cerebrales vivos de ratón. Esto se logra primero mediante la disección de cerebros de embriones. El segundo paso consiste en preparar cortes cerebrales con un vibrátomo.A continuación, se realiza la imagen en vivo de cortes cerebrales. El paso final consiste en extraer información de las películas para analizar los parámetros de mitosis de interés. En definitiva, se utiliza la microscopía de intervalos de tiempo para mostrar cómo las poblaciones de progenitores del cerebro se dividen en tiempo real.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis fijo, es que permite obtener una comprensión significativa de la dinámica temporal de la división de progenitores neuronales en cortes cerebrales vivos. También puede utilizarse para comprender cómo las perturbaciones genéticas podrían influir en la división de progenitores neuronales. Aunque empleamos este método para entender el desarrollo cortical, el análisis que describimos puede aplicarse al estudio de la mitosis de células madre en otras regiones del cerebro o incluso fuer

live-imaging-of-mitosis-in-the-developing-mouse-embryonic-cortex

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Este video muestra un protocolo para aislar y cultivar células de la corteza cerebral primaria del telencéfalo dorsolateral de embriones de ratón.

Aislamiento y cultivo de células de telencéfalos dorsolaterales de embriones de ratón

Fuente: Wiegreffe, C., et. al.,  Imágenes confocales de lapso de tiempo de neuronas migratorias en cultivo de corte organotípico de cerebro de ratón embrionario usando En el útero Electroporación. J. Vis. Exp. {{TAG_ 44}} (2017) Este video muestra la microscopía confocal de lapso de tiempo para observar la migración radial de las neuronas corticales desde la zona subventricular a la placa cortical a través de andamios gliales radiales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos.

Imágenes de lapso de tiempo de la migración radial de neuronas corticales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos

Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

Este protocolo describe un método sencillo y conveniente para marcar y visualizar energizados cromosomas en las células mitotic usando la etiqueta Histone2B-GFP BacMam 2.0 y un sistema de microscopia confocal spinning disc.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Presentamos un protocolo detallado para el cultivo de embriones de ratón y la obtención de imágenes que permite obtener imágenes 3D + tiempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de herramientas de video aborda las habilidades clave requeridas para obtener imágenes en vivo exitosas que de otro modo serían difíciles de adquirir de publicaciones de solo texto.

Imágenes en vivo de progenitores cardíacos tempranos en el embrión de ratón

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

En este material de vídeo y complementaria, se muestra un protocolo para la...

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

Aprende a realizar imágenes en vivo de la mitosis de progenitores neuronales en cortes cerebrales de embriones de ratón. Esta técnica de microscopía de tiempo real permite analizar la dinámica de división celular con alta resolución temporal y espacial.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

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