Bioenergética y los Oxidativo ráfaga: Los protocolos para el aislamiento y la Evaluación de leucocitos humanos y plaquetas

En el siguiente protocolo, se demostrará la medición de los perfiles bioenergéticos y las respuestas de estallido oxidativo de monocitos, linfocitos, neutrófilos y plaquetas de la sangre humana. Esto se logra recolectando primero la capa leucocitaria y las fracciones de plasma ricas en plaquetas de la sangre recién extraída. Como segundo paso, la población heterogénea de glóbulos blancos se separa en capas de células mononucleares y polimorfonucleares mediante un gradiente de densidad.

A continuación, las poblaciones puras de neutrófilos y linfocitos monocitos se aíslan aún más mediante separación máxima y luego se colocan en placas para el flujo extracelular o el análisis XF. En última instancia, la medición sensible y reproducible de la función mitocondrial en monocitos, linfocitos y plaquetas, así como el estallido oxidativo de las tasas de consumo de oxígeno de monocitos y neutrófilos, se puede medir mediante la tecnología XF. La ventaja de la técnica que te vamos a mostrar hoy es que puedes preparar a partir de una pequeña muestra de sangre todas las células principales que se encuentran en la sangre del paciente.

Estas son las plaquetas y los leucocitos en forma pura inactivada y miden su función mitocondrial. Esto, creemos, puede reflejar varias enfermedades y estados dentro del paciente en tiempo real. Este método podría ayudar a responder preguntas clave sobre el metabolismo, como cuál es el papel del estilo de vida, la dieta y el estrés patológico en la función mitocondrial.

Este protocolo combina múltiples tecnologías para el aislamiento y determinación de bioenergética celular en diversas poblaciones de leucocitos y en plaquetas. Este paso del protocolo es muy crítico porque el gradiente de densidad y la separación magnética requieren un pipeteo preciso. Además, debe tener en cuenta dónde se encuentran las poblaciones celulares durante el fraccionamiento.

Demostraremos el aislamiento de células de sangre periférica y el análisis de la bioenergética celular en el analizador de flujo extracelular de 24 pocillos o el XF 24. Sin embargo, este método también se puede realizar en el XF 96, al menos dos horas antes de comenzar el procedimiento. Hidrate las sondas de cartucho del sensor XF con la solución de ranura XF.

A continuación, centrifugar la sangre entera recién extraída durante 15 minutos a 500 veces G y temperatura ambiente en una centrífuga con un rotor de cubo oscilante. Utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa superior que contiene el plasma rico en plaquetas hasta que quede un centímetro de plasma por encima de la capa de la capa leucitaria de eritrocitos y reserve el plasma a temperatura ambiente para su posterior procesamiento. A continuación, transfiera el pelaje leucocitario a un tubo cónico estéril de 50 mililitros y diluya los glóbulos blancos a 24 mililitros.

Con RPMI basal a continuación, agregue tres mililitros de baja densidad, su opaco 1.077 a cada uno de los tres tubos cónicos de 15 mililitros. A continuación, coloque la punta de una pipeta estrecha de cinco mililitros en el fondo de cada tubo. A su vez y poco a poco libera tres mililitros de alta densidad, su opaco 1.119.

Ahora, use una pipeta automatizada en la configuración de baja potencia para agregar cuidadosamente ocho mililitros de sangre diluida a cada gradiente sin alterar las capas. Se ha añadido un tinte azul al degradado de baja densidad para la visualización de todas las capas de degradado. Después de separar las células por centrifugación por separado, recoja las células mononucleares y polimorfonucleares con pipetas de vidrio estériles sin alterar las otras bandas celulares.

Agrupe las poblaciones de células mononucleares y polimorfonucleares de cada tubo en tubos cónicos estériles de 50 mililitros para cada tipo de célula, y agregue cuatro volúmenes de RPMI a ambos tubos. Después de girar las celdas, transfiera los gránulos a un tubo de repellet de 1,5 mililitros y vuelva a suspender en 80 microlitros de RPMI fresco suplementado con BSA. A continuación, añada 20 microlitros de anticuerpos anti CD 14 y anti CD 15 marcados con perlas magnéticas a las fracciones de células mononucleares y polimorfonucleares, respectivamente.

Incubar cada suspensión celular durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, y luego lavar cada tubo con un mililitro de medio R-P-M-I-B-S-A resuspender los gránulos en 500 microlitros de R-P-M-I-B-S-A. A continuación, aplique las suspensiones celulares a las columnas LS lavadas individuales de R-P-M-I-B-S-A y lave cada columna tres veces con tres mililitros de medios R-P-M-I-B-S-A Recoja el flujo de suspensión celular y los lavados de la columna en tubos estériles para aislar los monocitos y neutrófilos, retire las columnas del campo magnético después del lavado final y eluya las células seleccionadas positivamente en un tubo estéril con cinco mililitros de R-P-M-I-B-S-A. Para aislar los linfocitos, granule el flujo a través de la fracción de lavado de la columna celular, resuspenda el pellet celular en 80 microlitros de R-P-M-I-B-S-A e incube las células en 20 microlitros de anticuerpos CD 61 y CD 2 35 A durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Luego repita la separación máxima como antes, y recoja el flujo a través de los linfocitos para aislar las plaquetas, centrifugar, el plasma rico en plaquetas reservado, y luego retire el plasma y lave el pellet celular una vez con cinco mililitros de PBS estéril suplementado con un microgramo por mililitro de prostaglandina I dos resuspender el pellet de plaquetas en un mililitro de prostaglandina I PBS fresca dos tampones para placar los monocitos aislados, linfocitos, neutrófilos y plaquetas. Primero cuente las células y llévelas a un volumen adecuado en un medio de ensayo XF para permitir una densidad de siembra de 2,5 veces 10 a la quinta celda por pocillo en un volumen de 200 microlitros. En una microplaca de cultivo celular XF de 24 pocillos recubierta con célula T para plaquetas, siembra 2,5 veces 10 a las siete células por pocillo en un volumen de 200 microlitros.

Después de hacer girar las células en la placa, lleve los volúmenes finales del pocillo a 660 microlitros con medios XF e incube las placas a 37 grados centígrados durante 30 minutos antes del ensayo XF durante la carga de incubación, 75 microlitros de los reactivos del ensayo en el orden indicado en los puertos de inyección del cartucho del sensor XF. Si se van a obtener mediciones de ráfaga oxidativa, se puede inyectar PMA después de la antimicina, una siguiente carga del puerto de inyección coloque el cartucho en el analizador de flujo extracelular para comenzar el ensayo. Los perfiles bioenergéticos de leucocitos y plaquetas se pueden determinar utilizando el analizador de flujo extracelular Seahorse XF, que mide el consumo de oxígeno en tiempo real en las células de forma no invasiva.

Cada tipo de célula se recubre en la microplaca XF 24 con cinco réplicas, como se muestra en la tabla. Los valores representativos de la ráfaga basal y oxidativa medidos durante el ensayo y las concentraciones medias de proteína por pocillo se demuestran por tipo de célula. Los valores de la tasa de consumo de oxígeno se normalizan al contenido total de proteína en los pocillos correspondientes y se expresan como p moles por minuto por microgramo de proteína. La tasa de consumo basal de oxígeno se establece mediante las tres primeras mediciones.

La oligomicina, un inhibidor de la TP sintasa mitocondrial A se inyecta en el medio XF para estimar la tasa de consumo de oxígeno acoplada a una síntesis de TP y se representa como una tasa de consumo de oxígeno residual vinculada a la tasa de consumo de oxígeno residual menos la tasa de consumo de oxígeno no mitocondrial se puede atribuir a la fuga de protones. La adición del FCCP de desacoplamiento permite determinar la tasa máxima de consumo de oxígeno, seguida de la inyección de antimicina a y un inhibidor de la respiración mitocondrial para medir las fuentes no mitocondriales de consumo de oxígeno. La capacidad de reserva es una medida de la cantidad de trabajo adicional que las mitocondrias pueden realizar bajo una mayor demanda de energía y se puede calcular como la diferencia entre la tasa máxima de respiración y la basal para determinar la capacidad de explosión oxidativa de monocitos y neutrófilos.

Se inyecta el agonista P-M-A-A-P-K-C y el aumento en la tasa de consumo de oxígeno se relaciona con la producción de oxidante por la oxidasa N-A-D-P-H Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tan solo tres horas después de la extracción de sangre, sin incluir el ensayo en sí si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante mantener las condiciones estériles realizando cada paso en una cabina de seguridad biológica y utilizando tampones y medios estériles a temperatura ambiente. Siguiendo este procedimiento, podemos hacer otros protocolos, como el análisis por fax para determinar la pureza de las células, el estado de activación de los leucocitos, y también para determinar la bioenergética celular en las subpoblaciones de leucocitos.

Después de ver este video, ahora debería tener una idea bastante clara sobre cómo preparar plaquetas, linfocitos, monocitos y neutrófilos, y ponerlos en el caballito de mar y medir el estallido oxidativo y la función mitocondrial a partir de estos datos. A continuación, puede analizar sus poblaciones de pacientes y determinar cómo está cambiando su bioenergética en tiempo real. No olvide que trabajar con muestras de pacientes humanos puede ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, debe usar equipo de protección personal, así como usar un gabinete de seguridad biológica durante este procedimiento.