Name: Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprende a medir cambios longitudinales en la rigidez de la matriz extracelular en modelos de tumores 3D utilizando microrreología de partículas. Este método no destructivo permite analizar la mecánica tumoral en el tiempo.

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Agradecemos la compartición de código abierto de MATLAB código partícula de seguimiento proporcionado por Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), junto con el código IDL antes y una extensa documentación proporcionada por John C. Crocker y Eric R. Weeks. Este trabajo fue posible gracias al financiamiento del Instituto Nacional del Cáncer (NCI / NIH), K99CA155045 y R00CA155045 (PI: JPC).

1. Esferoides tumorales cultivo <ol><li> Mezclar 10 ml de agua de grado de cultivo de células con 0,1 g de agarosa para obtener una solución de agarosa al 1%. </li><li> Solución de agarosa de calor por encima de 70 ° C (más o menos 14 segundos en un horno de microondas estándar o mediante el uso de una placa de calentamiento) antes de alícuotas de 40 l de solución de agarosa en un pocillo en una placa de 96 pocillos. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante al menos 1 h mientras la cosecha de las células utilizando técnicas estándar. </li><li> Utilice un hemocitómetro para determinar la concentración de células en la suspensión. </li><li> Diluir la suspensión de células a 1000 células / ml y añadir 100 l de esta dilución a la bien que contiene el lecho de agarosa curado. </li><li> Colocar la muestra en un agitador durante la noche en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Quitar la muestra de coctelera y añadir 100 ml de medio de cultivo celular. </li><li> Incubar esferoides hasta que se alcanza el diámetro deseado. Por ejemplo, después de 9 días, un spHeroid habrá aproximadamente 450 m de diámetro. Durante este tiempo, el medio de crecimiento fresco puede ser añadido a los pozos de aspiración, pero se debe evitar ya que esto resultará en la eliminación del esferoide. </li></ol> 2. Preparación esferoides tumorales 3D incrustados en ECM <ol><li> Preparar una estación de trabajo con los materiales necesarios dentro de una campana de flujo laminar. </li><li> Prepare una mezcla diluida de 1 m de diámetro sondas trazadores fluorescentes modificado carboxilato añadiendo sondas 2 piezas de stock (2% de sólidos) a 25 partes de agua estéril. </li><li> Quitar una botella de 3,1 mg / ml de colágeno bovino de la nevera y colóquelo sobre hielo. </li><li> Alícuota de 125 l de colágeno en un vacío vial de 2 ml. </li><li> Añadir 50 l de solución de sonda de trazador diluido al vial que contiene el colágeno y agitar brevemente para distribuir sondas. </li><li> Añadir 235 l de medio de cultivo celular apropiado que contiene rojo de fenol (que se convertirá amarillo) para un volumen total de 410 ml y agitar brevemente antes de retirar 205 ml (la mitad del volumen total) y colocándolo en un nuevo vial de 2 ml. Vial 1 contendrá el esferoide tumoral y Vial 2 será una mezcla de control. </li><li> Añadir ~ 2 l de 1 M de NaOH al vial 1 para llevar la solución de nuevo a pH neutro (medios de cultivo que contienen rojo de fenol deben volver a rojo). Tenga en cuenta que esto hará que la mezcla para iniciar el curado si no se mantiene en hielo. Vortex brevemente para mezclar, y luego volver a una rejilla de hielo inmediatamente. NOTA: El esferoide es apenas visible a simple vista después de 9 días de cultivo y su retirada de la cama de agarosa es una tarea delicada. El uso de un microscopio de disección puede ser útil para algunos usuarios. El mantenimiento de la integridad del esferoide durante la transferencia es de suma importancia. </li><li> Con una punta de pipeta de boca ancha, retire suavemente 40 l de los medios de comunicación desde el pozo que contiene el esferoide tumor. Conserve este 40 l, mientras que la realización de la siguiente etapa. </li><li> Compruebe el pozo para ver si el esferoidefue eliminado en el paso anterior. Si lo fuera, añadir los 40 l que contenía el esferoide al vial 1. Si no, coloque los 40 l atrás en el bien y repita el paso anterior. </li><li> Revuelva suavemente Vial 1 (no se arriesgue a vórtex, se puede dañar el esferoide) antes de transferir la mezcla en 60 porciones mu l en tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccionar cada pocillo con un microscopio después de la adición de la mezcla para determinar que bien contiene el esferoide. </li><li> Añadir ~ 2 l 1 M de NaOH y 40 l de medios de cultivo celular a Vial 2 y un vórtex antes de alícuotas 60 l de esta mezcla a un vacío bien en la placa de 96 pocillos y etiquetado como control. </li><li> Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C para curar durante al menos 1 hora. </li></ol> 3. Construir rejilla de puntos muestrales y Tomar un video en cada punto <ol><li> Transfiera la placa de la muestra de la incubadora a la platina del microscopio. Permita 10 minutos para que la muestra equilibrate con la temperatura ambiente si una etapa caliente no está disponible. </li><li> Observar la muestra con lentes de objetivo de baja potencia para asegurarse de que está intacto y listo para la imagen. Determinar la posición del tumor dentro del pozo. </li><li> Decida cuántos puntos de muestra a tomar. Por lo general, 20 puntos de muestreo en cada pocillo, distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide producirán resultados debidamente detalladas. </li><li> Mueva el escenario para cada posición deseada y utilice el microscopio interfaz de software para registrar las coordenadas X e Y (o registro de las coordenadas manualmente en caso de interface de software no está disponible). </li><li> Encienda el microscopio a una lente de objetivo de alta potencia (típicamente 100X), y seleccione el cubo de filtro apropiado para la longitud de onda de excitación de las sondas de rastreo. Use la lista de puntos creados en el paso 3.4 para mover al primer punto de la cuadrícula. </li><li> Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pozo, y luego moverse hacia arriba para encontrar un campo de visión (FOV) que contiene varios trac de enfoqueer sondas. </li><li> Observe el histograma de intensidad y ajustar la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible al tiempo que garantiza que la imagen no se convierte en saturada. </li><li> Obtener una secuencia de vídeo a una velocidad de 20 a 30 milisegundos por cuadro (aproximadamente 800 marcos o 16-24 segundos de longitud se recomienda para proporcionar estadísticas suficientes para el cálculo MSD robusta equilibrio con la necesidad de reducir al mínimo el tiempo de adquisición en cada punto de la malla espacial) y guardar con una convención apropiada. Durante la grabación, no toque el microscopio o una mesa. </li><li> Repita los pasos 3.6 hasta 3.9 por cada punto de muestra en la cuadrícula. </li><li> Repita los pasos 3.3 a 3.10 para cada pozo en el experimento. </li></ol> 4. Análisis de los datos de vídeo para Calcular Propiedades reológicas en cada punto de muestra <ol><li> Copie todos los datos de vídeo a una carpeta de análisis (posiblemente en un equipo diferente). </li><li> Importar datos de imagen en MATLAB u otro software de análisis. NOTE: Amplia documentación relativa al conjunto de MATLAB rutinas de seguimiento de partículas adoptadas aquí está disponible en <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Se recomienda el uso de una función de llamada personalizados para automatizar el procesamiento de múltiples archivos en diferentes posiciones. </li><li> Calibrar el software mediante el análisis de varios fotogramas de vídeo para determinar adecuadamente los parámetros de selección y rechazo (tamaño, de paso de banda, etc) para la identificación de las posiciones del centro de la sonda. Amplia fondo de estos pasos cruciales es descrito por Crocker y Grier. </li><li> Utilice el software para determinar automáticamente cada posición de la sonda para todos los fotogramas de vídeo y luego vincular estas posiciones en las trayectorias. </li><li> Utilice los datos de trayectoria para calcular la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) como una función del tiempo de retraso, asegurándose de aplicar el factor de calibración espacial apropiada (m por píxel) para la lente de objetivo específico, cualquier pixel binning, etc (típicamente llevadoen los metadatos). </li><li> Calcular G * (usando la generalizada relación de Stokes-Einstein tienen en cuenta los límites de aplicabilidad de GSER para una determinada muestra de 24,28,43. Alternativamente, los usuarios pueden querer interpretar propiedades ECM directamente desde MSD simplemente comparando la escala de ley de potencia, meseta valores, índices de heterogeneidad u otros parámetros. </li><li> Repita los pasos 4.2 a 4.6 por cada fov en el experimento. </li><li> Co-registro de datos de posición desde el paso 3.4 con modulii viscoelásticas a una frecuencia particular de interés. Dependiendo del fabricante del microscopio utilizado, este paso puede ser facilitada por una rutina personalizada que lee los metadatos microscopio o posición de los datos pueden ser tabulados manualmente. </li><li> Uso de las funciones de interpolación 3D para generar un mapa de la reología espacial de la ECM. </li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En este protocolo se introduce una estrategia sólida y de aplicación general para el seguimiento longitudinal cambios locales en la rigidez ECM en modelos de tumores en 3D. Tenemos la visión de que esta metodología podría ser adoptada por los biólogos del cáncer y biofísicos interesados ​​en el comportamiento mechanosensitive implicados en la remodelación de la matriz durante el crecimiento del tumor y de los procesos de invasión. La cuantificación precisa de la cinética de degradación de la matriz podría ser particular...

Pues bien, de un creciente cuerpo de evidencia en la literatura que las células cancerosas, al igual que las células epiteliales de mamíferos no malignas, son muy sensibles a las propiedades mecánicas y biofísicas de la matriz extracelular circundante (ECM) y otros componentes del microambiente 1-9. Estudios mecánicos elegantes han proporcionado ideas sobre el papel de la rigidez extracelular como socio de señalización mechanosensitive complejo que regula el comportamiento maligno de crecimiento y la morfogénesis 2,3,10,11. Esta labor se ha visto facilitada en particular, por el desarrollo del 3D en modelos tumorales in vitro que restauran la arquitectura del tejido biológicamente relevante y se pueden cultivar en materiales de andamiaje con la mecánica sintonizables y imágenes de microscopía óptica 12-19. Sin embargo, el otro lado de este cuadro de diálogo mechanoregulatory entre el tumor y el microambiente, a través del cual las células cancerosas, a su vez modificar la reología de su entorno, sigue siendo algomás difíciles de estudiar. Por ejemplo, durante los procesos de invasión, las células en la periferia de un tumor pueden someterse a transición epitelial a mesenquimal (EMT) y aumentar la expresión de metaloproteasas de la matriz (MMPs) que causan la degradación local de la ECM 20-22, que a su vez influye en el comportamiento de crecimiento de mechanosensitive otras células tumorales proximal. A través de una variedad de procesos bioquímicos, células de cáncer de marcar continuamente la rigidez local de su entorno arriba y hacia abajo para adaptarse a diferentes procesos en diferentes momentos. La metodología descrita aquí está motivada por la necesidad de instrumentos de análisis que reportan los cambios locales en la rigidez y el cumplimiento de la MEC durante el crecimiento, que se pueden integrar con modelos de tumores en 3D y correlacionados longitudinalmente con cambios bioquímicos y fenotípicas sin interrumpir la cultura. En busca de una técnica apropiada para aplicar en este contexto, microrheology partícula-tracking (PTM) se perfila como un fuerte candidato.Este método, pionero originalmente por Mason y Weitz 23,24, utiliza el movimiento de las sondas de rastreo incrustados en un fluido complejo reportar el módulo complejo dependiente de la frecuencia de cizalla viscoelástico, G * (ω) a escalas de longitud de micras. Este enfoque general ha sido desarrollado con múltiples variaciones adecuadas para diferentes aplicaciones en-suaves de la Materia Condensada, coloides, la biofísica y la física de polímeros 25-31. PTM tiene ciertas ventajas con respecto a otros métodos, ya que las lecturas de la viscoelasticidad local son proporcionados por formación de imágenes de vídeo no destructivo de las sondas de trazador bioquímicamente inactivos que se incorporan en el momento de preparación de cultivo y permanecen en su lugar durante largos períodos de crecimiento. Esto está en contraste con las medidas estándar de oro con un reómetro de cizalla oscilatoria a granel, lo que necesariamente requiere la terminación de la cultura y de los informes de la reología macroscópica grueso de la muestra en lugar de mediciones puntuales dentro del complejo microenvir tumor 3DAMBIENTE. De hecho, un número de estudios han demostrado la utilidad de la interpretación de las mediciones de movimientos de la sonda trazador en o alrededor de las células cancerosas o no cancerosas para medir deformaciones asociadas con la migración celular 32, la tensión mecánica inducida por un esferoide expansión 33, reología intracelular 34,35, y para asignar cargas mecánicas en la ingeniería de tejidos 36, y la relación entre el tamaño de los poros y la velocidad de invasión 37. Otras técnicas adecuadas para microrheology, tales como la microscopía de fuerza atómica (AFM) se pueden implementar, pero principalmente para sondear los puntos en la superficie de la muestra y también pueden plantear problemas de esterilidad de la cultura que complican las mediciones longitudinales 38. Aquí se describe un protocolo integral métodos para el crecimiento de esferoides tumorales 3D adecuados para su transferencia a ECM con sondas fluorescentes incrustados para vídeo partícula de seguimiento y análisis de métodos para mapear fiablemente espacial que abarcacambios en microrheology largo del tiempo en la cultura. En la presente aplicación, modelos de tumores 3D se cultivan en formato de múltiples pocillos con vistas a la incorporación de mediciones microrheology con otros ensayos tradicionales (por ejemplo, citotoxicidad) que este formato es propicio para. En esta ilustración representativa de esta metodología de cultivo in vitro esferoides 3D utilizando células PANC-1, una línea celular de cáncer de páncreas establecidos conocidos para formar esferoides 39, pero todas las mediciones descritas en este documento son ampliamente aplicables al estudio de tumores sólidos usando una variedad de líneas celulares adecuados para el cultivo en 3D. Debido a que este método se basa formación de imágenes de sí que es ideal para el co-registro de los datos microrheology alta resolución con grandes campos de luz transmitida de vista que informan de cambios en el crecimiento celular, la migración y el fenotipo. La implementación de PTM integrado con microscopía de luz transmitida de esta manera asume el posicionamiento reproducible de los qu platina del microscopioich suele estar disponible en los microscopios biológicos epifluorescencia widefield comercial motorizados. El protocolo desarrollado a continuación se puede implementar con cualquier microscopio biológico de fluorescencia automatizado razonablemente equipadas. Este es un método intensivo de datos inherente, lo que requiere la adquisición de gigabytes de datos de microscopía de vídeo digitales para el procesamiento fuera de línea. En el siguiente protocolo, Protocolo 1 se refiere a la preparación inicial de esferoides tumorales que se describe aquí el uso de superposición en agarosa, pero podría estar sustituidos con una variedad de otros métodos tales como la gota que cuelga 40, o cultivo rotatorio 41 técnicas. Protocolo 2 se describe el proceso de integración de esferoides en una estructura de colágeno, aunque, alternativamente, in vitro tumores en 3D podrían ser cultivadas mediante encapsulación o la incrustación de células resuspendidas en ECM 12,15, en lugar de esferoides no adherentes individuales pre-formadas. Protocolos posteriores describen procedimientos para obtaining mediciones microrheology tiempo de resolverse mediante la adquisición y procesamiento de datos de microscopía de vídeo, respectivamente. El procesamiento de datos se describe utilizando MATLAB, haciendo uso de las rutinas de código abierto para el PTM construido en algoritmos descritos originalmente por Crocker y Grier 42, que también se han desarrollado ampliamente para diferentes plataformas de software (ver http://www.physics.emory.edu/ ~ semana / idl /).

<table><tbody><tr><td>Colágeno bovino tipo 1</td><td>BD Biosciences, San José, CA</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>Cultivo celular de tipo americano, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>u otro tipo de célula apropiado</td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes</td> Life <td>Technologies, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Pescador de agarosa</td><td> Biorreactivos, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>Placas de imagen de 96 pocillos</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>o medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>apropiados Zeiss Microscopio AxioObsever</td><td>Zeiss, Oberkochen, Alemania</td><td></td><td>Incluye cámara de alta velocidad y software de imagen</td></tr><tr><td>software MATLAB</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medida longitudinal de la matriz extracelular rigidez en modelos de tumores en 3d utilizando partículas de seguimiento microrheology

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

La mecánica microambiente se ha demostrado que actúa como un regulador crucial del comportamiento de crecimiento del tumor y de señalización, que es en sí remodelado y modificadas como parte de un conjunto de, interacciones de dos vías mechanosensitive complejos. Si bien el desarrollo de modelos de tumores en 3D biológicamente relevantes han facilitado estudios mecánicos sobre el impacto de la reología de la matriz en el crecimiento del tumor, el problema inverso de la cartografía de los cambios en el entorno mecánica inducida por tumores sigue siendo un reto. Aquí, se describe la aplicación de partículas de seguimiento de microrheology (PTM) en conjunción con modelos 3D de cáncer de páncreas como parte de un enfoque sólido y viable para el seguimiento longitudinalmente cambios físicos en el microambiente del tumor, in situ. La metodología descrita aquí se integra un sistema de preparación in vitro en modelos 3D incrustados en un modelo de matriz extracelular (ECM) andamio de colágeno de tipo I con sondas marcadas con fluorescencia distribuidos de manera uniforme para POsición y mediciones microrheology dependientes del tiempo a lo largo de la muestra. tumores in vitro están chapados y probaron en condiciones paralelas utilizando placas de imagen de múltiples pocillos. Sobre la base de los métodos establecidos, videos de los movimientos de la sonda de rastreo se transforman a través de la Relación Generalizado Stokes Einstein (GSER) para reportar el módulo de cizallamiento complejo viscoelástico dependiente de la frecuencia, G * (ω). Debido a que este enfoque es a base de formación de imágenes, caracterización mecánica también se proyecta sobre grandes campos espaciales de luz transmitida a reportar simultáneamente cambios cualitativos en el tamaño del tumor 3D y fenotipo. Los resultados representativos que muestran contraste respuesta mecánica en sub-regiones asociadas con degradación de la matriz localizada inducida por invasión-, así como la calibración del sistema, se presentan los datos de validación. También se presentan los resultados no deseados de los errores experimentales comunes y solución de problemas de estos temas. El formato de chapado cultura 3D de 96 bien implementado en este protocolo es conducive a la correlación de las mediciones microrheology con ensayos de cribado terapéuticos o de imagen molecular para obtener nuevos conocimientos sobre el impacto de los tratamientos o estímulos bioquímicos en el microambiente mecánico.

Para verificar la validez de G * (ω) mediciones en las posiciones localizadas dentro de un complejo microambiente tumoral modelo, se realizaron dos experimentos iniciales de validación. En primer lugar, hemos tratado de validar nuestras medidas contra el &quot;estándar de oro&quot; de reometría cizalla oscilatoria granel. Hemos preparado muestras idénticas de matriz de colágeno (sin células) a una concentración de 1,0 colágeno mg / ml. Estas muestras se probaron con un reómetro mayor (TA Instruments AR-G2, util...

Microrheology de partículas de seguimiento se puede utilizar para cuantificar de forma no destructiva y espacialmente mapa cambios en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos de tumores en 3D.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios longitudinales en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos tridimensionales de cáncer. Esto se logra primero recolectando células cancerosas y cultivando el esteroide tumoral mediante un método adecuado hasta que alcancen el tamaño deseado. El segundo paso consiste en embeber el esteroide tumoral en colágeno u otra matriz extracelular apropiada.A continuación, se construye la cuadrícula de puntos de muestra y se registra un video en cada punto. El paso final consiste en analizar los datos de video y calcular y coregistrar propiedades lógicas reales en cada punto espacial. En definitiva, este protocolo utiliza el análisis de las trayectorias de las sondas trazadoras para cuantificar longitudinalmente los cambios espaciales en la mecánica de la matriz extracelular de manera no destructiva.La idea consiste en que, al combinar mediciones basadas en imágenes del entorno extracelular mediante radiología con modelos tridimensionales de tumores in vitro que restauran las interacciones de la matriz extracelular, este enfoque puede proporcionar una visión cuantitativa de los cambios dependientes del tiempo en el microentorno mecánico que acompañan a los procesos de crecimiento e invasión tumoral, así como a la respuesta al tratamiento. El método mostrado en este video adopta un enfoque de superposición de aros para generar órganoides tridimensionales no adherentes a partir de la línea celular de cáncer pancreático establecida pan uno. Para comenzar, mezcle 10 mililitros de agua grado cultivo celular con 0,1 gramos de aros para obtener una solución de aros al 1 %.Caliente la solución de aros a más de 70 grados Celsius antes de alícuotar. Aliqueote 40 microlitros de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora, recolecte las células cancerosas mediante tripsina y prepare una suspensión de células individuales antes de diluir la suspensión celular a 1000 células por mililitro. Añada 100 microlitros de esta dilución al pocillo que contiene el lecho de aros curado.Coloque la muestra en un agitador durante la noche en un incubador ajustado a 37 grados Celsius y 5%CO2 tras la incubación. Retire la muestra del agitador y agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular; proceda a incubar el esteroide resultante hasta que alcance el diámetro deseado. Por ejemplo, tras nueve días, una placa, un esteroide tendrá aproximadamente 450 micrones de diámetro.Para comenzar, prepare una estación de trabajo dentro de una cabina de flujo laminar con dos viales de dos mililitros. El vial uno contendrá el esteroide tumoral y el vial dos será un control libre de células. Prepare una mezcla diluida de sondas trazadoras fluorescentes modificadas con carboxilato y de un micrómetro de diámetro agregando dos partes de la solución madre de sondas a 25 partes de agua estéril.Saque un frasco de colágeno bovino de 3,1 miligramos por mililitro del refrigerador y colóquelo en hielo. Aliquote 125 microlitros de colágeno, seguidos de 50 microlitros de solución diluida del sonda trazadora en el vial uno y vortexe brevemente para distribuir las sondas. A continuación, agregue 235 microlitros de medio de cultivo celular apropiado que contenga rojo de fenol para obtener un volumen total de 410 microlitros, y vortexe brevemente antes de retirar 205 microlitros y colocarlos en el vial dos. Luego, agregue aproximadamente dos microlitros de hidróxido de sodio uno molar al vial.Uno para llevar la solución de vuelta al pH neutro; agitar brevemente en vórtex para mezclar. Luego, regresar inmediatamente al soporte de hielo para que la mezcla no comience a curarse. Retire suavemente 40 microlitros de medio del pocillo que contiene el esteroide tumoral.Guarde estos 40 microlitros mientras realiza el siguiente paso. Revise el pocillo para verificar si el esteroide se eliminó en el paso anterior. Si no es así, coloque los 40 microlitros nuevamente en el pocillo y repita el paso anterior.Si fue así, agregue los 40 microlitros que contienen el esteroide al vial uno. Agite suavemente el vial uno antes de transferir la mezcla en porciones de 60 microlitros a tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccione cada pocillo con un microscopio después de agregar la mezcla para determinar cuál contiene el esteroide. Luego, agregue aproximadamente dos microlitros de hidróxido de sodio uno molar y 40 microlitros de medio de cultivo celular al vial dos y vortexee antes de Ali.Colocar 60 microlitros de esta mezcla en un pocillo vacío de la placa de 96 pocillos y etiquetarlo como control libre de células. Coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius para curar durante al menos una hora y construir una cuadrícula de puntos de muestra. Primero, transfiera la placa de muestras del incubador al portaobjetos del microscopio.Deje 10 minutos para que la muestra se equilibre a temperatura ambiente si no se dispone de una platina calefaccionada. Observe la muestra con objetivos de baja potencia para asegurarse de que esté intacta y lista para la obtención de imágenes. Determine la posición del tumor dentro del pocillo y documente esto con una imagen de luz transmitida para la posterior co-registración espacial.Típicamente, 20 puntos de muestra en cada pocillo distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide S producirán resultados adecuadamente detallados. Mueva la platina a cada posición deseada y utilice el software de interfaz del microscopio para registrar las coordenadas XNY. Cambie el microscopio a un objetivo de alto aumento y seleccione el cubo de filtros adecuado para la longitud de onda de excitación del trazador.Utilizando la lista de puntos creados, desplácese al primer punto de la cuadrícula. Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pocillo antes de moverse hacia arriba. Para encontrar un campo de visión que contenga varios trazadores enfocados.Observe el histograma de intensidad y ajuste la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible, asegurándose de que la imagen no se sature. Obtenga una secuencia de video a una velocidad de cuadro de 20 a 30 milisegundos por cuadro y guárdela con una convención de nomenclatura adecuada. Durante la grabación, no toque el microscopio ni la mesa.Repita la grabación para cada punto de muestra en la cuadrícula. Luego, continúe repitiendo el proceso para construir una cuadrícula para cada pocillo del experimento y repita todo el procedimiento para cada momento temporal durante el seguimiento longitudinal.Para comenzar el análisis de datos, copie todos los datos de video en una carpeta de análisis. Importe los datos de imagen a MATLAB o a otro software de análisis.Calibre el software analizando varios fotogramas del video para determinar adecuadamente los parámetros de selección y rechazo para identificar las posiciones centrales de la sonda. Luego, utilice el software para determinar automáticamente la posición de cada sonda en todos los fotogramas del video y, a continuación, vincule estas posiciones en trayectorias. Utilice los datos de trayectoria para calcular el desplazamiento cuadrático medio o MSD en función del tiempo de retardo, asegurándose de aplicar el factor de calibración espacial adecuado para el objetivo específico o para cualquier pixelado.Calcule G Star utilizando la relación generalizada de Stokes Einstein, teniendo en cuenta los límites de aplicabilidad de la relación generalizada de Stokes Einstein para una muestra particular. Repita los pasos del análisis para cada campo de visión en el experimento. Coregistre los datos de posición con el módulo viscoelástico I a una frecuencia específica de interés, dependiendo del fabricante del microscopio utilizado.Este paso puede facilitarse mediante una rutina personalizada, que lee los metadatos del microscopio, o los datos de posición pueden tabularse manualmente. Se adquieren secuencias de video en múltiples posiciones espaciales dentro de un pocillo representativo que contiene un nódulo tumoral tridimensional y se vinculan para proporcionar un mapa micro radiológico espacial de la muestra cuando se monitorean longitudinalmente poblaciones de células en la periferia de la placa. Uno de los esteroides utilizados en este ejemplo degradará espontáneamente las fibras de colágeno circundantes e invadirá la matriz extracelular en pocos días.En este ejemplo, la co-registración de micro ología proporciona una lectura cuantitativa de la invasión evidente hacia la matriz que ocurre a la izquierda, pero no a la derecha del esteroide. El monitoreo longitudinal de estas regiones espaciales dispares muestra una disminución en la componente real del módulo complejo de cizalladura viscoelástica de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud, concomitante con la invasión. Se muestran datos completos dependientes de la frecuencia que contrastan las propiedades reológicas del material en la región uno y la región dos al cuarto día.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se debe tener cuidado para evitar errores comunes durante el análisis de las trayectorias de la sonda que podrían llevar a conclusiones inadecuadas. Animamos a los lectores a consultar la bibliografía sobre MTPO citada aquí, que aborda consideraciones como la deriva de la muestra y la interpretación de la heterogeneidad. Este procedimiento puede combinarse con imágenes fluorescentes longitudinales o terminales adicionales para responder otras preguntas, como cómo la remodelación mecánica se correlaciona con eventos clave de señalización o la respuesta citotóxica frente a una intervención.

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Bioingeniería

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Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas

La microrreología de seguimiento de partículas investiga la viscoelasticidad de los materiales. Aquí, la técnica se utiliza para determinar la viscoelasticidad, el cumplimiento de la fluencia y las funciones efectivas de reticulación de diferentes componentes de la matriz de una biopelícula bacteriana. La matriz está formada por sustancias poliméricas secretadas por las bacterias y sus componentes determinan la estructura de la biopelícula y sus propiedades mecánicas.

En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Aquí se explica un protocolo para modelar el microambiente biofísico donde la reticulación y el aumento de la rigidez de la membrana basal (BM) inducida por productos finales de glicación avanzada (AGEs) tiene relevancia patológica.

Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas

Hemos desarrollado un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para sondear el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes. Este análisis es compatible con citometría de flujo, inmunotinción y microscopía de fuerza de tracción, lo que permite mediciones cuantitativas de las interacciones biomecánicas entre las células y su matriz extracelular, las bacterias patógenas.

Un ensayo de base poliacrilamida formato multi-bien para estudiar el efecto de la rigidez de la matriz extracelular en la infección bacteriana de las células adherentes

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.

Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural

Aprende a medir cambios longitudinales en la rigidez de la matriz extracelular en modelos de tumores 3D utilizando microrreología de partículas. Este método no destructivo permite analizar la mecánica tumoral en el tiempo.

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology (Video) | JoVE Journal

Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

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