Medida longitudinal de la matriz extracelular Rigidez en modelos de tumores en 3D utilizando partículas de seguimiento Microrheology

El objetivo general de este procedimiento es medir los cambios longitudinales en las propiedades mecánicas de la matriz extracelular en modelos tridimensionales de cáncer. Esto se logra primero recolectando células cancerosas y cultivando el esteroide tumoral mediante un método adecuado hasta que alcancen el tamaño deseado. El segundo paso consiste en embeber el esteroide tumoral en colágeno u otra matriz extracelular apropiada.

A continuación, se construye la cuadrícula de puntos de muestra y se registra un video en cada punto. El paso final consiste en analizar los datos de video y calcular y coregistrar propiedades lógicas reales en cada punto espacial. En definitiva, este protocolo utiliza el análisis de las trayectorias de las sondas trazadoras para cuantificar longitudinalmente los cambios espaciales en la mecánica de la matriz extracelular de manera no destructiva.

La idea consiste en que, al combinar mediciones basadas en imágenes del entorno extracelular mediante radiología con modelos tridimensionales de tumores in vitro que restauran las interacciones de la matriz extracelular, este enfoque puede proporcionar una visión cuantitativa de los cambios dependientes del tiempo en el microentorno mecánico que acompañan a los procesos de crecimiento e invasión tumoral, así como a la respuesta al tratamiento. El método mostrado en este video adopta un enfoque de superposición de aros para generar órganoides tridimensionales no adherentes a partir de la línea celular de cáncer pancreático establecida pan uno. Para comenzar, mezcle 10 mililitros de agua grado cultivo celular con 0,1 gramos de aros para obtener una solución de aros al 1 %.

Caliente la solución de aros a más de 70 grados Celsius antes de alícuotar. Aliqueote 40 microlitros de la solución en cada pocillo de una placa de 96 pocillos e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora, recolecte las células cancerosas mediante tripsina y prepare una suspensión de células individuales antes de diluir la suspensión celular a 1000 células por mililitro. Añada 100 microlitros de esta dilución al pocillo que contiene el lecho de aros curado.

Coloque la muestra en un agitador durante la noche en un incubador ajustado a 37 grados Celsius y 5%CO2 tras la incubación. Retire la muestra del agitador y agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular; proceda a incubar el esteroide resultante hasta que alcance el diámetro deseado. Por ejemplo, tras nueve días, una placa, un esteroide tendrá aproximadamente 450 micrones de diámetro.

Para comenzar, prepare una estación de trabajo dentro de una cabina de flujo laminar con dos viales de dos mililitros. El vial uno contendrá el esteroide tumoral y el vial dos será un control libre de células. Prepare una mezcla diluida de sondas trazadoras fluorescentes modificadas con carboxilato y de un micrómetro de diámetro agregando dos partes de la solución madre de sondas a 25 partes de agua estéril.

Saque un frasco de colágeno bovino de 3,1 miligramos por mililitro del refrigerador y colóquelo en hielo. Aliquote 125 microlitros de colágeno, seguidos de 50 microlitros de solución diluida del sonda trazadora en el vial uno y vortexe brevemente para distribuir las sondas. A continuación, agregue 235 microlitros de medio de cultivo celular apropiado que contenga rojo de fenol para obtener un volumen total de 410 microlitros, y vortexe brevemente antes de retirar 205 microlitros y colocarlos en el vial dos. Luego, agregue aproximadamente dos microlitros de hidróxido de sodio uno molar al vial.

Uno para llevar la solución de vuelta al pH neutro; agitar brevemente en vórtex para mezclar. Luego, regresar inmediatamente al soporte de hielo para que la mezcla no comience a curarse. Retire suavemente 40 microlitros de medio del pocillo que contiene el esteroide tumoral.

Guarde estos 40 microlitros mientras realiza el siguiente paso. Revise el pocillo para verificar si el esteroide se eliminó en el paso anterior. Si no es así, coloque los 40 microlitros nuevamente en el pocillo y repita el paso anterior.

Si fue así, agregue los 40 microlitros que contienen el esteroide al vial uno. Agite suavemente el vial uno antes de transferir la mezcla en porciones de 60 microlitros a tres pocillos separados de una placa de 96 pocillos. Inspeccione cada pocillo con un microscopio después de agregar la mezcla para determinar cuál contiene el esteroide. Luego, agregue aproximadamente dos microlitros de hidróxido de sodio uno molar y 40 microlitros de medio de cultivo celular al vial dos y vortexee antes de Ali.

Colocar 60 microlitros de esta mezcla en un pocillo vacío de la placa de 96 pocillos y etiquetarlo como control libre de células. Coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius para curar durante al menos una hora y construir una cuadrícula de puntos de muestra. Primero, transfiera la placa de muestras del incubador al portaobjetos del microscopio.

Deje 10 minutos para que la muestra se equilibre a temperatura ambiente si no se dispone de una platina calefaccionada. Observe la muestra con objetivos de baja potencia para asegurarse de que esté intacta y lista para la obtención de imágenes. Determine la posición del tumor dentro del pocillo y documente esto con una imagen de luz transmitida para la posterior co-registración espacial.

Típicamente, 20 puntos de muestra en cada pocillo distribuidos en anillos concéntricos alrededor del esferoide S producirán resultados adecuadamente detallados. Mueva la platina a cada posición deseada y utilice el software de interfaz del microscopio para registrar las coordenadas XNY. Cambie el microscopio a un objetivo de alto aumento y seleccione el cubo de filtros adecuado para la longitud de onda de excitación del trazador.

Utilizando la lista de puntos creados, desplácese al primer punto de la cuadrícula. Ajuste el enfoque para encontrar el fondo del pocillo antes de moverse hacia arriba. Para encontrar un campo de visión que contenga varios trazadores enfocados.

Observe el histograma de intensidad y ajuste la intensidad y el tiempo de exposición para obtener el mayor rango dinámico posible, asegurándose de que la imagen no se sature. Obtenga una secuencia de video a una velocidad de cuadro de 20 a 30 milisegundos por cuadro y guárdela con una convención de nomenclatura adecuada. Durante la grabación, no toque el microscopio ni la mesa.

Repita la grabación para cada punto de muestra en la cuadrícula. Luego, continúe repitiendo el proceso para construir una cuadrícula para cada pocillo del experimento y repita todo el procedimiento para cada momento temporal durante el seguimiento longitudinal.

Para comenzar el análisis de datos, copie todos los datos de video en una carpeta de análisis. Importe los datos de imagen a MATLAB o a otro software de análisis.

Calibre el software analizando varios fotogramas del video para determinar adecuadamente los parámetros de selección y rechazo para identificar las posiciones centrales de la sonda. Luego, utilice el software para determinar automáticamente la posición de cada sonda en todos los fotogramas del video y, a continuación, vincule estas posiciones en trayectorias. Utilice los datos de trayectoria para calcular el desplazamiento cuadrático medio o MSD en función del tiempo de retardo, asegurándose de aplicar el factor de calibración espacial adecuado para el objetivo específico o para cualquier pixelado.

Calcule G Star utilizando la relación generalizada de Stokes Einstein, teniendo en cuenta los límites de aplicabilidad de la relación generalizada de Stokes Einstein para una muestra particular. Repita los pasos del análisis para cada campo de visión en el experimento. Coregistre los datos de posición con el módulo viscoelástico I a una frecuencia específica de interés, dependiendo del fabricante del microscopio utilizado.

Este paso puede facilitarse mediante una rutina personalizada, que lee los metadatos del microscopio, o los datos de posición pueden tabularse manualmente. Se adquieren secuencias de video en múltiples posiciones espaciales dentro de un pocillo representativo que contiene un nódulo tumoral tridimensional y se vinculan para proporcionar un mapa micro radiológico espacial de la muestra cuando se monitorean longitudinalmente poblaciones de células en la periferia de la placa. Uno de los esteroides utilizados en este ejemplo degradará espontáneamente las fibras de colágeno circundantes e invadirá la matriz extracelular en pocos días.

En este ejemplo, la co-registración de micro ología proporciona una lectura cuantitativa de la invasión evidente hacia la matriz que ocurre a la izquierda, pero no a la derecha del esteroide. El monitoreo longitudinal de estas regiones espaciales dispares muestra una disminución en la componente real del módulo complejo de cizalladura viscoelástica de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud, concomitante con la invasión. Se muestran datos completos dependientes de la frecuencia que contrastan las propiedades reológicas del material en la región uno y la región dos al cuarto día.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que se debe tener cuidado para evitar errores comunes durante el análisis de las trayectorias de la sonda que podrían llevar a conclusiones inadecuadas. Animamos a los lectores a consultar la bibliografía sobre MTPO citada aquí, que aborda consideraciones como la deriva de la muestra y la interpretación de la heterogeneidad. Este procedimiento puede combinarse con imágenes fluorescentes longitudinales o terminales adicionales para responder otras preguntas, como cómo la remodelación mecánica se correlaciona con eventos clave de señalización o la respuesta citotóxica frente a una intervención.