Name: La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-21T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende a encapsular maquinaria de transcripción y traducción en vesículas lipídicas para construir imitadores celulares. Este método sencillo y económico permite monitorear la producción de proteínas in vitro mediante microscopía.

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Los autores agradecen a la Fundación Armenise-Harvard, la Marie-Curie Trentino COFUND (ACS), la Provincia Autónoma de Trento (Ecomm) y CIBIO de financiación.

1. Preparación de la plantilla de ADN <ol><li> Purificar plásmido a partir de una cepa de laboratorio estándar de E. coli, tales como E. coli DH5a o Nova azul con un kit comercial. Alternativamente, un producto de la PCR lineal se puede purificar de manera similar con un kit comercial. Eluir el ADN con H 2 O solamente. </li><li> Fenol-cloroformo extracto de la solución de ADN 26. </li><li> Determinar la concentración de ADN y la pureza, por ejemplo, mediante la absorbancia UV u otros métodos adecuados. Es importante la utilización de ADN altamente puro para una eficiente transcripción-traducción. </li></ol> 2. Preparación de la película delgada de lípidos <ol><li> Pesar el polvo de lípido seca y se disuelve en el disolvente. Para 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), soluciones madre se prepararon en cloroformo a una concentración de 40 mg / ml. Nota: Disolventes orgánicos siempre deben manipularse con pipetas de vidrio y botellas. En otras palabras, nunca debe ser utilizado plástico. S Storesoluciones tac, en botellas de aire ajustados resistente a los disolventes de vidrio ámbar a -20 ° C, preferiblemente en atmósfera de argón. </li><li> Alícuota de 12 mol POPC (220 l de 40 mg / ml de solución madre) en un matraz de fondo redondo de 5 ml. </li><li> Se evapora el disolvente con un evaporador rotatorio (Figura 1) para generar la película delgada de lípido. <ol><li> Fije firmemente el matraz de fondo redondo al tubo de destilación con un clip circular y comenzar la rotación del matraz. </li><li> Iniciar la circulación de agua a través del serpentín del condensador. El uso de un baño de calor no es necesario, porque cloroformo tiene un bajo punto de ebullición de 61,2 ° C a la presión atmosférica normal. </li><li> Asegúrese de que el sistema está abierto a la atmósfera por la comprobación de que la llave de paso está abierta. Encienda la bomba de vacío y cierre lentamente la llave de paso para aplicar el vacío al sistema. </li><li> Una película delgada de lípido se deposita sobre las paredes del matraz de fondo redondo durante la evaporación rotatorio formando una película opacaque es visible por el ojo. Deje que la evaporación rotatoria continuará por 0.5-2 horas. Para detener el proceso, suelte lentamente la presión de vacío, detener la rotación, y retire el matraz de fondo redondo. </li></ol></li></ol> 3. La resuspensión de lípidos y homogeneización Vesícula <ol><li> Añadir 1 ml 18.2 mW H 2 O a la película lipídica delgada directamente en el matraz de fondo redondo. Vórtice vigorosamente la solución a la velocidad máxima, aproximadamente 3.200 rpm, hasta que la película lipídica se separa de la copa, que es observable por el ojo. </li><li> Transferir la dispersión de lípidos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. </li><li> Puesta en marcha de un anillo de soporte para mantener un homogeneizador con una punta de 5 mm. Coloque un soporte debajo de la microcentrífuga homogeneizador para sostener con seguridad la dispersión de lípidos. Enjuague el elemento de dispersión del homogeneizador sumergiendo la punta de 18,2 mW H 2 O y en funcionamiento durante unos segundos. </li><li> Coloque el elemento de dispersión directamente en la dispersión de lípidos asegurar ªen la punta no toque el fondo del tubo de microcentrífuga. Mezclar durante 1 minuto a potencia 4 ó 14.000 rpm. </li></ol> 4. Extrusión de vesículas y liofilización <ol><li> Montar las partes de la mini-extrusora (Figura 2), que consta de una carcasa exterior y una tuerca de retención que alberga dos membrana interna de teflón apoya, dos juntas tóricas, y un cojinete de teflón. <ol><li> Coloque las dos juntas tóricas en las ranuras de los soportes de membrana internas. Prehumedecido dos filtros y una membrana de 400 nm. Los filtros se colocarán en contra del Teflon interior de las juntas tóricas con la membrana entre ellos. </li><li> Coloca la membrana apoya en la carcasa exterior extrusora con la membrana rodeada por dos filtros entre en las juntas tóricas. Coloque el cojinete de teflón interior de la carcasa y coloque la tuerca de retención y apriete a mano. </li></ol></li><li> Enjuague dos jeringas y llenar uno con 18,2 mW agua. Inserte las agujas de las jeringas en el pequeño holes en el teflón en cada extremo del conjunto de extrusor. Las agujas deben deslizarse con facilidad, no fuerce las agujas. Asegure la extrusora con las jeringas en la carcasa del extrusor y asegurar. </li><li> Pasar el agua a través de la extrusora empujando lentamente el agua de una jeringa y en el otro. Esto representa un pasaje. Repita el procedimiento para un total de tres pasos necesarios para garantizar que no hay fugas presentes. Retire la jeringa de agua y deseche el agua. </li><li> Llene una jeringa con la muestra, adjuntar a la extrusora, y pasar lentamente la solución de la vesícula a través de la membrana como se describe anteriormente en el paso 4.3. Repita 10 veces para un total de 11 pasajes. A medida que avanza el proceso de extrusión, la muestra se convertirá en menos turbia y más fácil de empujar a través de la membrana. Una disminución repentina en la resistencia, sin embargo, por lo general indica una ruptura de la membrana. </li><li> Transferir la solución vesícula extruido y hacer 40 alícuotas de las vesículas en tubos de microcentrífuga.Congelación cada alícuota en cualquier hielo seco o nitrógeno líquido. </li><li> Liofilizar cada alícuota con un evaporador centrífugo durante la noche a 30 ° C. Guarde las vesículas vacías liofilizadas a -20 ° C. </li></ol> 5. Encapsulación de transcripción-traducción Machinery <ol><li> Mezclar los componentes de la reacción de transcripción-traducción y añadir 20 unidades de inhibidor de RNasa. Incubar en hielo. </li><li> Añadir la plantilla de ADN. Para una reacción de control, 250 ng de un plásmido de codificación mVenus o una proteína fluorescente similares detrás de un promotor transcripcional T7 y una fuerte E. Se recomienda sitio de unión a ribosoma coli. </li><li> Llevar el volumen final a 25 l de agua libre de RNasa. </li><li> Hidratar una alícuota de vesículas liofilizadas (del paso 4.6) con 10 l de la reacción montado en el paso 5.3. Vortex brevemente la mezcla hasta que se vuelven a suspender las vesículas. Esto debería tomar menos de 30 segundos. </li><li> Incubar la reacción en hielo durante 30 min para permitir que las vesículas se hinchen. </li><li> Diluir la mezcla de vesículas 20 veces hasta un volumen final de 30 l mediante la adición de 1,5 l de vesículas en 27,0 l de 50 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,4 y 1,5 l de 20,2 mg / ml de proteinasa K. DNasa y RNasa también se puede añadir en este punto como una alternativa a la proteinasa K para degradar material de extravesicular. </li><li> Incubar durante al menos 2,5 horas a 37 ° C. </li></ol> 6. Microscopía <ol><li> Examine las vesículas y el progreso de la producción de proteínas fluorescentes en diferentes puntos de tiempo. Las vesículas tendrán un diámetro mayor que los 400 nm de tamaño de poro de la membrana utilizada para la extrusión de las vesículas. <ol><li> Preparar una cámara de muestra, colocando una x 5 mm espaciador 20 de silicio sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Pipetear 10 l de vesículas en la cámara de muestra. Coloque una hoja de cubierta de vidrio siliconado sobre la cámara. </li><li> Tenga en cuenta las vesículas con un aceite de dispersión 63X or objetivo similar de campo claro y microscopía de fluorescencia utilizando el conjunto de filtro apropiado para la proteína fluorescente explotados. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque la biología sintética libre de células se encuentra todavía en su infancia, los avances han establecido una base de la cual se pueden realizar sistemas similares a células cada vez más complejas. La reconstitución de la maquinaria de transcripción-traducción de la definición completa de componentes 9 dentro de las vesículas 28 fue particularmente importante para facilitar los esfuerzos posteriores de la construcción artificial sensible ambientalmente cells17, 18. Del mismo modo, los estudios con células artificiales se han utilizado para investigar los procesos evolutivos 4,29,30, los detalles de la mecánica de ARN y la síntesis de proteínas 22,31, las influencias de metabólica load32, 33, y el ensamblaje de las partículas virales 34. Es importante destacar que el conocimiento suficiente ahora existe esa función celular básica se puede reconstituir el interior de vesículas en el laboratorio siguiendo estos informes anteriores y los protocolos descritos en este documento. Además de ser fácil, la encapsulación se describe procedure tiene varios beneficios. Por ejemplo, muchos, alícuotas liofilizadas vesículas vacías se pueden hacer con antelación y se almacenan a -20 ° C para su uso posterior. El protocolo hace moléculas biológicas que no estén sujetos a los disolventes orgánicos, los cambios drásticos de temperatura, o largos períodos de diálisis. Esperamos que la dulzura del procedimiento facilitará la incorporación de componentes adicionales, según sea necesario. Tampoco hemos observado efectos adversos a los cambios de la composición lipídica de la membrana en la encapsulación o la eficiencia de transcripción-traducción. Por lo tanto, los lípidos más susceptibles a la incorporación de proteínas de membrana, morfologías específicas, o visualización concebiblemente podrían ser explotadas. La principal limitación del método descrito es que las vesículas resultantes no son homogéneas en tamaño o lamelaridad. Para muchas aplicaciones, estas dificultades no interfieren con la interpretación de los datos. Sin embargo, si es necesario, los pasos adicionales se pueden incorporar a th estrechadistribución de tamaño de correo y disminuir las capas de membranas, tales como nuevas rondas de extrusión después de la encapsulación, congelación-descongelación, o diálisis 35. Sin duda, los mejores métodos que evitan estos y otros problemas se desarrollarán. Hasta entonces, nos encontramos con el protocolo descrito aquí ser muy adecuado para la construcción de imitadores celulares.

Libre de células, in vitro reacciones de transcripción-traducción y la generación de vesículas de lípidos sintéticos no son nada nuevo. Sin embargo, la combinación de los dos en un celular imitar es significativamente más challenging1-6. E. extractos de células de E. coli con o sin ARN polimerasa de T7 se pueden utilizar como una fuente de maquinaria de transcripción-traducción 7,8. Los extractos celulares se benefician de la presencia de componentes celulares adicionales que pueden facilitar la expresión de la proteína y plegable. Alternativamente, una mezcla de ARN purificados individualmente y moléculas de proteínas, es decir, el sistema PURE 9, se puede utilizar para mediar en la síntesis de proteínas intravesicular 4,10-14. El sistema PURE permite para la construcción de imita celulares totalmente definidos y no sufre de la actividad nucleasa que se encuentra en extractos de células. Prácticamente, esto significa que se requiere mucha menos plantilla de ADN, facilitando así los procesos con baja eficiencia de encapsulación 11 </sup&gt;. Aunque se usa con menos frecuencia, imita celulares pueden ser construidos con extractos de células derivadas de eucariotas cells15. Hasta el momento, cascadas encapsulados codificados genéticamente e imita celulares que detectan el entorno se han reportado 16-18. La forma más sencilla de controlar las reacciones de transcripción-traducción es para medir la fluorescencia o luminiscencia de elementos codificados genéticamente. Típicamente, la luciferasa de luciérnaga 19 o GFP se utilizan, aunque en reacciones in vitro se miden con frecuencia por radiomarcaje. Detección de fluorescencia permite, además, para el seguimiento de las poblaciones de vesículas 20,21 través de métodos basados ​​en citometría, lo que ofrece una idea de la naturaleza estocástica de los procesos biológicos similares. Estos métodos de seguimiento se han utilizado para definir un pequeño conjunto de reglas de diseño y una biblioteca de partes desde la que construir a partir de, incluyendo una colección de proteínas fluorescentes que son compatibles con in in vitro de transcripción-traducción 22, la influencia de la organización genética en la expresión 22, la actividad de los factores sigma 16, y la eficiencia de los terminadores de la transcripción 23. Sin embargo, aún queda mucho que hay que hacer para aumentar la capacidad de construir predecible in vitro, dispositivos codificados genéticamente allí. Hay muchos métodos disponibles para hacer vesículas. Los métodos más comunes dependen de la generación de una película delgada de lípido sobre una superficie de vidrio seguido de resuspensión en solution24 acuosa. Si la solución acuosa contiene maquinaria de transcripción-traducción, por ejemplo, a continuación, una fracción de las vesículas formadas habría contener los componentes necesarios para la producción de proteínas. Sin embargo, la eficiencia de encapsulación de tales métodos es baja, lo que significa que sólo un pequeño porcentaje de vesículas están activos. Muchos de los métodos alternativos caracterizados por mucho más ef encapsulacióniciency explotar la conversión de gotitas de la emulsión agua-en-aceite a las vesículas. Si bien es probable que tales métodos serán comunes en el futuro, en la actualidad estos métodos adolecen de la necesidad de equipo especializado y dan vesículas de membrana con composiciones alteradas 25. Una clara ventaja de agua-en-aceite a los métodos de vesículas es el potencial para controlar lamelaridad membrana. El método descrito en este documento se basa en el protocolo de película delgada de lípido descrito por el laboratorio Yomo 11 con ligeras modificaciones, incluyendo una etapa de homogeneización adicional. Este método es fácil, barato y da vesículas robustos y adecuados para la encapsulación de la maquinaria de transcripción-traducción.

<table><tbody><tr><td>Kit de mini-preparación</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro</td><td>NanoDrop 1000</td><td>NDB767ND</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>770557</td><td>MW 760 g/mol Temperatura de transición -2 & deg; C CAS# 26853-31-6</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836</td><td>anhidro, >99.5%</td></tr><tr><td>Fenol-cloroformo-isoamílico alcohol 25:24:1, para uso en biología molecular</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3803-100mL</td><td>Saturado con 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Grado Biotecnológico Fluka</td><td>496189-1L</td><td>Contiene etanol al 0.5-1.0% v/v como estabilizador</td></tr><tr><td>Botellas de</td> <td>vidrio ámbar marrónVWR</td><td>89043-518</td><td>55X 48 mm</td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td><td>Z563846EU-1EA</td><td>Con gato y baño de agua, junta 29/32 240 V</td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice analógico</td><td>VWR</td><td>945300</td><td>Velocidad 1.000-3.200 rpm</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td><td>3420000</td><td></td></tr><tr><td>Miniextrusora</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Filtros extrusores</td><td>Whatman</td><td>610014</td><td>disco de drenaje 10 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrusora membrana de policarbonato 400 nm</td><td>Whatman</td><td>61007</td><td>policarbonato de poliporos &nbsp;</td></tr><tr><td>Speed vacuum</td><td>Labconco</td><td>7970011</td><td>Centritrap Concentrador de ADN</td></tr><tr><td>PURExpress kit</td><td>New England Biolabs</td><td>NRM #E6800S</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la ARNasa (40.000 U/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0307S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K (20,2 mg/ml)</td><td>Fermentas</td><td>#EO0491</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss Observer Z1with una cámara</td><td></td><td></td>AxioCam MRm</tr><tr><td>RealTime</td><td>CFX96 Sistema de detección de PCR en tiempo real (Biorad)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prensa de silicona para sellar&nbsp; &nbsp;-Molecular Probe</td><td>Life Technologies</td><td>P18174</td><td>Resistente de&nbsp; -25-30 &deg; C</td></tr><tr><td>Diapositivas de cubierta circular de vidrio siliconado</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-231</td><td>&nbsp; &nbsp; Diámetro = 22 mm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la construcción de imitadores celulares

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Como los cambios de interés a partir de moléculas individuales a los sistemas de moléculas, un número cada vez mayor de laboratorios han intentado construir de abajo hacia arriba imita celulares que representan mejor la complejidad de la vida celular. Hasta la fecha, hay una serie de caminos que se pueden tomar para construir imita celulares compartimentados, incluida la explotación de emulsiones de agua en aceite, dispositivos de microfluidos y vesículas. Cada una de las opciones tiene sus ventajas y desventajas específicas. Por ejemplo, emulsiones de agua-en-aceite dan de alta eficiencia de encapsulación, pero no imitan bien la barrera de permeabilidad de las células vivas. La principal ventaja de los métodos descritos en este documento es que todos ellos son fácil y barato de implementar. Maquinaria de transcripción-traducción está encapsulado en el interior de vesículas de fosfolípidos a través de un proceso que explota la instrumentación común, tal como un evaporador centrífugo y un extrusor. Las reacciones se controlan por espectroscopia de fluorescencia. El protocolos puede ser adaptado para la expresión de proteínas recombinantes, la construcción de imitadores celulares, la exploración de los requisitos mínimos para la vida celular, o el montaje de circuitos genéticos.

Microscopía de fluorescencia revela que la fluorescencia sólo se observa en el interior de las vesículas, ya que el material extravesicular se degrada enzimáticamente (Figura 3). Para la expresión de mVenus, intravesicular fluorescencia comienza a ser observado después de 1,5 horas a 37 ° C y llega a la intensidad de la fluorescencia máxima dentro de 6 horas. La temperatura óptima y el tiempo de incubación pueden variar dependiendo de los constructos específicos utilizados. Por ejemplo, diferentes proteínas fluorescentes maduran muy diferente en una manera dependiente de la temperatura. En otras palabras, la observación de la producción de proteínas no depende únicamente de la síntesis de proteínas y el plegamiento, pero también en la formación de cromóforo. En general la síntesis de proteína se puede aumentar mediante la incorporación de proteínas de membrana poros para permitir una afluencia de los componentes agotados necesarios para la transcripción y la traducción 27. Se recomienda llevar a cabo un análogo de transcripción-traducciónción de reacción en ausencia de vesículas para asegurar que la construcción genética explotados es funcional. Esta reacción de control se controla más fácilmente por espectroscopia de fluorescencia en lugar de microscopía. Figura 4 muestra in vitro una reacción de transcripción-traducción de una construcción mVenus codificación. Reacciones no encapsulado dan mucho más altas intensidades de fluorescencia totales que las reacciones intravesiculares similares. Esto es debido a la eficiencia de encapsulación y debido a que el volumen total intravesicular es mucho menor que el volumen extravesicular (es decir, un efecto de dilución). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. El evaporador rotatorio y la bomba de vacío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Figura 2. La carcasa y las partes de la extrusora se muestran por separado. De izquierda a derecha, la jeringa, la tuerca de retención, teflón rodamiento, la membrana interna compatible con anillos negros frente a la otra, la caja exterior extrusora y segunda jeringa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 imágenes de fluorescencia de la producción de proteínas en liposomas mVenus A y C:.. Imágenes de campo claro de vesículas multilamelares después de 1,5 horas y 2,5 horas, y B y# 160, D: La producción de mVenus es visualizado por fluorescencia (color verde) después de 1,5 y 2,5 h, respectivamente. Barra de escala es de 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. En la reacción de control in vitro de no encapsulada en la transcripción y traducción in vitro de mVenus. La intensidad de fluorescencia se midió cada 5 min durante 4 h. Los datos fueron obtenidos con un instrumento de PCR en tiempo real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

En este documento se describen los métodos simples para la preparación de vesículas, la encapsulación de la transcripción y la maquinaria de traducción, y el seguimiento de la producción de proteínas. Los sistemas libres de células resultantes se pueden utilizar como un punto de partida para construir imita celulares cada vez más complejas.

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

El objetivo general de este procedimiento es construir miméticos celulares desde cero mediante la encapsulación de maquinaria de transcripción y traducción en vesículas. Esto se logra primero preparando una película lipídica delgada. A continuación, tras formar las vesículas, se ensamblan los componentes para la transcripción y traducción in vitro.El paso final consiste en colocar el sistema de transcripción y traducción dentro de las vesículas. En última instancia, la actividad del mimético celular puede monitorizarse mediante microscopía. La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos de encapsulación existentes, como las emulsiones de agua y aceite, los dispositivos microreticulares o el proceso de conversión de agua y aceite a vesículas, es que este método es sencillo, económico y produce vesículas robustas con propiedades de permeabilidad muy adecuadas para la construcción de miméticos celulares que aprovechan la función de proteínas codificadas genéticamente.Este método no puede ayudar a explorar áreas clave de la biología sintética libre de células y de abajo hacia arriba, como definir la base mínima de la vida y desarrollar tecnologías no vivas con características similares a las de los seres vivos. Para preparar una película lipídica delgada, comience disolviendo POPC en cloroformo a una concentración de 40 miligramos por mililitro, luego retire una alícuota de 12 micromoles de POPC en un matraz redondo de cinco mililitros. A continuación, utilice una abrazadera circular para fijar firmemente el matraz al tubo de destilación de un evaporador rotatorio.Luego, utilizando la configuración seis, inicie una rotación fuerte y constante del matraz. A continuación, comience a hacer circular el agua a través de la serpentina del condensador. No es necesario calentar el agua porque el cloroformo tiene un punto de ebullición bajo, de 61,2 grados Celsius.A una atmósfera, asegúrese de que el sistema esté abierto a la atmósfera verificando que la llave de paso esté abierta para aplicar simultáneamente el vacío al sistema. Encienda la bomba de vacío mientras cierra lentamente la llave de paso. Deje que la evaporación rotatoria continúe de 0,5 a dos horas después de que el cloroformo ya no sea visible a simple vista.Para detener el proceso, libere lentamente la presión de vacío y detenga la rotación. Retire el matraz y observe la película lipídica delgada y opaca visible en las paredes del matraz para resuspender el lípido. Comience añadiendo un mililitro de agua desionizada de 18,2 megaohmios a la película lipídica delgada en el matraz de fondo redondo y vortex vigorosamente la solución a aproximadamente 3.200 rpm hasta que la película lipídica se desprenda del vidrio.Esto debería tardar aproximadamente un minuto. A continuación, transfiera la dispersión de lípidos a un tubo microcentrífugo de dos mililitros. Prepare un soporte con anillo para sostener un homogenizador equipado con una punta de cinco milímetros y coloque un microcentrífugo.Colóquese debajo del homogeneizador para sostener firmemente la dispersión de lípidos. Luego coloque el elemento dispersor directamente en la dispersión de lípidos, asegurándose de que la punta no toque el fondo del tubo. Homogeneice la dispersión de lípidos durante un minuto.En el nivel de potencia cuatro, ensamble las partes del miniextrusor, que consta de una carcasa externa y una tuerca de retención que aloja dos soportes internos de membrana de teflón, dos anillos tóricos y un cojinete de teflón. Coloque los dos anillos tóricos en las ranuras de los soportes de la membrana interna. Ahora humedezca previamente dos filtros y una membrana con punto de corte de 400 nanómetros, y coloque los filtros húmedos contra el teflón situado en el interior de los anillos tóricos. La membrana con punto de corte de 400 nanómetros se coloca entre los dos filtros.Coloque los soportes de la membrana en la carcasa externa del extrusor, con la membrana rodeada por dos filtros entre las juntas tóricas. Coloque el cojinete de teflón dentro de la carcasa y fíjelo con una tuerca de retención a mano. A continuación, enjuague dos jeringas y llene una con agua de 18,2 megaohmios.Inserte las agujas de las jeringas en los orificios pequeños del teflón en ambos extremos del conjunto del extrusor. Las agujas deben deslizarse fácilmente. No fuerce las agujas.Luego sujete el conjunto en la carcasa del extrusor. Ahora haga pasar el agua a través del extrusor empujando lentamente el agua desde una jeringa hacia la otra. Esto representa un paso.Realice tres pasadas para verificar fugas y luego retire las jeringas. Llene una jeringa nueva con la solución de vesículas. Conéctela al extrusor y pase lentamente la solución a través de la membrana.Repita esto durante un total de 11 pasajes. Con la muestra, gradualmente esta se vuelve menos turbia y más fácil de empujar a través de la membrana. Sin embargo, una disminución repentina en la resistencia generalmente indica una ruptura de la membrana. Cuando finalice, prepare alícuotas de 40 microlitros de la solución de vesículas extrudidas.Congele rápidamente cada alícuota en hielo seco o nitrógeno líquido. Una vez congelada, utilice un evaporador centrífugo para liofilizar cada alícuota durante toda la noche. A 30 grados Celsius, los vesículos vacíos liofilizados se pueden almacenar a menos 20 grados Celsius. Comience la encapsulación mezclando los componentes de la reacción de transcripción y traducción y agregando 20 unidades del inhibidor de ARN.Incube los reactivos en hielo, luego agregue la plantilla de ADN como control, utilice 250 nanogramos de un plásmido que codifique m venus o una proteína fluorescente similar bajo un promotor transcricional T7 y un sitio de unión al ribosoma fuerte de E. coli. Ajuste el volumen final de las reacciones a 25 microlitros. Con agua libre de ARNas, reconstituya ahora 40 microlitros de vesículas liofilizadas en 10 microlitros de la mezcla de reacción.Vortexe brevemente la mezcla hasta que los vesículos se resuspendan. Esto debería tomar menos de 30 segundos. Incube la reacción en hielo durante 30 minutos para permitir que los vesículos se hinchen.A continuación, diluya la mezcla de vesículas 20 veces hasta un volumen final de 30 microlitros combinando 1,5 microlitros de vesículas con 27,0 microlitros de solución de cloruro de tris y 1,5 microlitros de solución stock de proteinasa K. Incube ahora la mezcla de vesículas diluida durante al menos dos horas y media a 37 grados Celsius.Prepare una cámara de muestra colocando un espaciador de silicona de 20 por cinco milímetros sobre un microscopio estándar. Introduzca por pipeta 10 microlitros de vesículas en la cámara de muestra y coloque una lámina cubreobjetos silanizada sobre la cámara. A continuación, observe las vesículas mediante microscopía de campo claro y de fluorescencia con un objetivo de inmersión en aceite de 63 x o similar.La microscopía de fluorescencia utilizando el conjunto de filtros adecuado para la proteína fluorescente empleada revela que la fluorescencia solo se observa en el interior de las vesículas. El material extravesicular se degrada enzimáticamente para la expresión de en intravesicular venoso. La fluorescencia comienza a observarse tras 1,5 horas a 37 grados Celsius.M Venus alcanza una fluorescencia máxima a las seis horas. Aquí se observa a las 2,5 horas. Esta producción de proteínas depende de la síntesis y plegamiento proteicos, así como de la formación del cromóforo.Se utiliza como control una reacción análoga de transcripción y traducción in vitro de un constructo y recubrimiento de mVenus sin vesículas. Dichas reacciones presentan intensidades de fluorescencia más altas debido a la eficiencia de encapsulación y a un efecto de dilución. Por lo tanto, se monitorizan mediante espectroscopía, no mediante microscopía.Este procedimiento puede utilizarse para responder preguntas relacionadas con la regulación y los efectos de la carga metabólica sobre la actividad de células artificiales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir miméticos celulares mediante la encapsulación directa de maquinaria de transcripción y traducción en vesículas sintéticas.

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La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares (Video) | JoVE Journal

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

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