El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

El objetivo general de este video es demostrar un ensayo múltiplex de alta salida para determinar el inicio de la apoptosis medido por caspasa. Tres siete. En primer lugar, las neuronas hipotalámicas son desafiadas con el ácido graso saturado inductor apoptótico, el ácido palmítico.

A continuación, se mide la viabilidad celular de las neuronas utilizando un reactivo fluorescente y un lector de microplacas tras el inicio de la apoptosis. El sustrato lumino, DEVD, que es una secuencia de aminoácidos escindida por la caspasa tres, se añade a las células. El paso final del procedimiento es medir la luminiscencia utilizando un lector de microplacas para determinar la actividad de las caspasas, que aumenta en las células que están en apoptosis.

En última instancia, se puede obtener una proporción de actividad de caspasas por células viables en menos de cinco a seis horas. En un formato de 96 pocillos. La principal ventaja de esta técnica de nuestros métodos existentes, como los western blots o la lisis, es que es un ensayo rápido y económico que puede medir directamente la actividad de la caspasa tres siete en formatos de pocillos múltiples.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo, como la determinación de los moduladores primarios de la apoptosis. La utilidad de esta técnica es que esta multiplexación se puede utilizar como un método preciso para evaluar la citotoxicidad y la viabilidad. Aunque el ensayo es bastante sencillo, una demostración visual de este método es fundamental porque garantizará que el ensayo se complete con éxito.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la neurodegeneración, también se puede aplicar a otras enfermedades y modelos in vitro, como los que se utilizan en la investigación del cáncer. Las personas nuevas en este método necesitarán optimizar esta técnica porque los puntos finales dependen de la línea celular y del agonista. La actividad de la caspasa tres siete es transitoria.

Por lo tanto, dependiendo de la efectividad del estresor celular, determinar el momento adecuado para analizar la actividad de la base de fundición puede requerir cierto esfuerzo para comenzar rápidamente. Descongeló 12 celdas congeladas en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez descongeladas, coloque suavemente las células en un matraz de cultivo ventilado de 75 centímetros cuadrados y agregue 10 mililitros de delcos calientes, águilas modificadas, medio o DMEM, incube el matraz durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados.

Pasadas las 24 horas, se aspira el medio y se sustituye por medio fresco pudiendo seguir creciendo las células hasta obtener entre el 70 y el 80% de confluencia a los dos o tres días de crecimiento. Para contar las células, primero caliente DMEM y una x tripsina, solución de EDTA a 37 grados centígrados. Aspire el medio del matraz y lávelo dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato.

Añadir 500 microlitros de solución de tryin antes de incubar a 37 grados centígrados durante entre dos y cinco minutos. Separe las células del matraz con un raspador y suspenda las células en cinco mililitros de medio. Pase las células a través de un colador de células a un tubo limpio de 50 mililitros.

Puede ser necesario pasar las células a través del colador más de una vez, pero no repita más de tres veces después de contar las células usando una semilla de hemocitómetro. 6.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo transparente de paredes blancas o negras en un volumen final de 100 microlitros de medio, incubar la placa al 5% de dióxido de carbono y a 37 grados centígrados durante 24 horas. Transfiera el ácido palmítico a un vial de vidrio estéril de cinco mililitros y solubilice en DMSO al 100%.

Después de diluir la solución de ácido palmítico madre de uno a 10 en DMSO, agréguela a PREWARM DMEM para obtener una concentración de trabajo final de 0,1 milimolar de ácido palmítico para medios de control, agregue la misma concentración de DMSO que se agregó a los medios que contienen ácido palmítico. Retire el medio en cada pocillo y reemplácelo con 50 microlitros de medio más o menos ácido tic, e incube la placa al 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius durante dos horas. A continuación, añada cinco reactivos de resina de microlitros e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente después de la incubación, cargue la placa en un lector de microplacas multimodo y registre la fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 560 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 590 nanómetros.

Para medir la responsabilidad de las células, los resultados se presentan como unidades de fluorescencia relativas a la misma placa. Agregue 55 microlitros de reactivo de fundición DEVD e incube a temperatura ambiente durante dos horas. Una vez más, utilizando el lector de microplacas, registre la luminiscencia para medir la caspasa, los resultados de la actividad siete se presentan como unidades de luminiscencia relativa con luminiscencia directamente proporcional a la caspasa tres siete para normalizar la actividad de la caspasa tres siete al recuento de células, dividir la viabilidad celular por la actividad de la caspasa tres siete.

Este protocolo describe los resultados de la multiplexación de dos ensayos separados para determinar los mecanismos de muerte celular por apoptosis. La actividad de las caspasas aumentó significativamente en las células desafiadas con ácido palmítico. Después de dos horas de incubación, la integridad de la membrana celular se altera visiblemente en presencia de ácido palmítico.

Aquí se muestra la posible vía en la que el ácido palmítico induce la apoptosis. Comprender los mecanismos subyacentes del factor estresante utilizado para inducir la apoptosis ayuda a determinar el período de tiempo para la incubación del factor estresante. Dado que las enzimas caspasas deben activarse antes de interactuar con el sustrato DEVD una vez dominadas, esta técnica se puede realizar en menos de cinco a seis horas si se realiza correctamente.

Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un ensayo de actividad multiplex de caspasa tres siete utilizando un modelo de cultivo de células neuronales hipotalámicas in vitro. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los tiempos de incubación dependen de los tipos de células y de los factores estresantes o agonistas utilizados. El desarrollo de esta técnica permite a los investigadores en el campo de la neurociencia utilizar una técnica fiable y que ahorra tiempo para los estudios apoptóticos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar ensayos farmacológicos adicionales que se dirigen a proteínas específicas dentro del proceso apoptótico con el fin de delinear los mecanismos subyacentes que inician las enfermedades degenerativas.