Name: El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a realizar un ensayo multiplex de caspasa-3/7 para evaluar apoptosis en neuronas hipotalámicas expuestas a ácido palmítico. Este método rápido permite medir viabilidad celular y actividad enzimática simultáneamente.

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El trabajo aquí descrito fue financiado por los EE.UU. Departamento de Asuntos de Veteranos Biomédica Laboratorio de Investigación y Desarrollo BX001686-1A1 y VA Rehabilitación de Investigación y Desarrollo.

1. Plating y Mantenimiento de Cultivos Celulares <ol><li> Medio Eagle Modificado de calentamiento por Dulbecco (DMEM) medio de cultivo (DMEM + 10% de FBS + 1% de penicilina / estreptomicina / neomicina) a 37 ° C. </li><li> Obtener un balance de las células congeladas A12 de -80 ° C. </li><li> Rápidamente descongelar las células en 37 ° C baño de agua; una vez descongelado, suavemente las células de pipeta para transferir a un frasco de cultivo de ventilación 75 cm2 y añadir 10 ml de medio de cultivo. </li><li> Incubar frasco durante la noche en 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. Aspirar los medios después de 24 horas y reemplazar con medio fresco. Continúe creciendo las células hasta que se obtenga un 70-80% de confluencia (crecimiento de 2-3 días). </li></ol> 2. Contar y células en placas <ol><li> DMEM Cálido y 1 x solución de tripsina-EDTA a 37 º C. </li><li> Aspirar los medios de las células y se lavan dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). </li><li> Añadir 500 l de solución de tripsina y se incuba a 37 ° C durante 2-5 min. </li><li> Despegarcélulas del frasco utilizando una espátula y suspender las células en 5 ml de medio. Pasar las células a través del filtro y pasar a través de filtro de células en un tubo limpio de 50 ml. Puede que tenga que pasar las células a través del filtro más de una vez, pero no repita más de tres veces. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro para determinar el importe de las células a la cultura de sembrar 6.000 células / pocillo en una placa de color negro o blanco 96 pocillos de fondo claro amurallado en un volumen final de 100 l de los medios de comunicación. Incubar la placa en 5% de CO 2 a 37 ° C durante 24 horas. </li></ol> 3. La determinación de la viabilidad celular y la caspasa-3/7 Actividad <ol><li> Transferencia PA a un vial de vidrio de 5 ml estéril y solubilizar en 100% de dimetil sulfóxido (DMSO). Diluir la solución madre PA 1:10 en DMSO y añadirlo a precalentado DMEM para obtener una concentración de trabajo final de 0,1 mM PA. Para los medios de control, agregue la misma concentración de DMSO que se añade a los medios de comunicación que contienen PA. </li><li> Retire los medios de comunicación en cada pozo y reemplazar con 50 medios mu l + / -PA. Incubar la placa durante 2 horas en 5% de CO 2 a 37 ° C. Añadir a continuación 5 reactivo resazurin l y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> El uso de un lector de microplacas multimodo, ficha fluorescencia (560 EX / 590 EM) para medir la viabilidad celular. Los resultados se presentan como unidades de fluorescencia relativa (RFU). </li><li> Para la misma placa, añadir 55 l de reactivo de caspasa y se incuba a temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Una vez más mediante el lector de microplacas, ficha luminiscencia para medir la actividad de la caspasa-3/7. Los resultados se presentan como unidades relativas de luminiscencia (RLU), con luminiscencia directamente proporcional a la caspasa-3/7 actividad. </li><li> Para normalizar la actividad de caspasa-3/7 para el recuento de células, dividir la viabilidad celular (RFU) por la caspasa-3/7 actividad (RLU). </li></ol>

<ol><li>Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAkil%2C+L+%22J.+Health+Care+Poor+Underserved%22">J. Health Care Poor Underserved</a>. 22, 61-72 (2011).</li>
<li>Posey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+proinflammatory+lipid+accumulation%2C+inflammation%2C+and+insulin+resistance+in+rats+fed+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Moraes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+diet+induces+apoptosis+of+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Mayer, C. M., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+attenuates+insulin+signaling+and+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+apoptosis+in+hypothalamic+neurons%3A+rescue+of+resistance+and+apoptosis+through+adenosine+5%27+monophosphate-activated+protein+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation.</a> Endocrinology. 151, 576-585 (2010).</li>
<li>Benoit, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+mediates+hypothalamic+insulin+resistance+by+altering+PKC-theta+subcellular+localization+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents.</a> J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).</li>
<li>Thaler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+is+associated+with+hypothalamic+injury+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).</li>
<li>Williams, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nutr.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic dysfunction in obesity.</a> Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+phenotypic+array+of+hypothalamic+neuronal+cell+models+to+study+complex+neuroendocrine+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders.</a> Endocrinology. 145, 393-400 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+A+decreases+lipid+peroxidation+and+apoptosis+in+a+novel+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model.</a> Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time%2C+dose+of+toxin%2C+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.+Assay+Drug+Dev%5BTitle%5D)+AND+%22Technol%22%5BJournal%5D)">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev.</a> Technol. 2, 51-62 (2004).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Chem.+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Steffen, W., Linck, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunoblot%3A+a+sensitive+technique+to+stain+proteins+and+detect+multiple+antigens+on+a+single+two-dimensional+replica%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica.</a> Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).</li>
<li>Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+and+quantitation+of+proteins+on+western+blots+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes.</a> Biotechniques. 29, 636-642 (2000).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time%2C+dose+of+toxin%2C+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).</li>
<li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+apoptosis%3A+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-650 (2002).</li>
<li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+pharmacological+manipulation+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Caspases: pharmacological manipulation of cell death.</a> J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos a revelar.

El ensayo multiplex es una técnica bien aceptada que ha sido usado por los científicos en numerosas aplicaciones tales como microarrays de PCR, inmunodetección, y otros métodos de detección basados ​​en proteínas 13, 14. Recientemente, los ensayos de multiplexado se han convertido en cada vez más utilizado en los experimentos in vitro basado en la placa y se han validado como un método preciso para determinar la citotoxicidad y viabilidad 12. En el protocolo anterior, se demuestra...

Las dietas ricas en ácidos grasos saturados, como el ácido palmítico (PA) se han relacionado con la obesidad y otras comorbilidades, como la enfermedad cardiovascular y la diabetes 1, 2. Las dietas altas en grasa también se ha demostrado que aumentar el estrés oxidativo, la apoptosis, y la degeneración neuronal en el hipotálamo, un importante regulador del apetito y el gasto de energía 3-7. Entender el mecanismo a través del cual la exposición dieta rica en grasas induce desregulación hipotalámica tanto, es importante para el desarrollo de tratamientos farmacológicos para la obesidad. Sin embargo, los mecanismos celulares a través del cual la grasa dietética afecta a la función neuronal siguen sin estar claros. Una mejor comprensión de cómo las grasas tales como PA podrían dar lugar a la aparición de las vías de apoptosis hipotálamo es un primer paso necesario hacia este objetivo. El objetivo de este artículo es describir un ensayo múltiple para las pruebas in vitro de la respuesta neuronal a la exposición PA, desarrollado para su uso en estudios de hneurodegeneración ypothalamic. Proporcionamos una descripción detallada de un formato de 96 pocillos de ensayo multiplex in vitro para medir la caspasa 3/7 actividad por el número total de células en un ratón adulto línea diferenciada inmortalizado hipotalámico celular (designado A12) después del desafío oxidativo con PA 8. En pocas palabras, la viabilidad celular se determina después de la exposición a través de un ensayo de PA resazurin basado. La resazurina es un compuesto permeable a la célula que se somete a reducción enzimática en las células metabólicamente activas, un proceso de pensamiento que se produzca a través de la mitocondria 9. Las células viables se convierten continuamente resazurina a resorufina, la producción de una señal fluorescente proporcional al número de células viables. La actividad de caspasa-3/7 se analiza a continuación, utilizando un ensayo basado lumogenic-DEVD. DEVD es una secuencia de aminoácidos (Asp-Glu-Val-Asp) escindido por la caspasa-3. Cuando esta secuencia está acoplado a una sustancia lumogenic, tras la activación de intracelular de la caspasa-3/7 y posterior escisiónde sustrato DEVD, el producto luminiscente se libera. Esta reacción es proporcional a la actividad de caspasa y por lo tanto a la inducción de la apoptosis. Como las células muertas no pueden producir la caspasa, la caspasa-3/7 actividad es de naturaleza transitoria; Por lo tanto, el análisis debe ser completado entre 30 min a 4 horas después de la exposición, en función de la eficacia de estrés celular. La viabilidad celular es inversamente proporcional a la actividad de la caspasa-3/7 y se puede utilizar para determinar los mecanismos de muerte celular. Por ejemplo, este método se ha utilizado anteriormente para mostrar que el tratamiento previo con la hormona péptido orexina reduce la apoptosis en las células hipotalámicas desafiados con peróxido de hidrógeno, lo que sugiere que los mecanismos afectados por este tratamiento son importantes en la protección contra el daño oxidativo 10. Es importante tener en cuenta estos ensayos son la línea-y celular dependiente de tejido, ya que se basan en la actividad mitocondrial para reducir los reactivos de ensayo. Este protocolo ha sido optimizado para (A12), las células del hipotálamo de ratones adultos; Sin embargo,métodos descritos pueden alterarse para ajustarse dentro del alcance de investigaciones similares. Ensayos de multiplexación de un solo pocillo de cultivo proporciona una ventaja sobre el método tradicional de realizar ensayos individuales por varias razones. Además de tiempo, muestras de células, y los reactivos de cultivo de ahorro, los ensayos de multiplexación también pueden proporcionar el conocimiento de la supervivencia celular y la muerte, proporcionar controles internos, y eliminar la necesidad de experimentos repetitivos 11, 12. Los métodos alternativos se han basado en transferencias de Western o ELISA, que son ensayos fiables, pero son caros y consumir tiempo (1-2 días), especialmente cuando se utiliza un formato de 96 pocillos. Excluyendo el tiempo que tarda en células de cultivo para el ensayo de multiplexación, el tiempo total es de menos de 3 h. Aunque este protocolo ha sido optimizado para su uso con células A12, y puede ser modificada para su uso en otros modelos teniendo en cuenta factores que pueden influir en la integridad celular. Disuadirminería si este protocolo funcionaría para una serie de experimentos depende del número de muestras o condiciones experimentales y en experimentos posteriores previstas.

<table><tbody><tr><td>Línea celular de hipotálamo de ratón adulto mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Ácido palmítico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Dimethy Sulfóxido&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Reactivo de viabilidad celular</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspasa-Glo 3/7 Sistemas de ensayo</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W Placa inferior óptica, poliestireno negro, tratamiento con cultivo celular, con tapa, estéril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Microplaca Multimodo</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de una multiplexación ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

La capacidad de multiplexar ensayos en los estudios de los mecanismos celulares complejas elimina la necesidad de experimentos repetitivos, proporciona controles internos, y disminuye los residuos en los costos y los reactivos. Aquí se describe la optimización de un ensayo múltiple para evaluar la apoptosis después de un ácido palmítico (PA) en un modelo de desafío hipotalámico in vitro, usando tanto fluorescente y luminiscente basada en ensayos para medir el recuento de células viables y la caspasa-3/7 actividad en un 96-así formato de placa de microtitulación. Después de la exposición PA, las células viables se determinaron por un ensayo fluorescente basado en resazurina. La caspasa-3/7 actividad fue luego determinado utilizando un sustrato luminógeno, DEVD, y se normalizó al número de células. Este ensayo multiplexado es una técnica útil para determinar el cambio en la actividad de la caspasa después de un estímulo apoptótico, tales como desafío ácido graso saturado. El ácido graso saturado PA puede aumentar el estrés oxidativo del hipotálamo y la apoptosis, lo que indica el potencial de importaciónNCE de ensayos tales como el que se describe aquí en el estudio de la relación entre los ácidos grasos saturados y la función neuronal.

El protocolo anterior describe los resultados en dos ensayos separados de multiplexación para determinar los mecanismos de muerte celular. Figura 1 muestra una visión general del protocolo para determinar la viabilidad celular y la caspasa-3/7 actividad. Actividad caspasa fue significativamente mayor en las células estimuladas con PA después de 2 horas de incubación (Figura 2A y el Cuadro 1). La pérdida de integridad de la membrana celular es un cambio morfológico asoci...

Ensayos multiplex pueden proporcionar información útil para los mecanismos celulares básicos y eliminar los residuos de los reactivos y experimentos repetitivos innecesarios. Se describe aquí un múltiplex de la caspasa-3/7 ensayo de actividad, utilizando métodos fluorescentes y luminiscentes basados ​​en, para determinar la viabilidad celular en un modelo hipotalámico in vitro después de desafío oxidativo con ácido palmítico.

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

El objetivo general de este video es demostrar un ensayo multiplex de alto rendimiento para determinar el inicio de la apoptosis medido mediante caspasa tres siete. Primero, se estimulan neuronas hipotalámicas con el ácido graso saturado que induce apoptosis, el ácido palmítico.Luego, la viabilidad celular de las neuronas se mide utilizando un reactivo basado en fluorescencia y un lector de microplacas tras el inicio de la apoptosis. Se añade al cultivo el sustrato luminiscente DEVD, que es una secuencia de aminoácidos escindida por la caspasa-3. El último paso del procedimiento consiste en medir la luminiscencia mediante un lector de microplacas para determinar la actividad de la caspasa, que aumenta en las células que están experimentando apoptosis.Finalmente, se puede obtener una relación de actividad de caspasa por células viables en menos de cinco a seis horas. En un formato de 96 pocillos. La principal ventaja de esta técnica frente a nuestros métodos existentes, como las transferencias Western o la lisis, es que se trata de un ensayo rápido y económico que puede medir directamente la actividad de las caspasas 3 y 7 en formatos de múltiples pocillos.Este método puede ayudar a

use-caspase-multiplexing-assay-to-determine-apoptosis-hypothalamic

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Células vivas imágenes de la apoptosis mediada por la caspasa-3 en cultivos de células inmortalizadas N19-oligodendrocitos con...

Monitoreo escinde actividad caspasa-3 y la apoptosis de las células inmortalizadas oligodendrogliales utilizando células vivas, imágenes y Cleaveable Sustratos Fluorogenic-dye Después de despolarización de la membrana de potasio inducida por

Este video describe un ensayo luminiscente in vitro de Caspasa-3/7 para cuantificar la muerte celular o la apoptosis. El ensayo mide la luminiscencia producida después de la escisión de caspasa-3/7 de un sustrato DEVD proluminiscente. La luminiscencia generada es proporcional a la actividad de la caspasa-3/7.

Ensayo de Caspasa-3/7: Un ensayo basado en luminiscencia para cuantificar la apoptosis midiendo las actividades de Caspasa-3/7 en explantes de piel de rana

El término anástasis se refiere al fenómeno en el que las células moribundas revierten un proceso de suicidio celular en una etapa tardía, se reparan a sí mismas y, finalmente, sobreviven. Aquí demostramos protocolos para detectar y rastrear células que se someten a anastasis.

Estrategias para Anastasis Seguimiento, una célula de supervivencia Fenómeno que Invierte Apoptosis

Para detectar las células sanas en animales enteros que contienen niveles bajos de actividad caspasa, el biosensor altamente sensible designado CaspaseTracker se generó para Drosophila. se detecta actividad biosensor dependiente de caspasa en las células sanas de larga vida a través de los órganos internos de los animales adultos criados en condiciones optimizadas en ausencia de estímulos de muerte.

En Vivo biosensor Pistas de apoptosis no caspasa actividad en Drosophila

Anastasis es técnicamente difícil de detectar en vivo porque las células que se han invertido el proceso de muerte celular pueden ser morfológicamente indistinguibles de las células sanas normales. Aquí se describen los protocolos para la detección y seguimiento de las células que se someten a la anastasis en animales vivos mediante nuestro sistema de biosensor desarrollado recientemente en vivo CaspaseTracker.

Detección de Anastasis en Vivo por CaspaseTracker Biosensor

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

Aquí, se presenta un flujo de trabajo experimental que permite la detección del procesamiento de caspasa-8 directamente en el complejo de señalización inductor de muerte (DISC) y determina la composición de este complejo. Esta metodología tiene amplias aplicaciones, desde desentrañar los mecanismos moleculares de las vías de muerte celular hasta el modelado dinámico de las redes de apoptosis.

Medición de la composición del complejo de señalización inductor de muerte CD95 y procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo

Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos derivados de monocitos (MDM) a partir de muestras de sangre humana, un método simple para introducir eficientemente reporteros de complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa inflamatoria (BiFC) en MDM humanos sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular, y un enfoque basado en imágenes para medir la activación de la caspasa inflamatoria en células vivas.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

Aprende a realizar un ensayo multiplex de caspasa-3/7 para evaluar apoptosis en neuronas hipotalámicas expuestas a ácido palmítico. Este método rápido permite medir viabilidad celular y actividad enzimática simultáneamente.

El uso de una Multiplexación Ensayo de la caspasa para determinar la apoptosis en un modelo de célula hipotalámica

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