Name: El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprenda a usar ARN de interferencia para investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón mediante transfección con el sistema Amaxa Nucleofector. Este método permite evaluar la producción de citoquinas tras estimulación con LPS.

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Gracias a Brad Lackford por su ayuda en la optimización de algunas de las técnicas descritas en este manuscrito.

1. Mantenimiento de líneas celulares de macrófagos <ol><li> Crecer RAW264.7 y líneas de células J774A.1 en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 ºC en presencia de 5% de CO 2. Para ayudar a mantener la esterilidad, añadir 1% de penicilina / estreptomicina (pen / strep) a los medios de comunicación (aunque esto no es estrictamente necesario). </li><li> Paso crítico: Asegúrese de que los macrófagos están creciendo en un estado saludable para la transfección eficiente y inducida por siRNA desmontables de genes. Utilice células entre pasajes 3 y 10 después de la descongelación fresco, ya que estas líneas de macrófagos exhiben la mejor eficiencia de transfección y mantienen robustas de supervivencia después de la transfección en esta etapa; no utilice un número de pases más alto (&gt; 20), como la eficacia de transfección de genes y Derribo tanto disminuyen grandemente. </li><li> Para optimizado transfección siRNA, células de la placa a 20% de confluencia y crecen uno o dos días hasta que las células alcanzan no más de 80% de confluencia. Células Overgrown no transfectar eficiently. </li></ol> 2. Programación del Sistema de traslado de 96 pocillos para la transfección <ol><li> Inicie el software de enlace de 96 pozos en el ordenador conectado a la lanzadera. Seleccione el nuevo archivo de parámetros en el menú archivo de la parte superior izquierda. </li><li> Destacar los pozos que se transfectaron en la que se muestra de 96 pocillos esquemática placa. Un cuadro verde indica que los pozos sean seleccionados. </li><li> Seleccione el programa que corresponde a la línea celular de macrófagos que se utiliza (DS-136 para RAW264.7 o DS-130 para J774A.1) y seleccione Aplicar, situado por debajo de la placa de 96 pocillos diagramada. Tenga en cuenta que después de seleccionar un programa, los pocillos de la placa esquemática serán de color azul oscuro. Círculos vacíos indican pozos que no han sido asignados un programa y no ser sorprendido. </li></ol> 3. Preparación de los reactivos para la transfección <ol><li> Preparar la solución Nucleofector ™ trabaja mezclando línea celular SF 96 bien-solución Nucleofector ™con todo el contenido del tubo suplemento cerrado. Dejar que los reactivos mezclados se equilibren a temperatura ambiente antes de su uso. Almacenar el exceso de solución completa Nucleofector ™ a 4 ºC hasta por 3 meses para un uso futuro. </li><li> Pre-caliente la solución salina DMEM, RPMI-1640, 0,25% de tripsina / EDTA, y fosfato tamponada con (PBS) a 37 ºC antes de la preparación de los macrófagos para la transfección. </li><li> Prepare el siRNA para la transfección por descongelar en hielo. Con el fin de minimizar el número de deshielo de congelación del siRNA, congelar en alícuotas nuevas siRNAs la primera vez que se utilizan. </li><li> En los experimentos iniciales, utilice siRNA a una dosis relativamente alta de 2 M (diluido desde 01:10 20 mM acciones). Posteriormente se valora siRNAs que inducen gen robusta desmontables a dosis más bajas, aunque se necesitan dosis más altas típicamente para una eficiente desmontables génica en macrófagos en comparación con otros tipos de células. NOTA: Los siRNAs están disponibles de muchas fuentes; bastante robusto caída gen se puede obtenerutilizando SmartPools siGenome, que son grupos de cuatro siRNAs dirigidos a cada gen. Como control negativo, utilice cualquiera de varias piscinas no de metas de siRNA o siRNAs. </li><li> Para monitorear la eficiencia de transfección, transfectar o bien el plásmido pmaxGFP control (proporcionado en los kits de Amaxa) o siRNAs marcados con fluorescencia en paralelo a los siRNAs experimentales. Esperar 30-50% de la transfección del plásmido GFP (ensayada por microscopía o citometría de flujo el día después de la transfección) y&gt; 99% de la transfección de ARNsi marcado con fluorescencia (ensayada mediante citometría de flujo inmediatamente después de la transfección y recuperación). </li></ol> 4. Preparación de los macrófagos para la transfección <ol><li> Separe los macrófagos adherentes de las placas de cultivo de células por tripsinización. Aspirar los medios de comunicación y se lavan las células dos veces con 10 ml de PBS. Después de retirar el PBS, incubar las células con pre-calentado 0,25% de tripsina / EDTA (1 ml / placa de 10 cm) durante 1-2 minutos hasta que las células comienzan a desprenderse. Golpear suavemente la placa y mover el Solución durante la incubación para maximizar la tripsinización. </li><li> Después de la incubación, añadir 9 ml de medio DMEM + FBS, mezclar suavemente hacia arriba y hacia abajo, y recoger las células por pipeteo en un tubo estéril. </li><li> Cuente el número de macrófagos aislados utilizando un hemocitómetro. Esperar aproximadamente 10 millones de macrófagos por placa de 10 cm. Calcular el número total de macrófagos necesarios; cada pocillo en el transbordador de 96 pocillos requiere 200.000 células. Recuerde que debe añadir el valor de las células de algunos pozos adicionales &quot;para permitir que las pérdidas de pipeteo. </li><li> Pipetear el número calculado de las células en un tubo de centrífuga. Centrifugar las células durante 10 min a 150 xg a temperatura ambiente. No centrifugar demasiado rápido ya que esto disminuirá la salud de los macrófagos y la eficacia de transfección. </li></ol> 5. Nucleofection de macrófagos con siRNA <ol><li> Usando una placa de 96 pocillos de fondo redondo estéril (que facilita la mezcla y reducir al mínimo la pérdida de reactivo), añadir 2 l de cada siRNA a cada pocillo para ser transfeja. Nota: Dependiendo del número de siRNAs, esto puede llevarse a cabo durante la etapa de centrifugación de macrófagos. </li><li> Aspirar el medio de las células centrifugadas. Resuspender suavemente las células en solución Nucleofector ™ SF (que contiene la solución de suplemento), utilizando 20 l por 200.000 células sedimentadas. Una vez resuspendido, utilizar las células inmediatamente para la transfección óptima. </li><li> Transferencia de células resuspendidas en un canal estéril; utilizando una pipeta multicanal, la transferencia de 20 l de la mezcla de células resuspendido en cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene la siRNAs. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo. </li><li> Transferencia de 20 l de la mezcla de células / siRNA en la placa de 96 pocillos Nucleocuvette ™ paso crítico:. A evitar la generación de burbujas durante la etapa de transferencia, ya que esto puede inducir a errores durante Nucleofection. </li><li> Después de colocar todas las muestras experimentales en la placa de la transfección, cubrir la placa de 96 pocillos con la tapa proporcionada y very toque suavemente sobre una superficie dura para eliminar las burbujas de las muestras. </li><li> Coloque la placa de 96 pocillos con tapa en el 96 pocillos de transporte Nucleofector y seleccione &quot;cargar y comenzar &#39;en la parte inferior derecha de la pantalla del programa. Antes de Nucleofection, siga la línea de programa para guardar los resultados. Nota: Durante el proceso de Nucleofection, pozos transfectadas con éxito serán representados en el 96 pocillos esquemática en la pantalla por un círculo verde con un signo más. Un círculo rojo con signos menos indica un error, muy probablemente debido a las burbujas o mis-pipeteado el volumen correcto de los reactivos. </li></ol> 6. Recuperación y galjanoplastia de macrófagos <ol><li> Inmediatamente después de Nucleofection, usando una pipeta multicanal, añadir 80 l de precalentado (37 ºC) RMP1-1640 medios de comunicación a cada pocillo. Añadir los medios de comunicación a un lado de cada pocillo, permitiendo que los medios se mezclan lentamente con las células transfectadas, que son muy delicada en esta etapa. No agregue los medios de comunicación demasiado rápido, ya que estodisminuir en gran medida la viabilidad. </li><li> Colocar las placas de 96 pocillos con muestras transfectadas y RPMI-1640 en una incubadora a 37 ºC con 5% de CO2 durante 2 min; esto es fundamental para permitir que las células se recuperen antes de la manipulación adicional. </li><li> Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y transferir cuidadosamente la mezcla de cada pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos usando una pipeta multicanal. </li><li> Usando una pipeta multicanal, añadir 100 l de precalentado (37 ºC) medio DMEM + FBS a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa de cultivo tisular de 96 pocillos con las muestras en un incubador de 37 ºC con 5% de CO 2 durante 24-36 hr (optimizar el tiempo exacto para siRNAs individuales, aunque este intervalo de tiempo generalmente funciona bien). </li></ol> 7. estimulación de los macrófagos con LPS <ol><li> Tras el 24-36 horas después de la Nucleofection incubación, preparar LPS (u otros PAMP) en medio fresco. Preparar suficiente medio fresco para todos los pozos (200 l mEDIA / pocillo de la placa de 96 pocillos, más un poco más por pipeteo). Diluir LPS a una concentración final de 20 ng / ml en DMEM + FBS. </li><li> Medios de comunicación cuidadosamente aspirado de la placa de 96 pocillos y se suman los medios de comunicación fresca que contiene los LPS a las células. </li><li> Monitorear la respuesta a LPS u otros PAMP en diversos momentos después de la estimulación. 6 hr es suficiente para generar una respuesta de citoquinas inflamatoria robusta para citoquinas tales como IL-6 o TNF. </li></ol> 8. Control de la Respuesta Inmune Innata inducida, Gene Derribo y viabilidad en los macrófagos <ol><li> Para monitorizar la producción de citoquinas inducida por LPS, una pipeta el sobrenadante de las células en una placa de almacenamiento de 96 pocillos. La producción de citocinas se puede medir por ELISA. </li><li> Una vez que se retira el sobrenadante, controlar la viabilidad celular utilizando diacetato de fluoresceína (cuando se escinde por esterasas celulares en células vivas, este compuesto se convierte en fluorescente). Identificar siRNAs que se dirigen a los genes que controlan la viabilidad celular mediante la tsu enfoque. Nota: el proceso de transfección en sí debe tener poco efecto sobre la viabilidad si se realiza correctamente. <ol><li> Añadir diacetato de fluoresceína (5 mg / ml en acetona) a cada pocillo (1: 100 dilución final en PBS). </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante uno a cinco minutos y luego controlar la fluorescencia en las células utilizando un lector de placas (460 nm de excitación, 515 nm de emisión). </li><li> Opcional: Para asegurarse de que la fluorescencia en los pozos es uniforme, lisan las células usando tampones tales como RIPA; esto proporciona una señal fluorescente uniforme en el pozo, como algunos lectores de placas están configuradas para supervisar sólo una pequeña porción del pozo; si las células no se siembran de manera uniforme, el diacetato de fluoresceína podría dar una lectura incorrecta. </li></ol></li><li> Como una alternativa a la vigilancia de la viabilidad celular, monitorear génica inducida siRNA-desmontables por qPCR usando ARN derivado de las células adherentes. <ol><li> Después se retira el sobrenadante de las células (paso 8.1 anterior), add tampón RLT (que se utiliza para la lisis y la preservación de RNA) directamente a las células adherentes para lisar ellos. </li><li> Aislar ARN utilizando un kit de preparación de ARN, como el mini-kit RNeasy, y el uso de qPCR con cebadores específicos de genes para controlar gen relativa desmontables para controlar el tratamiento de siRNA. Utilice cebadores a Βactin o GAPDH para la normalización. </li></ol></li><li> Como otra alternativa para controlar otros aspectos de la respuesta inmune innata, supervisar la capacidad fagocítica de los macrófagos mediante la adición de FITC-etiquetados E. partículas coli directamente sobre las células adherentes utilizando un kit. Siguiendo el protocolo del fabricante, que tiene sólo unas pocas horas, controlar la absorción de fagocitosis utilizando un lector de placas o microscopía. </li></ol>

<ol><li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufmann%2C+SHE+%22The+innate+immune+response+to+infection%22">The innate immune response to infection</a>. , ASM Press. (2004).</li>
<li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li>
<li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+allergy%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+mechanism+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+an+immunologic+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li>
<li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li>
<li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+B+%22The+macrophage%22">The macrophage</a>. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li>
<li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li>
<li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li>
<li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li>
<li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+RNAi+and+gene+silencing%22%5BJournal%5D)">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li>
<li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732(2001).</li>
<li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+toll-like+receptor+%28TLR3%29+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li>
<li>Fernandez-Botran, R., Větvička, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFernandez-Botran%2C+R+%22Methods+in+Cellular+Immunology%22">Methods in Cellular Immunology</a>. 8, CRC Press. 8(2001).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Este artículo fue patrocinado por Lonza, Inc.

Numerosos estudios han sido publicados en los que los genes individuales han sido blanco de siRNA en macrófagos murinos. Mientras que la transfección mediada por lípidos ha sido utilizado para entregar siRNA a las líneas celulares de macrófagos sobre una base individual, estos métodos sufren de los efectos potenciales sobre la viabilidad, la caída limitada de genes, y la variabilidad del gen a gen. Para desarrollar ensayos más robustos que podrían ser utilizados para apuntar a genes de la moda de mediano o de alto rendi...

En este protocolo, se describen los métodos eficaces para inhibir genes en líneas celulares de macrófagos de ratón utilizando siRNAs y controlar los efectos de estos tratamientos en la respuesta inmune innata. Estos procedimientos se realizan en formato de 96 pocillos, lo que permite pantallas de RNAi en la moda de mediano o alto rendimiento. En respuesta a la infección, los seres humanos montar una respuesta inmune innata inmediata y una respuesta inmune adaptativa más lento pero más específico. Esta rápida respuesta inmune innata implica el reclutamiento y la activación de las células inmunes innatas fagocíticas incluyendo macrófagos 1. Macrófagos activados Clásicamente están implicados en las respuestas inflamatorias agudas y producen proteínas antimicrobianas y compuestos, citocinas y quimiocinas, y presentar antígenos 2,3. Macrófagos alternativamente activados desempeñan un papel en la regulación de la inmunidad, el mantenimiento de la tolerancia, la reparación de tejidos, la curación de heridas y 4-8. Debido a su amplia gama de funciones, Los macrófagos pueden desempeñar un papel en numerosas enfermedades, incluyendo la aterosclerosis, artritis, y cáncer 9. Así, el estudio de los macrófagos ha sido un área clave de la investigación durante algún tiempo en una amplia variedad de campos de la enfermedad. A pesar de su importancia en la respuesta inmune innata, los macrófagos pueden ser un reto para trabajar con células. En particular, es difícil obtener la transfección eficiente utilizando reactivos de lípidos en los macrófagos sin toxicidad asociada 10,11. Además, incluso cuando siRNA se entrega de manera eficiente a los macrófagos, la robustez del gen inducida por RNAi desmontables a menudo puede ser bastante moderado y puede variar de un gen a gen. Para superar estos desafíos técnicos, hemos optimizado la transfección y técnicas de derribo 12-16 en dos líneas celulares de macrófagos de ratón, RAW264.7 17 y 18 J774A.1. Este enfoque utiliza el sistema de traslado de 96 pocillos Amaxa Nucleofector para la transfección; este sistemautiliza una combinación de reactivos especializados y electroporación para transfectar células en formato de 96 pocillos 19. Después de la transfección, se describen los métodos para maximizar la recuperación celular y la viabilidad y para maximizar la posterior caída de genes inducida por siRNA. Para ilustrar la utilidad de este enfoque, se describe un protocolo para la entrega siRNA a estas líneas celulares de macrófagos, estimular estas células con lipopolisacárido (LPS), y controlar la respuesta inmune innata en el nivel de producción de varias citocinas pro-inflamatorias. Proporcionamos datos de la muestra en la que se dirigen a la familia de receptores de tipo Toll (TLR), cuyos miembros detectar LPS y otros patógenos asociados a patrones moleculares (PAMPs), para regular la inmunidad innata.

<table><tbody><tr><td>Sistema de lanzadera de 96 pocillos Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td> Línea celular Amaxa SF Kit de nucleoefecto de 96 pocillos Lonza V4SC-2096 RAW264.7 línea celular de macrófagos de ratón ATCC TIB-71 J774A.1 línea celular de macrófagos <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de ratón ATCC TIB-67 siGenome smartpool siRNA Dharmacon varía en función <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> en el gen</td><td></td></tr><tr><td>Pool de siRNA de control no dirigido</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Block-iT oligonucleótido fluorescente para electroporación</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 Lista de LPS</td><td>Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina (pluma/estreptococo)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placas estériles de fondo redondo de 96 pocillos (sin recubrimiento)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Duoset ELISA kit</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Ratón TNF&alpha; Kit Duoset ELISA</td><td>R& D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Diacetato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>Tampón RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Kit de ensayo de fagocitosis</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

el uso de arn de interferencia para investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Los macrófagos son células inmunitarias innatas fagocíticas clave. Cuando los macrófagos se encuentran con un patógeno, producen proteínas y compuestos antimicrobianos para matar al patógeno, producen varias citocinas y quimiocinas para reclutar y estimular otras células inmunitarias, y presentan antígenos para estimular la respuesta inmunitaria adaptativa. Por lo tanto, ser capaz de manipular eficientemente los macrófagos con técnicas como el ARN de interferencia (ARNi) es fundamental para nuestra capacidad de investigar esta importante célula inmunitaria innata. Sin embargo, los macrófagos pueden ser técnicamente difíciles de transfectar y pueden exhibir una eliminación génica ineficiente inducida por ARNi. En este protocolo, describimos métodos para transfectar de manera eficiente dos líneas celulares de macrófagos de ratón (RAW264.7 y J774A.1) con siRNA utilizando el sistema de lanzadera de 96 pocillos Amaxa Nucleofector y describimos procedimientos para maximizar el efecto del siRNA en la eliminación de genes. Además, los métodos descritos están adaptados para trabajar en formato de 96 pocillos, lo que permite estudios de rendimiento medio y alto. Para demostrar la utilidad de este enfoque, describimos experimentos que utilizan ARNi para inhibir genes que regulan la producción de citocinas inducida por lipopolisacáridos (LPS).

Para demostrar la eficacia de la transfección usando este enfoque, que supervisó la captación de ARNsi marcado con FITC utilizando un citómetro de flujo (Figura 1). Para ilustrar la utilidad de nuestro enfoque para el seguimiento de la respuesta inmune innata, transfectadas siRNAs dirigidos a genes reguladores inmunes innatas conocidas en la línea celular de macrófagos RAW264.7, estimulamos las células con LPS, y luego supervisó la producción de las citoquinas pro-inflamator...

En este protocolo, describimos métodos para transfectar eficientemente líneas celulares de macrófagos murinos con siRNAs utilizando el sistema de lanzadera Amaxa Nucleofector de 96 pocillos, estimular los macrófagos con lipopolisacáridos y monitorear los efectos sobre la producción de citoquinas inflamatorias.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar interferencia de ARN para investigar el efecto de genes candidatos sobre la respuesta inmune innata. Para ello, en macrófagos de ratón, líneas celulares de macrófagos se trypsinizan y combinan con solución de transfección y los ARNsi de interés; la mezcla se transfiere entonces a una placa Nucleo VETE de 96 pocillos y se utiliza un sistema de transfección Maxa de 96 pocillos para transfectar el ARNsi en los macrófagos. Después de una incubación con medio de cultivo celular, se añaden LPS u otros activadores de la inmunidad innata a los macrófagos transfectados para estimularlos. Finalmente, se realizan ensayos ELISA para monitorear la producción de citocinas y evaluar el efecto del tratamiento con ARNsi sobre la respuesta inmune innata.La principal ventaja de esta técnica frente a la transfección mediada por lípidos es que nuestro ensayo es robusto y puede aplicarse a muchos genes en un proceso de alto rendimiento. La clave de este método consiste en trabajar con células sanas, manipularlas con cuidado y actuar eficientemente durante el proceso de transfección. Como demostraremos, este protocolo utiliza la línea celular de macrófagos murinos raw 2 64 0.7, que se cultiva según se describe en el documento adjunto.Como preparación para la placa de transfección INA, siembre las células al 20 % de confluencia y deje que crezcan uno o dos días hasta que las células alcancen una confluencia no mayor al 80 %. Es importante recordar utilizar células que se encuentren entre el tercer y el décimo pase. Después del descongelamiento, inicie este procedimiento programando el sistema de electrotransferencia de 96 pocillos que se utilizará para la transfección.Para hacer esto, inicie el software del shuttle de 96 pocillos en la computadora conectada al shuttle, desde el menú de archivo en la esquina superior izquierda. Seleccione un archivo de parámetros nuevo. Resalte los pocillos que se transfectarán en el esquema del plato de 96 pocillos mostrado.Un cuadro verde indicará las pocetas seleccionadas. Elija el programa que corresponda a la línea celular de macrófagos que se esté utilizando para las células crudas 2 64 0.7. Elija DS 1 36, seleccione aplicar.Tenga en cuenta que después de seleccionar un programa, los pocillos en el esquema de la placa se colorearán. Los círculos vacíos de color azul oscuro indican los pocillos que no han sido asignados a ningún programa y que no recibirán choque. A continuación, prepare la solución de efector de trabajo mezclando la solución de efector para línea celular SF en placa de 96 pocillos con el contenido completo del tubo de suplemento incluido.Deje que los reactivos mezclados se equilibren a temperatura ambiente. Caliente el D-M-E-M-R-P-M-I 1640 con tripsina al 0,25 % y EDTA, y el PBS a 37 grados Celsius. Prepare el plásmido control S-I-R-N-A-P máx GFP experimental o los siARN marcados con fluorescencia descongelándolos en hielo para desprender los macrófagos adherentes de las placas de cultivo celular.Aspire el medio y lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS. Luego, después de eliminar el PBS, incube las células con un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25% precalentada por placa hasta que las células comiencen a desprenderse. Esto tarda de uno a dos minutos.Toque suavemente la placa y mueva la solución durante la incubación para maximizar la tripsinización. Después de que las células se hayan desprendido, agregue nueve mililitros de DMEM más FBS mezclando suavemente mediante pipeteo arriba y abajo, y luego recoja las células pipeteándolas hacia un tubo estéril. Cuente el número de macrófagos aislados utilizando un hemocitómetro.Esperar aproximadamente 10 millones de macrófagos por placa de 10 centímetros. Calcule el número total de macrófagos necesario; cada pocillo en la placa de 96 pocillos requiere 200.000 células. Pipetee el número calculado de células en un tubo de centrífuga.Centrifugar las células durante 10 minutos a 150 G a temperatura ambiente hasta una placa estéril de 96 pocillos de fondo redondo, lo que facilita la mezcla mientras se minimiza la pérdida de reactivo. Añadir dos microlitros de cada ARNi a cada pocillo que se transfectará. Téngase en cuenta que, dependiendo del número de ARNis, esto puede realizarse durante el paso de centrifugación de los macrófagos.El aspecto más difícil de este procedimiento es la electroforesis, las claves son tratar las células con mucha suavidad y trabajar muy rápidamente. Una vez que las células están en una solución de transfección tóxica, aspire el medio de las células centrifugadas y luego resuspenda suavemente en la solución nucleofectora. SF que contiene la solución suplemento.Transfiera inmediatamente las células a una cubeta estéril utilizando una pipeta multicanal, transfiriendo 20 microlitros de la mezcla celular resuspendida a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene los siARN, mezclando suavemente mediante pipeteo ascendente y descendente. A continuación, transfiera 20 microlitros de la mezcla celular INA a la placa nucleo vete de 96 pocillos. Es fundamental evitar la formación de burbujas durante este paso, ya que esto podría inducir errores durante la nucleoafectación.Después de colocar todas las muestras experimentales en la placa de transfección, cúbrala con la tapa proporcionada y golpee suavemente la placa sobre una superficie dura. Para eliminar cualquier burbuja, coloque la placa de 96 pocillos en la embarcación nucleoefectora de 96 pocillos y, en la esquina inferior derecha de la pantalla del programa, seleccione cargar e iniciar. A continuación, siga las indicaciones del programa para guardar los resultados durante el proceso de nucleofección en los pocillos con éxito.Los transfectados se representarán en el esquema de placa de 96 pocillos en la pantalla mediante un círculo verde con un signo más. Un círculo rojo con un signo menos indica un error, probablemente debido a burbujas o a la pipetación de un volumen incorrecto de reactivos inmediatamente después de la nucleofección. Utilice una pipeta multicanal para añadir 80 microlitros de RPMI 1640 precalentado.Medio al lado de cada uno. Permita que el medio se mezcle lentamente con las células transfectadas, que en esta etapa son muy delicadas. Agregar el medio demasiado rápido disminuirá considerablemente la viabilidad.Coloque la placa de 96 pocillos con las muestras transfectadas y RPMI 1640 en un incubador a 37 grados Celsius con 5 %CO2 durante dos minutos o más. Es fundamental permitir que las células se recuperen antes de cualquier manipulación adicional. Después de retirar la placa del incubador, utilice una pipeta multicanal para transferir cuidadosamente la mezcla de cada pocillo a una placa de cultivo celular de 96 pocillos.Luego nuevamente, utilizando la pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de DMEM con FBS a cada pocillo. Incube durante 24 a 36 horas inmediatamente después de la transfección y realice citometría de flujo tras el período de recuperación. Para evaluar la eficiencia de transfección del siRNA marcado fluorescentemente, más del 99 % de las células deben estar transfectadas al día siguiente de la transfección. En el ensayo de eficiencia de transfección del plásmido GFP, entre el 30 y el 50 % de las células deben expresar GFP. Tras la incubación de 24 a 36 horas, prepare el LPS u otros activadores de la inmunidad innata en medio fresco, diluyendo el LPS a una concentración final de 20 nanogramos por mililitro en DMEM con FBS.Luego, aspire cuidadosamente el medio de la placa de 96 pocillos y agregue el medio fresco que contiene el LPS a las células. Coloque la placa en un incubador para monitorear la respuesta al LPS u otros estimuladores de la inmunidad innata en diversos momentos posteriores a la estimulación. Pipete el sobrenadante de las células hacia una placa de almacenamiento de 96 pocillos para su análisis mediante ELISA.Después de eliminar el sobrenadante para monitorear la viabilidad celular, agregue 100 microlitros de diacetato de fluoresceína al uno a 100 en PBS a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante uno a cinco minutos. Monitoree la fluorescencia en las células utilizando un lector de placas cuando el compuesto sea escindido por las esterasas celulares en células viables. Este compuesto se vuelve fluorescente para ilustrar la utilidad de este enfoque para monitorear la respuesta inmune innata.Se transfirieron siARN dirigidos contra genes reguladores inmunitarios innatos conocidos en la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Luego, las células se estimularon con LPS y se monitoreó la producción de citocinas proinflamatorias, IL-6 y TNF-α, mediante ELISA, como se muestra aquí.Inhibición del receptor tipo toll cuatro, el receptor para LPS, pero no de otros TLR. Mediante SIR, se observó una producción fuertemente reducida de IL seis y TNF alfa inducidas por LPS. Téngase en cuenta que la inhibición de IL seis con irna disminuyó la producción de IL seis, pero no afectó la producción de TNF alfa.Estos datos sugieren una buena eficacia y una buena especificidad del silenciamiento mediado por ARNip de reguladores candidatos de la inmunidad innata. Es importante recordar que la clave para una buena transfección y una buena recuperación celular consiste en trabajar con células muy sanas, tratarlas con suavidad durante los procesos de transfección y recuperación, y trabajar rápidamente una vez que las células se encuentran en una solución nucleo efectora. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar muchos otros ensayos, incluyendo QPCR para monitorear el silenciamiento génico y numerosos otros ensayos para investigar la respuesta inmune innata.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo basado en células reporteras para la detección de posibles nanopartículas bioactivas que inhiben la señalización del receptor tipo Toll (TLR). El ensayo consiste en introducir lipopolisacáridos (LPS) mezclados con híbridos de nanopartículas de péptido y oro a macrófagos reporteros que expresan las proteínas reporteras: fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) y luciferasa. La reducción de la señal TLR inducida por LPS mediada por los híbridos se determina...

Un ensayo para examinar nanopartículas bioactivas para la inhibición de la señalización de receptores tipo Toll

Se describe un protocolo para medir la producción de citoquinas antivirales en ratones infectados con un virus herpes modelo, murino herpesvirus gamma 68 (γ HV68) que está relacionado con estrechamente a sarcoma de herpesvirus asociado de Kaposi humano (VHSK) y virus de Epstein-Barr (EBV). La utilización de cepas de ratones genéticamente modificados y los fibroblastos de embriones de ratón (MEFs), se evaluó la producción de citocina antiviral tanto in vivo como ex vivo. "Reconstituir" la...

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

Describimos aquí un protocolo sencillo para aislar macrófagos peritoneales murinos. A este procedimiento le sigue la extracción de ARN para llevar a cabo el análisis de la expresión génica tras la estimulación de los receptores tipo Toll.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

Describimos la detección de la activación de inflammasome NLRP3 en bases celulares mediante microscopía de fluorescencia y la coloración para activa caspasas-1 y el adaptador, ASC. Un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa se presenta para detectar lisis pyroptotic sobre una base de población. Estas técnicas se pueden adaptar para estudiar muchos aspectos de la biología de inflammasome.

Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

Se describe un enfoque para la detección en tiempo real de la respuesta inmune innata a heridas cutáneas y la infección de Staphylococcus aureus de los ratones. Por que comparan LysM-EGFP ratones (que poseen fluorescentes neutrófilos) con un LysM-EGFP mestizas cepa de ratón inmunodeficiente, avanzar en nuestra comprensión de la infección y el desarrollo de enfoques para combatir la infección.

Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.

Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo

Este protocolo proporciona a los investigadores un método rápido e indirecto para medir la actividad del factor de transcripción NF--B/AP-1 dependiente de TLR en una línea celular de macrófagomur en respuesta a una variedad de superficies poliméricas y capas de proteínas adsorbidas que modelan el microambiente de implantes de biomaterial.

Un ensayo celular de reportero de macrófagos para examinar la señalización NF-kB/AP-1 mediada por receptores similares al peaje en capas de proteínas absorbentes en superficies poliméricas

Demostramos un protocolo paso a paso para la investigación de la función génica en macrófagos residentes en tejido peritoneal in vivo, utilizando vectores lentivirales.

Preparación de vectores lentivirales para la modulación eficiente de genes y microARN de macrófagos residentes en el tejido de la cavidad peritoneal in vivo en ratones

Aprenda a usar ARN de interferencia para investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón mediante transfección con el sistema Amaxa Nucleofector. Este método permite evaluar la producción de citoquinas tras estimulación con LPS.

El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

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