El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

El objetivo general de este procedimiento es utilizar el ARN de interferencia para investigar el efecto de los genes candidatos en la respuesta inmunitaria innata. En macrófagos de ratón para hacer esto, las líneas celulares de macrófagos de ratón se triplican y se combinan con la solución de transfección y los ARN del SI de interés, la mezcla se transfiere a una placa VETE de núcleo de 96 pocillos y se utiliza un sistema de transfección Maxa de 96 pocillos para transfectar el siRNA en los macrófagos y después de una incubación con cultivo celular, medio, LPS u otros activadores de la inmunidad innata se aplican a los macrófagos transfectados para estimularlos. Por último, se realizan las de Eliza para monitorizar la producción de citoquinas y evaluar el efecto del tratamiento con siRNA en la respuesta inmunitaria innata.

La principal ventaja de esta técnica sobre la transfección mediada por lípidos es que nuestro ensayo es robusto y se puede aplicar a muchos genes en profesiones de alto rendimiento. La clave de este método es trabajar con células sanas, tratarlas con suavidad y trabajar de manera eficiente durante el proceso de transfección. Como demostraremos, este protocolo utiliza la línea celular de macrófagos de ratón 2 64 0,7 en bruto, que se cultiva como se describe en el documento adjunto.

En preparación para la placa de transfección INA, las células tienen un 20% de fluidez y crecen uno o dos días hasta que las células no tienen más del 80% de confluentes. Es importante recordar usar celdas que estén entre los pasajes tres y 10. Después de la descongelación, comience este procedimiento programando el sistema de lanzadera de 96 pocillos que se utilizará para la transfección.

Para hacer esto, inicie el software de la lanzadera de 96 pocillos en la computadora conectada a la lanzadera desde el menú de archivos de la parte superior izquierda. Seleccione nuevo archivo de parámetros. Resalte los pozos que se transfectarán en el esquema de placa de 96 pocillos que se muestra.

Un recuadro verde indicará los pozos seleccionados. Elija el programa que corresponda a la línea celular de macrófagos que se utiliza para las células brutas 2 64 0,7. Seleccione DS 1 36 y seleccione aplicar.

Tenga en cuenta que después de seleccionar un programa, los pozos de la placa esquemática se colorearán. Los círculos vacíos de color azul oscuro indican pozos a los que no se les ha asignado un programa y que no se verán afectados. A continuación, prepare la solución efectora de núcleo de trabajo mezclando la solución efectora de nucleo de 96 pocillos de la línea celular SF con todo el contenido del tubo de suplemento incluido.

Deje que los reactivos mezclados se equilibren a temperatura ambiente. Calentar el D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%tripsin EDTA y PBS a 37 grados centígrados. Prepare el plásmido experimental de control S-I-R-N-A-P max GFP o los siRNAs marcados con fluorescencia descongelándolos en hielo para separar los macrófagos adheridos de las placas de cultivo celular.

Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 10 mililitros de PBS. Luego, después de eliminar el PBS, incube las células con un mililitro de 0,25% de EDTA preadvertido por placa hasta que las células comiencen a desprenderse. Esto tarda de uno a dos minutos.

Golpee suavemente la placa y mueva la solución durante la incubación para maximizar la tripsinización. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue nueve mililitros de DMEM más FBS mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, y luego recoja las células pipeteando en un tubo estéril. Cuente el número de macrófagos aislados utilizando un citómetro Hema.

Se esperan aproximadamente 10 millones de macrófagos por placa de 10 centímetros. Calcule el número total de macrófagos necesarios para cada pocillo de la lanzadera de 96 pocillos, que requiere 200.000 células. Pipetear el número calculado de células en un tubo de centrífuga.

Gire las células durante 10 minutos a 150 g a temperatura ambiente hasta obtener una placa inferior redonda estéril de 96 pocillos, lo que facilita la mezcla y minimiza la pérdida de reactivo. Añadir dos microlitros de cada IRNA a cada pocillo a transfectar. Tenga en cuenta que, dependiendo del número de siRNA, esto se puede lograr durante el paso de centrifugación de macrófagos.

El aspecto más difícil de este procedimiento es la electroporación, las teclas que tratan las células con mucha suavidad y para que funcionen muy rápidamente. Una vez que las células estén en una solución de transfección tóxica, aspire el medio de las células centrífugas, luego vuelva a suspenderlas suavemente en una solución efectora de núcleo. SF que contiene la solución del suplemento.

Transfiera inmediatamente las células a un canal estéril con una pipeta multicanal, transfiera 20 microlitros de la mezcla de células resuspendidas a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene los siRNAs mezclados suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. A continuación, transfiera 20 microlitros de la mezcla de INA celular a la placa de vete de núcleo de 96 pocillos. Es fundamental evitar la generación de burbujas durante este paso, ya que esto puede inducir errores durante la afección del núcleo.

Después de colocar todas las muestras experimentales en la placa de transfección, cúbrala con la tapa provista y golpéela muy suavemente sobre una superficie dura. Para eliminar cualquier burbuja, coloque la placa de 96 pocillos en la lanzadera efectora de núcleos de 96 pocillos y, en la parte inferior derecha de la pantalla del programa, seleccione cargar e iniciar. A continuación, siga las instrucciones del programa para guardar los resultados durante el proceso de afección del núcleo con éxito.

Transfectado se representará en el esquema de 96 pozos en la pantalla mediante un círculo verde con un signo más. Un círculo rojo con un signo menos indica un error, probablemente debido a burbujas o pipeteo del volumen incorrecto de reactivos inmediatamente después de la afección del núcleo. Utilice una pipeta multicanal para añadir 80 microlitros de RPMI 1640 precalentado.

Medio a los lados de cada uno. Bueno, permita que el medio se mezcle lentamente con las células transfectadas, que son muy delicadas en esta etapa. Agregar el medio demasiado rápido disminuirá en gran medida la viabilidad.

Coloque la placa de 96 pocillos con muestras transfectadas y RPMI 1640 en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de CO2 durante dos o más minutos. Es fundamental permitir que las células se recuperen antes de una posterior manipulación. Después de retirar la placa de la incubadora, utilice una pipeta multicanal para transferir cuidadosamente la mezcla de cada pocillo a una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos.

Por otra parte, utilizando la pipeta multicanal, añada 100 microlitros de DMEM con FBS a cada uno. Incubar bien durante 24 a 36 horas inmediatamente después de la transfección y la recuperación, realizar citometría de flujo. Para evaluar la eficiencia de la transfección del irna del SI marcado con fluorescencia, más del 99% de las células deben transfectarse al día siguiente del ensayo de transfección Para la eficiencia de la transfección del plásmido GFP, entre el 30 y el 50% de las células deben expresar GFP Después de la incubación de 24 a 36 horas, prepare LPS u otros activadores de la inmunidad innata en medio fresco diluya el LPS hasta una concentración final de 20 nanogramos por mililitro en DMEM con FBS.

A continuación, aspire con cuidado el medio de la placa de 96 pocillos y añada el medio fresco que contiene el LPS a las células. Coloque la placa en una incubadora para monitorear la respuesta al LPS u otros estimuladores de la inmunidad innata en varios momentos después de la estimulación. Pipetee el sobrenadante de las células en una placa de almacenamiento de 96 pocillos para que Eliza la analice.

Después de eliminar el sobrenadante para monitorear la viabilidad celular, agregue 100 microlitros de acetato de di fluoresceína de uno a 100 en PBS a cada pocillo incubado a temperatura ambiente durante uno a cinco minutos. Monitoree la fluorescencia en las células usando un lector de placas cuando son escindidas por esterasas celulares en células vivas. Este compuesto se vuelve fluorescente para ilustrar la utilidad de este enfoque para monitorear la respuesta inmune innata.

Los siRNAs dirigidos a genes reguladores inmunes innatos conocidos se transfectaron en la línea celular bruta de 2 64 0,7 macrófagos. A continuación, las células se estimularon con LPS y se produjo las citocinas proinflamatorias. Eliza monitoreó IL six y TNF alfa como se muestra aquí.

Inhibición del receptor tipo toll cuatro, el receptor de LPS, pero no de otros TLRs. Con SIR, una producción muy disminuida de LPS indujo IL seis y TNF alfa. Nótese que la inhibición de IL seis con irna disminuyó la producción de IL seis, pero no afectó la producción de TNF alfa.

Estos datos sugieren una buena eficacia y una buena especificidad de la desactivación mediada por siRNA de los candidatos a reguladores de la inmunidad innata. Es importante recordar que la clave para una buena transfección y una buena recuperación celular es trabajar con células muy sanas, tratarlas suavemente durante el proceso de transfección y recuperación, y trabajar rápidamente una vez que las células están en una solución nucleoefectora. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar muchos otros ensayos, incluida la QPCR para controlar la eliminación de genes y muchos otros ensayos para investigar la respuesta inmunitaria innata.