El uso de ARN de interferencia para Investigar la respuesta inmune innata en macrófagos de ratón

El objetivo general de este procedimiento es utilizar interferencia de ARN para investigar el efecto de genes candidatos sobre la respuesta inmune innata. Para ello, en macrófagos de ratón, líneas celulares de macrófagos se trypsinizan y combinan con solución de transfección y los ARNsi de interés; la mezcla se transfiere entonces a una placa Nucleo VETE de 96 pocillos y se utiliza un sistema de transfección Maxa de 96 pocillos para transfectar el ARNsi en los macrófagos. Después de una incubación con medio de cultivo celular, se añaden LPS u otros activadores de la inmunidad innata a los macrófagos transfectados para estimularlos. Finalmente, se realizan ensayos ELISA para monitorear la producción de citocinas y evaluar el efecto del tratamiento con ARNsi sobre la respuesta inmune innata.

La principal ventaja de esta técnica frente a la transfección mediada por lípidos es que nuestro ensayo es robusto y puede aplicarse a muchos genes en un proceso de alto rendimiento. La clave de este método consiste en trabajar con células sanas, manipularlas con cuidado y actuar eficientemente durante el proceso de transfección. Como demostraremos, este protocolo utiliza la línea celular de macrófagos murinos raw 2 64 0.7, que se cultiva según se describe en el documento adjunto.

Como preparación para la placa de transfección INA, siembre las células al 20 % de confluencia y deje que crezcan uno o dos días hasta que las células alcancen una confluencia no mayor al 80 %. Es importante recordar utilizar células que se encuentren entre el tercer y el décimo pase. Después del descongelamiento, inicie este procedimiento programando el sistema de electrotransferencia de 96 pocillos que se utilizará para la transfección.

Para hacer esto, inicie el software del shuttle de 96 pocillos en la computadora conectada al shuttle, desde el menú de archivo en la esquina superior izquierda. Seleccione un archivo de parámetros nuevo. Resalte los pocillos que se transfectarán en el esquema del plato de 96 pocillos mostrado.

Un cuadro verde indicará las pocetas seleccionadas. Elija el programa que corresponda a la línea celular de macrófagos que se esté utilizando para las células crudas 2 64 0.7. Elija DS 1 36, seleccione aplicar.

Tenga en cuenta que después de seleccionar un programa, los pocillos en el esquema de la placa se colorearán. Los círculos vacíos de color azul oscuro indican los pocillos que no han sido asignados a ningún programa y que no recibirán choque. A continuación, prepare la solución de efector de trabajo mezclando la solución de efector para línea celular SF en placa de 96 pocillos con el contenido completo del tubo de suplemento incluido.

Deje que los reactivos mezclados se equilibren a temperatura ambiente. Caliente el D-M-E-M-R-P-M-I 1640 con tripsina al 0,25 % y EDTA, y el PBS a 37 grados Celsius. Prepare el plásmido control S-I-R-N-A-P máx GFP experimental o los siARN marcados con fluorescencia descongelándolos en hielo para desprender los macrófagos adherentes de las placas de cultivo celular.

Aspire el medio y lave las células dos veces con 10 mililitros de PBS. Luego, después de eliminar el PBS, incube las células con un mililitro de tripsina-EDTA al 0,25% precalentada por placa hasta que las células comiencen a desprenderse. Esto tarda de uno a dos minutos.

Toque suavemente la placa y mueva la solución durante la incubación para maximizar la tripsinización. Después de que las células se hayan desprendido, agregue nueve mililitros de DMEM más FBS mezclando suavemente mediante pipeteo arriba y abajo, y luego recoja las células pipeteándolas hacia un tubo estéril. Cuente el número de macrófagos aislados utilizando un hemocitómetro.

Esperar aproximadamente 10 millones de macrófagos por placa de 10 centímetros. Calcule el número total de macrófagos necesario; cada pocillo en la placa de 96 pocillos requiere 200.000 células. Pipetee el número calculado de células en un tubo de centrífuga.

Centrifugar las células durante 10 minutos a 150 G a temperatura ambiente hasta una placa estéril de 96 pocillos de fondo redondo, lo que facilita la mezcla mientras se minimiza la pérdida de reactivo. Añadir dos microlitros de cada ARNi a cada pocillo que se transfectará. Téngase en cuenta que, dependiendo del número de ARNis, esto puede realizarse durante el paso de centrifugación de los macrófagos.

El aspecto más difícil de este procedimiento es la electroforesis, las claves son tratar las células con mucha suavidad y trabajar muy rápidamente. Una vez que las células están en una solución de transfección tóxica, aspire el medio de las células centrifugadas y luego resuspenda suavemente en la solución nucleofectora. SF que contiene la solución suplemento.

Transfiera inmediatamente las células a una cubeta estéril utilizando una pipeta multicanal, transfiriendo 20 microlitros de la mezcla celular resuspendida a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contiene los siARN, mezclando suavemente mediante pipeteo ascendente y descendente. A continuación, transfiera 20 microlitros de la mezcla celular INA a la placa nucleo vete de 96 pocillos. Es fundamental evitar la formación de burbujas durante este paso, ya que esto podría inducir errores durante la nucleoafectación.

Después de colocar todas las muestras experimentales en la placa de transfección, cúbrala con la tapa proporcionada y golpee suavemente la placa sobre una superficie dura. Para eliminar cualquier burbuja, coloque la placa de 96 pocillos en la embarcación nucleoefectora de 96 pocillos y, en la esquina inferior derecha de la pantalla del programa, seleccione cargar e iniciar. A continuación, siga las indicaciones del programa para guardar los resultados durante el proceso de nucleofección en los pocillos con éxito.

Los transfectados se representarán en el esquema de placa de 96 pocillos en la pantalla mediante un círculo verde con un signo más. Un círculo rojo con un signo menos indica un error, probablemente debido a burbujas o a la pipetación de un volumen incorrecto de reactivos inmediatamente después de la nucleofección. Utilice una pipeta multicanal para añadir 80 microlitros de RPMI 1640 precalentado.

Medio al lado de cada uno. Permita que el medio se mezcle lentamente con las células transfectadas, que en esta etapa son muy delicadas. Agregar el medio demasiado rápido disminuirá considerablemente la viabilidad.

Coloque la placa de 96 pocillos con las muestras transfectadas y RPMI 1640 en un incubador a 37 grados Celsius con 5 %CO2 durante dos minutos o más. Es fundamental permitir que las células se recuperen antes de cualquier manipulación adicional. Después de retirar la placa del incubador, utilice una pipeta multicanal para transferir cuidadosamente la mezcla de cada pocillo a una placa de cultivo celular de 96 pocillos.

Luego nuevamente, utilizando la pipeta multicanal, agregue 100 microlitros de DMEM con FBS a cada pocillo. Incube durante 24 a 36 horas inmediatamente después de la transfección y realice citometría de flujo tras el período de recuperación. Para evaluar la eficiencia de transfección del siRNA marcado fluorescentemente, más del 99 % de las células deben estar transfectadas al día siguiente de la transfección. En el ensayo de eficiencia de transfección del plásmido GFP, entre el 30 y el 50 % de las células deben expresar GFP. Tras la incubación de 24 a 36 horas, prepare el LPS u otros activadores de la inmunidad innata en medio fresco, diluyendo el LPS a una concentración final de 20 nanogramos por mililitro en DMEM con FBS.

Luego, aspire cuidadosamente el medio de la placa de 96 pocillos y agregue el medio fresco que contiene el LPS a las células. Coloque la placa en un incubador para monitorear la respuesta al LPS u otros estimuladores de la inmunidad innata en diversos momentos posteriores a la estimulación. Pipete el sobrenadante de las células hacia una placa de almacenamiento de 96 pocillos para su análisis mediante ELISA.

Después de eliminar el sobrenadante para monitorear la viabilidad celular, agregue 100 microlitros de diacetato de fluoresceína al uno a 100 en PBS a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante uno a cinco minutos. Monitoree la fluorescencia en las células utilizando un lector de placas cuando el compuesto sea escindido por las esterasas celulares en células viables. Este compuesto se vuelve fluorescente para ilustrar la utilidad de este enfoque para monitorear la respuesta inmune innata.

Se transfirieron siARN dirigidos contra genes reguladores inmunitarios innatos conocidos en la línea celular de macrófagos RAW 264.7. Luego, las células se estimularon con LPS y se monitoreó la producción de citocinas proinflamatorias, IL-6 y TNF-α, mediante ELISA, como se muestra aquí.

Inhibición del receptor tipo toll cuatro, el receptor para LPS, pero no de otros TLR. Mediante SIR, se observó una producción fuertemente reducida de IL seis y TNF alfa inducidas por LPS. Téngase en cuenta que la inhibición de IL seis con irna disminuyó la producción de IL seis, pero no afectó la producción de TNF alfa.

Estos datos sugieren una buena eficacia y una buena especificidad del silenciamiento mediado por ARNip de reguladores candidatos de la inmunidad innata. Es importante recordar que la clave para una buena transfección y una buena recuperación celular consiste en trabajar con células muy sanas, tratarlas con suavidad durante los procesos de transfección y recuperación, y trabajar rápidamente una vez que las células se encuentran en una solución nucleo efectora. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar muchos otros ensayos, incluyendo QPCR para monitorear el silenciamiento génico y numerosos otros ensayos para investigar la respuesta inmune innata.