Name: Análisis de las reacciones de procesamiento del ARN que utilizan teléfonos Free Systems: 3 End división de pre-mRNA Sustratos In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a analizar el procesamiento del ARN en el extremo 3' de pre-ARNm in vitro utilizando extractos nucleares activos y sustratos marcados radiactivamente. Este método permite estudiar los mecanismos de maduración del ARN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SV agradece el apoyo financiero del NIH K22AI077353 y la Fundación Landenberger. KR agradece el financiamiento de los NIH (5SC1GM083754).

<ol><li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Wahle, E., Ruegsegger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-End+processing+of+pre-mRNA+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">3'-End processing of pre-mRNA in eukaryotes.</a> FEMS microbiology reviews. 23, 277-295 (1999).</li>
<li>Colgan, D. F., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+mRNA+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of mRNA polyadenylation.</a> Genes Dev. 11, 2755-2766 (1997).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA biology. 9, 563-576 (2012).</li>
<li>Danckwardt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prothrombin+3%27end+formation+signal+reveals+a+unique+architecture+that+is+sensitive+to+thrombophilic+gain-of-function+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The prothrombin 3'end formation signal reveals a unique architecture that is sensitive to thrombophilic gain-of-function mutations.</a> Blood. 104, 428-435 (2004).</li>
<li>Moreira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstream+sequence+element+of+the+C2+complement+poly%28A%29+signal+activates+mRNA+3%27+end+formation+by+two+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The upstream sequence element of the C2 complement poly(A) signal activates mRNA 3' end formation by two distinct mechanisms.</a> Genes Dev. 12, 2522-2534 (1998).</li>
<li>Hall-Pogar, T., Zhang, H., Tian, B., Lutz, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+cyclooxygenase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of cyclooxygenase-2.</a> Nucleic Acids Res. 33, 2565-2579 (2005).</li>
<li>Brackenridge, S., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+a+basal+polyadenylation+factor+by+the+upstream+sequence+element+of+the+human+lamin+B2+polyadenylation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of a basal polyadenylation factor by the upstream sequence element of the human lamin B2 polyadenylation signal.</a> Molecular and Cellular Biology. 20, 2660-2669 (2000).</li>
<li>Moore, C. L., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+cleavage+and+polyadenylation+of+exogenous+RNA+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accurate cleavage and polyadenylation of exogenous RNA substrate.</a> Cell. 41, 845-855 (1985).</li>
<li>Gilmartin, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGilmartin%2C+GM+%22mRNA+formation+and+function%22">mRNA formation and function</a>. , Academic Press. New York. 79-98 (1997).</li>
<li>Wahle, E., Keller, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahle%2C+E+%22RNA+Processing.+Vol.+II%22">RNA Processing. Vol. II</a>. , Oxford University Press. 1-34 (1994).</li>
<li>Chabot, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChabot%2C+B+%22RNA+Processing+Vol+I%22">RNA Processing Vol I</a>. 1, Oxford University Press. 1-29 (1994).</li>
<li>Valente, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+mRNA+3%27+end+processing+is+distinctively+regulated+by+eIF3f%2C+CDK11%2C+and+splice+factor+9G8%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 mRNA 3' end processing is distinctively regulated by eIF3f, CDK11, and splice factor 9G8.</a> Mol Cell. 36, 279-289 (2009).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li>
<li>Aurup, H., Williams, D. M., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Fluoro-+and+2%27-amino-2%27-deoxynucleoside+5%27-triphosphates+as+substrates+for+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">2'-Fluoro- and 2'-amino-2'-deoxynucleoside 5'-triphosphates as substrates for T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 31, 9636-9641 (1992).</li>
<li>Keller, W., Bienroth, S., Lang, K. M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+and+polyadenylation+factor+CPF+specifically+interacts+with+the+pre-mRNA+3%27+processing+signal+AAUAAA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA.</a> EMBO J. 10, 4241-4249 (1991).</li>
<li>Takagaki, Y., Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+factors+are+required+for+3%27-end+cleavage+of+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Four factors are required for 3'-end cleavage of pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 3, 1711-1724 (1989).</li>
<li>Takagaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multisubunit+factor%2C+CstF%2C+is+required+for+polyadenylation+of+mammalian+pre-mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A multisubunit factor, CstF, is required for polyadenylation of mammalian pre-mRNAs.</a> Genes Dev. 4, 2112-2120 (1990).</li>
<li>Ruegsegger, U., Blank, D., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+Im+is+related+to+spliceosomal+SR+proteins+and+can+be+reconstituted+in+vitro+from+recombinant+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor Im is related to spliceosomal SR proteins and can be reconstituted in vitro from recombinant subunits.</a> Mol Cell. 1, 243-253 (1998).</li>
<li>Vries, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pre-mRNA+cleavage+factor+II%28m%29+contains+homologs+of+yeast+proteins+and+bridges+two+other+cleavage+factors%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human pre-mRNA cleavage factor II(m) contains homologs of yeast proteins and bridges two other cleavage factors.</a> EMBO J. 19, 5895-5904 (2000).</li>
<li>Gilmartin, G. M., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ordered+pathway+of+assembly+of+components+required+for+polyadenylation+site+recognition+and+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An ordered pathway of assembly of components required for polyadenylation site recognition and processing.</a> Genes Dev. 3, 2180-2190 (1989).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+human+pre-mRNA+3%27+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex.</a> Mol Cell. 33, 365-376 (2009).</li>
<li>Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+co-transcriptional+recruitment+of+pre-mRNA+processing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: co-transcriptional recruitment of pre-mRNA processing factors.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 251-256 (2005).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+cleavage+and+polyadenylation%3A+the+long+and+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative cleavage and polyadenylation: the long and short of it.</a> Trends Biochem Sci. 38, 312-320 (2013).</li>
<li>Ryner, L. C., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+accurate+and+efficient+mRNA+3%27+end+cleavage+and+polyadenylation+of+a+simian+virus+40+early+pre-RNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirements for accurate and efficient mRNA 3' end cleavage and polyadenylation of a simian virus 40 early pre-RNA in vitro.</a> Molecular and Cellular Biology. 7, 495-503 (1987).</li>
<li>Hirose, Y., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+phosphate%2C+not+ATP%2C+is+required+for+3%27+end+cleavage+of+mammalian+pre-mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Creatine phosphate, not ATP, is required for 3' end cleavage of mammalian pre-mRNA in vitro.</a> J Biol Chem. 272, 29636-29642 (1997).</li>
<li>Ryan, K., Khleborodova, A., Pan, J., Ryan, X. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+activators+of+pre-mRNA+3%27+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Small molecule activators of pre-mRNA 3' cleavage.</a> RNA. 15, 483-492 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La reacción de escisión in vitro de pre-ARNm 3 &#39;, llevado a cabo en los extractos nucleares de células HeLa o con factores de escisión se fraccionó a partir de estos extractos, ha permitido la identificación de los factores de división de núcleo y sus principales complejos de 16-21. Muchos más proteínas asociadas a estos factores se han identificado recientemente 22, y la reacción in vitro pueden continuar para arrojar luz sobre cómo estas proteínas contribuyen a la reacción. ...

La biosíntesis de la mayoría de los ARN de mensajes eucariotas maduros (ARNm) requiere varias modificaciones post-transcripcionales tales como nivelación, empalme y poliadenilación. Estas modificaciones se acoplan generalmente para asegurar su correcto procesamiento 1 y aumentar fuertemente la estabilidad del ARNm. El 3 &#39;final de la formación de mamífero pre-ARNm se genera mediante la escisión endonucleolítica de la ARN naciente seguido de la adición de residuos de adenilato a la 5&#39; producto escindido por poli (A) polimerasa (PAP) 2-4. En los mamíferos, la escisión se lleva a cabo por un complejo de proteína de varios componentes, de aproximadamente 800 kDa, que se ensambla en las secuencias de pre-ARN específicos. El poli (A) secuencia señal, una secuencia de hexanucleótidos altamente conservada canónica AAUAAA, dirige el sitio de escisión en aproximadamente 10-30 nt aguas abajo. Este sitio se reconoce específicamente por el factor de división y de poliadenilación especificidad (CPSF) y la 73 kD subunidad deCSPF contiene la actividad endonucleasa. El factor de estimulación de escisión (CSTF) se une a una más degenerada GU-o U-rica secuencia de elemento aguas abajo de la poli (A) sitio. También se requiere para la escisión es el factor de escisión I de mamífero (CFIM), y el factor de escisión de mamífero II (CFII). CFIM une los sitios específicos UGUA (N) en elementos de la secuencia aguas arriba (usos) que han sido definidos por un número de genes y parecen estar implicados en importantes procesos fisiológicos 5-8. In vitro, las reacciones de procesamiento del ARN son comúnmente analizados por el uso de sustratos de ARN radiomarcados 9-12. Estos pueden ser sintetizados por transcripción escorrentía del bacteriófago promotor T7 o SP6. Cuando se estudia un sitio de poliadenilación que no se ha caracterizado antes, es necesario el uso de ADN genómico en lugar de ADNc para generar el sustrato de ARN, como importantes secuencias aguas abajo pueden no estar presentes en el ADNc. Sustratos de diseño para incluir al menos 150 nt upstream y 50 nt aguas abajo del sitio de escisión / final en el ARNm maduro. El producto de escisión migra más rápido que el sustrato; Sin embargo, debido a que otros fragmentos pueden ser generados por la acción de nucleasas no específicas, la especificidad de la reacción tiene que ser verificada por su dependencia de las secuencias de señal de procesamiento correctos. Por lo tanto, los sustratos de ARN con una mutación puntual en la secuencia AAUAAA (por ejemplo AAGAAA) sirven como un control negativo de la reacción de escisión. Dado que una pequeña cantidad de ARN radiomarcado se utiliza para las reacciones de escisión, RNasas presentes en gran abundancia en la mayoría de los extractos nucleares pueden ser problemáticas, y limitar la elección del material de partida para la preparación del extracto. Células HeLa tienden a contener niveles bajos de RNasas endógenas, y por lo tanto un buen rendimiento en estos ensayos. La escisión endonucleolítica de los sustratos de RNA in vivo e in vitro es seguida inmediatamente por la poli (A) Además, jues del intermedio escindida no está presente en cantidades detectables. Por lo tanto, para estudiar o bien una secuencia o proteínas implicadas en una reacción de escisión de ARN específico, los experimentos se llevan a cabo en condiciones que impidan de poliadenilación que se produzcan. No hay dependencia de la escisión de poliadenilación, o viceversa, por lo que se puede dejar de poliadenilación sin perjudicar la reacción de escisión. Por lo tanto, el ATP se sustituye con un análogo de terminación de cadena que carece de grupo hidroxilo 3 &#39;de modo que sólo un único nucleótido se puede incorporar en el sitio de poli (A) y sólo ARN escindido puede ser detectado. Dada la complejidad y el alto grado de particularidad de este tipo de ensayo, se describe un protocolo detallado de vídeo para estudiar la escisión endonucleolítica por la maquinaria de escisión / poli (A) de los precursores de ARNm in vitro. Se describe cómo preparar extractos nucleares competentes, generar ARN sustratos radiomarcados, lleve a cabo la reacción de escisión, y analizar e interpretar el resultadoproductos ing. Figura 1 muestra un ejemplo de los ARN de sustrato que codifican para el extremo 3 &#39;del VIH-1 de pre-ARNm para ser utilizado para un ensayo de escisión. El extremo 3 &#39;del genoma de ARN del VIH se compone de muchas secuencias reguladoras importantes, tales como el sitio poli (A), una región rica en G+ T, y el elemento de uso, que son todos necesarios para la maduración eficiente de los transcritos de ARNm virales 13 . En este ejemplo, se esperaría que el sustrato de ARN de entrada sea 338 nt y tras la escisión 237 nt. Si poliadenilación se permite que ocurra, se observó una mancha de productos entre 237 y 437 nt.

<table><tbody><tr><td>Matraz Celstir de 1 L</td><td>Wheaton</td><td>356884</td><td>Diferentes tamaños disponibles Agitador</td></tr><tr>de<td>baja velocidad de 4 posiciones</td><td>VWR</td><td>12621-076</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de cangilón oscilante</td><td>Beckman Coulter Allegra</td><td></td><td>x-15R con rotor SX4500</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Optima L-100 XP Ultra con rotor SW41</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa 5417R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Refridgerated</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>incubadora Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml tubos cónicos</td><td>Corning</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubos cónicos</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Tubos centrífugos ultraclear</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>JOKLIK modificado MEM</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlas</td><td>F-0500-A</td><td>Inactivado por calor</td></tr><tr><td>L-glut:pen:strep</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 8.0</td><td>Mediatech</td><td>46-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>MP Biomedicals 194844</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Alexis Biomedicals</td><td>280-001-G-010</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>5 M solución de cloruro sódico</td><td>Mediatech</td><td>46-032-CV</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Fisher</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos completos de cóctel de inhibidores de proteasas sin EDTA</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Kit de casetes de diálisis Slide-A-Lyzer Thermo</td><td>Scientific</td><td>66372</td><td>MWCO 7,000 0,5 ml-3 ml</td></tr><tr><td>15 ml Juego de molinillo de tejidos Dounce</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938-1SET</td><td>Diferentes tamaños disponibles</td></tr><tr><td>Ampliar kit de PCR de alta fidelidad</td><td>Roche</td><td>11 732 650 001</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>Invitrogen</td><td>Y02256</td><td>10 mM cada nucleótido</td></tr><tr><td>MaxiScript SP6/T7 kit</td><td>Ambion</td><td>AM1322</td><td></td></tr><tr><td>m7G(5')ppp(5') G Tapa de ARN</td><td>New England Biolabs</td><td>S1404S</td><td></td></tr><tr><td>Century Marker Template Plus</td><td>Ambion</td><td>AM7782</td><td></td></tr><tr><td>Easytides UTP [&alpha;-32P] 250 &mu; Ci</td><td>Perkin Elmer BLU507H250UC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de carga de gel II</td><td>Ambion</td><td>8546G</td><td></td></tr><tr><td>Agua tratada DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>10x TAE</td><td>Fisher</td><td>BP13354</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Ameresco Life Sciences</td><td>0658-4L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Fisher</td><td>BP169-212</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Fisher</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>40% 19:1 acrilamida:bis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Roche</td><td>10 901 393 001</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol absoluto 200 proof</td><td>Acros</td><td>61509-0040</td><td></td></tr><tr><td>Fenol ácido:cloroformo</td><td>Ambion</td><td>9720</td><td>para ARN</td></tr><tr><td>Fluido de centelleo</td><td>Fisher</td><td>SX18-4</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de la rnasa</td><td>Promega</td><td>N261B</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol polivinílico- PVA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de creatina</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATP</td><td>Fisher</td><td>BP2560-4</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Acros</td><td>23042-5000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Fisher</td><td>BP1700-100</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de secuenciación ajustable</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351881-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de encuadernación</td><td>Office Depot</td><td>838-056</td><td></td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm placas de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Z352543 1 JUEGO</td></tr><tr><td>Placas de vidrio de 20 cm x 22 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35252-7</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>20 cm x 42 cm placas de refrigeración de aluminio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352667</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>Espaciadores de 0,4 mm x 22 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35230-6</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>Espaciadores de 0,4 mm x 42 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z352314-1</td><td>1 SET</td></tr><tr><td>Peine de 8 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z35195-4</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>peine de 16 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351962</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>peine de 32 pocillos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z351970</td><td>1 EA</td></tr><tr><td>Recubrimiento repelente de gel</td><td>C.B.S. Scientific</td><td>SGR-0401</td><td>o SGR-0101 para botellas individuales</td></tr><tr><td>Puntas de carga de gel</td><td>Rainin</td><td>GT-10-4</td><td>0.1-10 &mu; l</td></tr><tr><td>Secuenciación PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>PowerPac HV</td><td>5.000 V/500 mA/400 W</td></tr><tr><td>Secador de gel modelo 583</td><td>Bio-Rad</td><td>modelo 583</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío hidrotécnica para secador de gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glogos II Rotuladores que brillan en la oscuridad</td><td>Agilent</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Película 8 x 10</td><td>Midsci</td><td>BX810</td><td></td></tr><tr><td>Película 14 x 17</td><td>Phenix</td><td>F-BX1417</td><td></td></tr><tr><td>Casete de autorradiografía</td><td>Fisher</td><td>FBCA 1417</td><td>tamaño 8 x 10 disponible</td></tr></tbody></table>

análisis de las reacciones de procesamiento del arn que utilizan teléfonos free systems: 3 &#39;end división de pre-mrna sustratos<em&gt; in vitro</em

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

El extremo 3 &#39;de los ARNm de mamíferos no se forma por la terminación abrupta de la transcripción por ARN polimerasa II (RNPII). En lugar de ello, RNPII sintetiza ARNm precursor de más allá del final de los ARN maduros, y se requiere un proceso activo de actividad endonucleasa en un sitio específico. La escisión del precursor de ARN se produce normalmente 10-30 nt aguas abajo del sitio poliA consenso (AAUAAA) después de los dinucleótidos CA. Las proteínas del complejo de escisión, un complejo de proteína multifactorial de aproximadamente 800 kDa, lograr esta actividad nucleasa específica. Secuencias de ARN específicas de aguas arriba y aguas abajo del sitio poliA controlan el reclutamiento del complejo de escisión. Inmediatamente después de la escisión, pre-mRNAs se polyadenylated por la poli-polimerasa (PAP) para producir madurar mensajes de ARN estables. Procesamiento del extremo 3 &#39;de un transcrito de ARN puede ser estudiada usando extractos nucleares celulares con sustratos específicos de ARN radiomarcados. En suma, una larga 32 &lt;/ Sup&gt; sin escindir ARN precursor de P-etiquetados se incuba con extractos nucleares in vitro, y la escisión se evaluó por electroforesis en gel y autorradiografía. Cuando se produce la escisión adecuada, una más corta 5 &#39;escindido producto se detecta y se cuantifica. Aquí se describe la división de ensayo en detalle utilizando, por ejemplo, el procesamiento de extremo 3 &#39;del VIH-1 mRNAs.

Los resultados representativos de un ensayo de escisión del ARN poli (A) los sitios de VIH-1 (Figura 2). Podemos observar el sustrato de ARN no escindido, que es la banda de migración más lenta en la parte superior del gel. El producto escindido específica es la más intensa banda del fragmento más corto que corre más rápido en el gel en el tamaño esperado, y es específicamente ausentes del ensayo de escisión de la mutpoly (A) de control que contiene una mutación puntual en la secuencia de poliA (mutPoly...

ARN polimerasa II sintetiza un precursor de ARN que se extiende más allá del extremo 3 &#39;del ARNm maduro. El final de la ARN maduro se genera cotranscriptionally, en un sitio de dictado por las secuencias de ARN, a través de la actividad de endonucleasa del complejo de escisión. Aquí, detalle el método para estudiar las reacciones de escisión in vitro.

Análisis de las reacciones de procesamiento del ARN que utilizan teléfonos Free Systems: 3 &#39;End división de pre-mRNA Sustratos<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

El objetivo general de este procedimiento es examinar con éxito la escisión de ARNm en la posición tres prima in vitro. Esto se logra primero obteniendo un extracto nuclear transcricionalmente activo a partir de células cultivadas en suspensión. El segundo paso del procedimiento consiste en obtener sustratos de ARN marcados radiactivamente mediante transcripción in vitro.El tercer paso consiste en purificar por electroforesis en gel los sustratos de ARN marcados. El paso final es ensamblar la reacción de escisión, que incluye el extracto nuclear y el sustrato de ARN marcado. En última instancia, los resultados pueden mostrar el ARNm tres primas, sustratos no escindidos y el producto escindido mediante electroforesis en gel vertical radiactiva.La demostración visual de este método es importante, aunque se ha realizado desde los años 80, no es fácil de ejecutar ya que existen muchos pasos específicos a lo largo del procedimiento que resultan complicados. Tenga las células lavadas, sedimentadas y listas para la lisis. Para iniciar este protocolo, agregue al sedimento celular tampón con DTT fresco.Añada cinco volúmenes del CPV estimado y utilice una pipeta para deshacer el precipitado y permita que la suspensión se enfríe en hielo. Después de 10 minutos, centrifugue las células a cuatro grados Celsius en un rotor de cabezal oscilante. Centrifugue y aspire cuidadosamente el sobrenadante.El precipitado habrá absorbido algo de solución y aumentado de tamaño. A continuación, añada un volumen celular de tampón A y desintegre suavemente el precipitado con la punta de una pipeta. Vierta la suspensión en un homogenizador previamente enfriado y lise las células con cinco a doce movimientos de un pistilo ajustado.Retire una pequeña alícuota, añada tripan azul y examine las células para determinar la completitud de su lisis. Si es necesario, continúe homogenizando las células hasta que estén lisadas en un 90%, pero no exagere. Ahora transfiera el lisado a un tubo ultracentrífugo ultratransparente.Registre el volumen total y centrifugue como se hizo previamente. Aspire el sobrenadante turbio y guárdelo en hielo. Para el análisis del citosol, tenga cuidado de no perturbar el precipitado.Contiene los núcleos. A continuación, centrifugue el precipitado a alta velocidad durante 15 minutos. Retire el pequeño volumen de sobrenadante restante y combínelo con la recolección de citosol.Luego, determine el volumen nuclear de PACT. Añada un volumen equivalente de tampón C al precipitado. A continuación, despegue el precipitado utilizando la pipeta en un homogenizador limpio con movimiento descendente.Utilice de cinco a diez movimientos firmes con el pistilo para resuspender. Suspender el precipitado. Transfiera el homogenato a un tubo enfriado y mezcle mediante inversiones durante 30 minutos.A cuatro grados Celsius, puede utilizarse una placa agitadora. Si el volumen es suficientemente grande, transfiera el lisado a un tubo ultracentrífugo UltraClear y, a cuatro grados Celsius, centrifúguelo durante 30 minutos. A aproximadamente 25.000 gs, el sobrenadante constituye el extracto nuclear.Tras seguir el protocolo escrito, complete la diálisis a partir de solo un microgramo de molde. Prepare la sonda mediante transcripción in vitro utilizando un kit con un promotor compatible con SP seis o T siete. Al cargar la página, use tres microlitros de marcador y los 25 microlitros completos de la reacción para cada sustrato de ARN.Además, evite la contaminación cruzada separando las bandas de transcripciones de tamaño similar. Corra el gel de manera que una sonda de 600 nucleótidos corra a 25 vatios durante aproximadamente dos horas después. Para marcar la ubicación de las bandas del gel, ilumine la película expuesta con una caja de luz y coloque el gel envuelto encima.Alinee el marcador automático y el marcador expuesto en la película. Luego marque las posiciones de las bandas con un marcador negro para eliminar las bandas. Desenrolle el gel. Con una cuchilla limpia, corte las secciones de las bandas del gel, transfiera cada sección a un tubo separado y eluya el ARN siguiendo los procedimientos estándar.Después de preparar todos los reactivos, caliente el ARN marcado a 80 grados Celsius durante dos minutos. Luego transfiera el ARN a hielo, al vórtex, al PVA al 10 % y después centrifúguelo a alta velocidad durante unos minutos para eliminar las burbujas; a continuación, proceda a preparar las mezclas maestras para cada reacción. Para cada reacción, distribuya 5,25 microlitros de la mezcla maestra uno.A continuación, agregue 6,25 µL de la mezcla de extracto nuclear. Luego, agregue 1 µL de sustrato de ARN marcado diluido a 50 amol en total. Cada reacción utiliza menos de 5 amol de ARN marcado.Ahora, vortexe suavemente y centrifugue rápidamente las mezclas de reacción. Permita que la reacción transcurra hasta dos horas a 30 grados Celsius. Realizar un curso temporal de la reacción proporcionará los mejores resultados. Después de usar proteinasa K para digerir la proteína en la reacción y purificar luego la reacción mediante el método de fenol-cloroformo, cargue los productos en un gel PAGE al 6 %, utilizando tres microlitros de marcador o cinco microlitros por producto de reacción por pozo.Luego, corra el gel y posteriormente desarme cuidadosamente el aparato de electroforesis. Para recolectar el gel, presione firmemente un papel filtro contra él y inviértalo. Presione con firmeza el vidrio para asegurar que el gel quede completamente adherido al papel.Luego, retire lentamente el papel filtro con el gel adherido. Envuelva el lado expuesto del gel en plástico y sujete con cinta el envoltorio al papel filtro en el lado opuesto. Termine colocando el gel en un secador durante 15 minutos con el papel filtro orientado hacia el vacío.Posteriormente, analice el gel exponiéndolo a una película o a un revelador de fósforo. El sustrato de ARN escindido es la banda que migra más lentamente, localizada en la parte superior del gel.El producto específico cortado, marcado con una flecha en negrita, migra más rápido en el gel con el tamaño esperado. Este producto está ausente en el control con una mutación puntual en la secuencia pollier. La cuantificación de la actividad de corte se determinó mediante un gráfico métrico DS.Comparación de la relación entre ARN escindido y ARN escindido, normalizado respecto al control de ARN escindido. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo de poliadenilación, para responder preguntas adicionales, como la actividad de la poliA polimerasa. Este ensayo se realiza modificando las condiciones de la reacción, por ejemplo, añadiendo magnesio y eliminando el EDTA.

analysis-rna-processing-reactions-using-cell-free-systems-3-end

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un método simple para la recolección de las células individuales de rata cultivos primarios de neuronas y posterior análisis de transcriptoma utilizando la amplificación ARNA. Este enfoque es generalizable a cualquier tipo de célula.

El análisis del transcriptoma de células individuales

CRISPR / Cas sistemas median la inmunidad adaptativa en bacterias y arqueas. Muchas proteínas CAS se propone actuar como endoribonucleases que actúan sobre los precursores crRNA de longitud variable. Aquí se ilustran tres enfoques diferentes para generar pre-crRNA sustratos para el análisis bioquímico de la actividad endonucleasa de Cas.

Sustrato Generación para endonucleasas de CRISPR / Cas Sistemas

Describimos aquí un método de extensión de cebadores basado en fluorescencia para determinar los puntos de partida transcripcionales a partir de transcripciones bacterianas y el procesamiento de ARN in vivo utilizando un secuenciador de gel automatizado.

Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo

Este protocolo describe un método para asignación pre-mRNA 3' final sitios de procesamiento.

Extremo 3' secuencia biblioteca elaboración con Sec2 A

La dos diferentes 3' amplificación rápida del cDNA extremos (3' RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3' UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.

Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.

Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

Aquí, describimos el conjunto de complejos de alargamiento de ARN polimerasa II (Pol II) que requieren sólo ADN sintético corto y oligonucleótidos de ARN y Pol II purificado. Estos complejos son útiles para estudiar los mecanismos subyacentes al procesamiento co-transcripcional de transcripciones asociadas con el complejo de elongación Pol II.

Complejos de alargamiento de ARN polimerasa artificial II para disecar eventos de procesamiento de ARN co-transcripcional

Aquí presentamos un protocolo para el escote dependiente de DNAzyme de ARN. Esto permite un análisis rápido y dependiente del sitio del ARN 2'-O-metilación. Este enfoque se puede utilizar para la evaluación preliminar o importante de la actividad del esnoRNA.

Análisis dependiente de DNAzyme de rRNA 2'-O-Methylation

Presentamos un protocolo para medir la dinámica de micro a milisegundos en 13C/15N-etiquetado y no etiquetado ARN con 1H R1ρ  dispersión de dispersión de relajación espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN). El enfoque de este protocolo radica en la preparación de muestras de alta pureza y la configuración de experimentos de RMN.

Aspectos prácticos de la preparación de muestras y la configuración de 1H R1ρ Experimentos de dispersión de relajación de ARN

La estructura secundaria del ARN se ha observado principalmente en ARN maduro mediante métodos de sondeo estructural. La secuenciación de seguimiento de estructura co-transcripcional (CoSTseq) unifica el funcionamiento nuclear, que se ha utilizado para estudiar la posición de la polimerasa en ARN naciente, mediante sondeo estructural. CoSTseq permite así la observación de la estructura secundaria del ARN en ARN bajo transcripción activa.

Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a analizar el procesamiento del ARN en el extremo 3' de pre-ARNm in vitro utilizando extractos nucleares activos y sustratos marcados radiactivamente. Este método permite estudiar los mecanismos de maduración del ARN.

Análisis de las reacciones de procesamiento del ARN que utilizan teléfonos Free Systems: 3 End división de pre-mRNA Sustratos In vitro (Video) | JoVE Journal

Análisis de las reacciones de procesamiento del ARN que utilizan teléfonos Free Systems: 3 'End división de pre-mRNA Sustratos

Explorar más videos