Análisis de las reacciones de procesamiento del ARN que utilizan teléfonos Free Systems: 3 'End división de pre-mRNA Sustratos In vitro
May 3rd, 2014
ARN polimerasa II sintetiza un precursor de ARN que se extiende más allá del extremo 3 'del ARNm maduro. El final de la ARN maduro se genera cotranscriptionally, en un sitio de dictado por las secuencias de ARN, a través de la actividad de endonucleasa del complejo de escisión. Aquí, detalle el método para estudiar las reacciones de escisión in vitro.
El objetivo general de este procedimiento es examinar con éxito la escisión in vitro de tres ARNm principales. Esto se logra haciendo primero un extracto nuclear transcripcionalmente activo a partir de células cultivadas en suspensión. El segundo paso del procedimiento es crear sustratos de ARN marcados con radio mediante transcripción in vitro.
El tercer paso es purificar en gel los sustratos de ARN marcados. El paso final es ensamblar la reacción de escisión, incluido el extracto nuclear y el sustrato de ARN marcado. En última instancia, los resultados pueden mostrar tres ARNm principales, sustratos escindidos UNC y productos escindidos a través de electroforesis vertical en gel radiactivo.
La demostración visual de este método es importante, a pesar de que se ha realizado desde la década de 1980, no es fácil de ejecutar, ya que hay muchos pasos específicos a lo largo del procedimiento que son desafiantes. Tienen las células lavadas, granuladas y listas para el lisado. Para comenzar este protocolo a la célula pellet, agregue tampón con DTT fresco.
Agregue cinco volúmenes del CPV estimado y use una pipeta para romper el pellet y permitir que la suspensión se enfríe en el hielo. Después de 10 minutos, gire las celdas hacia abajo a cuatro grados centígrados en un balde oscilante. Centrifugar con cuidado el sobrenadante.
El pellet habrá absorbido algo de solución y habrá aumentado de tamaño. A continuación, añada un CPV de tampón A y rompa suavemente el pellet con una punta de pipeta. Vierta la suspensión en un homogeneizador enfriado y, con cinco a 12 golpes de un mortero apretado, limpie las celdas.
Retire una pequeña alícuota, aplique azul de trian y revise las células para determinar la integridad de su lisis. Si es necesario, continúe homogeneizando las células hasta que estén lisadas en un 90%, pero no se exceda. Ahora transfiera el lisado a un tubo ultracentrífugo ultra claro.
Registre el volumen total y gírelo como se hizo anteriormente. Aspire el sobrenadante turbio y guárdelo en hielo. Y para el análisis de citosol, tenga cuidado de no alterar el pellet.
Contiene los núcleos. A continuación, gire el pellet a alta velocidad durante 15 minutos. Retire el pequeño volumen de sobrenadante restante y acompáñelo con la colección de citosol.
A continuación, determine el volumen nuclear de PACT. Añada un volumen equivalente al tampón C al pellet. A continuación, desaloje el pellet con la pipeta en un homogeneizador de limpieza.
Use de cinco a 10 golpes de mortero apretados para recuperar. Suspenda el pellet. Transfiera el homogeneizado a un tubo enfriado y mezcle por inversión durante 30 minutos.
A cuatro grados centígrados, se puede utilizar una placa de agitación. Si el volumen es lo suficientemente grande, transfiera el lisado a un tubo de ultracentrífuga UltraClear y, a cuatro grados centígrados, gírelo hacia abajo durante 30 minutos. A unos 25.000 gs, el sobrenadante es el extracto nuclear.
Siguiendo el protocolo de texto, complete la diálisis a partir de un solo microgramo de plantilla. Prepare la sonda mediante transcripción in vitro utilizando un kit con un promotor compatible con SP six o T seven. Al cargar la página, utilice tres microlitros de marcador y los 25 microlitros de la reacción para cada sustrato de ARN.
También evite la contaminación cruzada espaciando los carriles de transcripciones de tamaño similar. Haga funcionar el gel de tal manera que una sonda de 600 nucleótidos funcione a 25 vatios durante unas dos horas después. Para marcar la ubicación de las bandas de gel, ilumine la película expuesta con una caja de luz y coloque el gel envuelto encima.
Alinee el marcador de radiación automática y el marcador expuesto en la película. Y luego marque las ubicaciones de las bandas con un marcador negro para quitar las bandas Desenvuelva el gel. Y con una cuchilla limpia, extirpe las secciones de banda del gel, transfiera cada sección a su propio tubo y eluya el ARN siguiendo los procedimientos estándar.
Una vez que se hayan preparado todos los reactivos, caliente el ARN marcado a 80 grados centígrados durante dos minutos. Luego transfiera el ARN al vórtice de hielo, el 10% de PVA, y luego gírelo a alta velocidad durante unos minutos para eliminar las burbujas, luego proceda a hacer las mezclas maestras para cada reacción. Para cada reacción, dispense 5,25 microlitros de master mix one.
A continuación, añade 6,25 microlitros de la mezcla de extracto nuclear. A continuación, añada un microlitro de sustrato de ARN marcado diluido hasta 50 ano molares en total. Cada reacción utiliza menos de cinco ARN marcado con ano molares.
Ahora, vórtice suavemente y gire rápidamente las mezclas de reacción. Permita que la reacción tenga lugar durante un máximo de dos horas a 30 grados centígrados. Tomar un curso de tiempo de la reacción proporcionará los mejores resultados Después de usar la proteinasa K para digerir la proteína en la reacción y luego purificar la reacción Usando el método de cloroformo de fenol, ejecute los productos en una carga de página del 6%, tres microlitros de marcador o cinco microlitros por producto de reacción por carril.
A continuación, ejecute el gel y desmonte con cuidado el aparato de gel. Para recoger el gel, presione el papel de filtro firmemente contra él y déle la vuelta. Presione firmemente el vidrio para asegurarse de que el gel quede completamente agarrado por el papel.
A continuación, despega lentamente el papel de filtro con el gel adherido. Envuelve el lado expuesto del gel en plástico y pega la envoltura al papel de filtro en el otro lado. Termina colocando el gel en una secadora durante 15 minutos con el papel de filtro mirando hacia el vacío.
Más tarde, analice el gel exponiéndolo a una película o a un generador de imágenes de fósforo. El escindido. El sustrato de ARN es la banda migratoria más lenta en la parte superior del gel.
El producto escindido específico marcado con una flecha en negrita, corre más rápido en el gel al tamaño esperado. Este producto está ausente del control con una mutación puntual en la secuencia de Pollier. La cuantificación de la actividad de escisión se determinó con un gráfico métrico DS.
Comparación de la proporción de ARN escindido a escindido, normalizado con el control de ARN escindido. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo de poliadenilación, para responder a preguntas adicionales, como la actividad de la poliA polimerasa. Este ensayo se realiza alterando las condiciones de reacción, como la adición de magnesio y la eliminación de EDTA.
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Visión general
Este estudio se centra en el examen de la escisión de tres prime del ARNm in vitro, un proceso crucial en la maduración del ARN. El método implica el uso de extracto nuclear transcripcionalmente activo y sustratos de ARN radio etiquetados para analizar las reacciones de escisión.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología del ARN
- Biología molecular
- Bioquímica
Fundamentos
- La ARN polimerasa II sintetiza ARN precursor que se extiende más allá del extremo 3' del ARNm maduro.
- El complejo de escisión determina el sitio para la generación de ARN maduro.
- Los procesos cotranscripcionales son esenciales para la maduración del ARN.
- Entender las reacciones de escisión puede proporcionar información sobre los mecanismos de procesamiento del ARN.
Propósito del estudio
- Examinar la escisión de tres prime del ARNm in vitro.
- Entender el papel de los extractos nucleares en el procesamiento del ARN.
- Analizar los productos de las reacciones de escisión mediante electroforesis en gel.
Métodos utilizados
- Preparación de extracto nuclear transcripcionalmente activo a partir de células cultivadas en suspensión.
- Síntesis de sustratos de ARN radio etiquetados mediante transcripción in vitro.
- Purificación en gel de sustratos de ARN etiquetados.
- Ensamblaje de reacciones de escisión con extracto nuclear y sustratos de ARN etiquetados.
Principales resultados
- Se observó la escisión exitosa de sustratos de ARNm de tres prime.
- Los resultados se analizaron mediante electroforesis en gel radioactivo vertical.
- Se identificaron sustratos escindidos por UNC y productos escindidos.
- La metodología proporciona un marco para estudiar las reacciones de escisión del ARN.
Conclusiones
- Este estudio describe un método confiable para examinar la escisión del ARNm in vitro.
- Entender los mecanismos de escisión puede mejorar el conocimiento del procesamiento del ARN.
- Los resultados contribuyen al campo más amplio de la biología del ARN.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
