Análisis de las reacciones de procesamiento del ARN que utilizan teléfonos Free Systems: 3 'End división de pre-mRNA Sustratos In vitro
3 de mayo de 2014
ARN polimerasa II sintetiza un precursor de ARN que se extiende más allá del extremo 3 'del ARNm maduro. El final de la ARN maduro se genera cotranscriptionally, en un sitio de dictado por las secuencias de ARN, a través de la actividad de endonucleasa del complejo de escisión. Aquí, detalle el método para estudiar las reacciones de escisión in vitro.
El objetivo general de este procedimiento es examinar con éxito la escisión in vitro de tres ARNm principales. Esto se logra haciendo primero un extracto nuclear transcripcionalmente activo a partir de células cultivadas en suspensión. El segundo paso del procedimiento es crear sustratos de ARN marcados con radio mediante transcripción in vitro.
El tercer paso es purificar en gel los sustratos de ARN marcados. El paso final es ensamblar la reacción de escisión, incluido el extracto nuclear y el sustrato de ARN marcado. En última instancia, los resultados pueden mostrar tres ARNm principales, sustratos escindidos UNC y productos escindidos a través de electroforesis vertical en gel radiactivo.
La demostración visual de este método es importante, a pesar de que se ha realizado desde la década de 1980, no es fácil de ejecutar, ya que hay muchos pasos específicos a lo largo del procedimiento que son desafiantes. Tienen las células lavadas, granuladas y listas para el lisado. Para comenzar este protocolo a la célula pellet, agregue tampón con DTT fresco.
Agregue cinco volúmenes del CPV estimado y use una pipeta para romper el pellet y permitir que la suspensión se enfríe en el hielo. Después de 10 minutos, gire las celdas hacia abajo a cuatro grados centígrados en un balde oscilante. Centrifugar con cuidado el sobrenadante.
El pellet habrá absorbido algo de solución y habrá aumentado de tamaño. A continuación, añada un CPV de tampón A y rompa suavemente el pellet con una punta de pipeta. Vierta la suspensión en un homogeneizador enfriado y, con cinco a 12 golpes de un mortero apretado, limpie las celdas.
Retire una pequeña alícuota, aplique azul de trian y revise las células para determinar la integridad de su lisis. Si es necesario, continúe homogeneizando las células hasta que estén lisadas en un 90%, pero no se exceda. Ahora transfiera el lisado a un tubo ultracentrífugo ultra claro.
Registre el volumen total y gírelo como se hizo anteriormente. Aspire el sobrenadante turbio y guárdelo en hielo. Y para el análisis de citosol, tenga cuidado de no alterar el pellet.
Contiene los núcleos. A continuación, gire el pellet a alta velocidad durante 15 minutos. Retire el pequeño volumen de sobrenadante restante y acompáñelo con la colección de citosol.
A continuación, determine el volumen nuclear de PACT. Añada un volumen equivalente al tampón C al pellet. A continuación, desaloje el pellet con la pipeta en un homogeneizador de limpieza.
Use de cinco a 10 golpes de mortero apretados para recuperar. Suspenda el pellet. Transfiera el homogeneizado a un tubo enfriado y mezcle por inversión durante 30 minutos.
A cuatro grados centígrados, se puede utilizar una placa de agitación. Si el volumen es lo suficientemente grande, transfiera el lisado a un tubo de ultracentrífuga UltraClear y, a cuatro grados centígrados, gírelo hacia abajo durante 30 minutos. A unos 25.000 gs, el sobrenadante es el extracto nuclear.
Siguiendo el protocolo de texto, complete la diálisis a partir de un solo microgramo de plantilla. Prepare la sonda mediante transcripción in vitro utilizando un kit con un promotor compatible con SP six o T seven. Al cargar la página, utilice tres microlitros de marcador y los 25 microlitros de la reacción para cada sustrato de ARN.
También evite la contaminación cruzada espaciando los carriles de transcripciones de tamaño similar. Haga funcionar el gel de tal manera que una sonda de 600 nucleótidos funcione a 25 vatios durante unas dos horas después. Para marcar la ubicación de las bandas de gel, ilumine la película expuesta con una caja de luz y coloque el gel envuelto encima.
Alinee el marcador de radiación automática y el marcador expuesto en la película. Y luego marque las ubicaciones de las bandas con un marcador negro para quitar las bandas Desenvuelva el gel. Y con una cuchilla limpia, extirpe las secciones de banda del gel, transfiera cada sección a su propio tubo y eluya el ARN siguiendo los procedimientos estándar.
Una vez que se hayan preparado todos los reactivos, caliente el ARN marcado a 80 grados centígrados durante dos minutos. Luego transfiera el ARN al vórtice de hielo, el 10% de PVA, y luego gírelo a alta velocidad durante unos minutos para eliminar las burbujas, luego proceda a hacer las mezclas maestras para cada reacción. Para cada reacción, dispense 5,25 microlitros de master mix one.
A continuación, añade 6,25 microlitros de la mezcla de extracto nuclear. A continuación, añada un microlitro de sustrato de ARN marcado diluido hasta 50 ano molares en total. Cada reacción utiliza menos de cinco ARN marcado con ano molares.
Ahora, vórtice suavemente y gire rápidamente las mezclas de reacción. Permita que la reacción tenga lugar durante un máximo de dos horas a 30 grados centígrados. Tomar un curso de tiempo de la reacción proporcionará los mejores resultados Después de usar la proteinasa K para digerir la proteína en la reacción y luego purificar la reacción Usando el método de cloroformo de fenol, ejecute los productos en una carga de página del 6%, tres microlitros de marcador o cinco microlitros por producto de reacción por carril.
A continuación, ejecute el gel y desmonte con cuidado el aparato de gel. Para recoger el gel, presione el papel de filtro firmemente contra él y déle la vuelta. Presione firmemente el vidrio para asegurarse de que el gel quede completamente agarrado por el papel.
A continuación, despega lentamente el papel de filtro con el gel adherido. Envuelve el lado expuesto del gel en plástico y pega la envoltura al papel de filtro en el otro lado. Termina colocando el gel en una secadora durante 15 minutos con el papel de filtro mirando hacia el vacío.
Más tarde, analice el gel exponiéndolo a una película o a un generador de imágenes de fósforo. El escindido. El sustrato de ARN es la banda migratoria más lenta en la parte superior del gel.
El producto escindido específico marcado con una flecha en negrita, corre más rápido en el gel al tamaño esperado. Este producto está ausente del control con una mutación puntual en la secuencia de Pollier. La cuantificación de la actividad de escisión se determinó con un gráfico métrico DS.
Comparación de la proporción de ARN escindido a escindido, normalizado con el control de ARN escindido. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como un ensayo de poliadenilación, para responder a preguntas adicionales, como la actividad de la poliA polimerasa. Este ensayo se realiza alterando las condiciones de reacción, como la adición de magnesio y la eliminación de EDTA.
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Descripción general
Este estudio se centra en el examen del corte de ARNm en tres primas in vitro, un proceso crucial en la maduración del ARN. El método implica el uso de extracto nuclear transcricionalmente activo y sustratos de ARN marcados radiactivamente para analizar las reacciones de corte.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- biología del ARN
- biología molecular
- bioquímica
Antecedentes
- La ARN polimerasa II sintetiza un ARN precursor que se extiende más allá del extremo 3' del ARN mensajero maduro.
- El complejo de escisión determina el sitio de generación del ARN maduro.
- Los procesos co-transcripcionales son esenciales para la maduración del ARN.
- Comprender las reacciones de escisión puede proporcionar información sobre los mecanismos de procesamiento del ARN.
Objetivo del estudio
- Examinar la escisión del ARNm en el extremo tres prima in vitro.
- Comprender el papel de los extractos nucleares en el procesamiento del ARN.
- Analizar los productos de las reacciones de escisión mediante electroforesis en gel.
Métodos Utilizados
- Preparación de extracto nuclear con actividad transcripcional a partir de células cultivadas en suspensión.
- Síntesis de sustratos de ARN marcados radiactivamente mediante transcripción in vitro.
- Purificación de los sustratos de ARN marcados mediante electroforesis en gel.
- Armado de reacciones de escisión con extracto nuclear y sustratos de ARN marcados.
Resultados principales
- Se observó una escisión exitosa de tres sustratos de ARNm en la región tres prima.
- Los resultados se analizaron mediante electroforesis vertical en gel con marcado radiactivo.
- Se identificaron los sustratos escindidos por UNC y los productos de escisión.
- La metodología proporciona un marco para el estudio de reacciones de escisión del ARN.
Conclusiones
- Este estudio describe un método confiable para examinar el corte de ARNm in vitro.
- Comprender los mecanismos de corte puede mejorar el conocimiento sobre el procesamiento de ARN.
- Los resultados contribuyen al campo más amplio de la biología del ARN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender el procesamiento del extremo 3' del ARN es fundamental para la validación de objetivos terapéuticos basados en ARN, donde la maduración precisa del transcripto influye en los niveles de expresión proteica y en los resultados funcionales. Este ensayo de escisión in vitro permite reducir los riesgos mecanicistas al aislar los requisitos bioquímicos para un procesamiento preciso del pre-ARNm, lo que refuerza la confianza predictiva en la interacción con el objetivo. El método proporciona un sistema cuantitativo y reproducible para evaluar cómo las perturbaciones genéticas o farmacológicas afectan la estabilidad y función del ARN, aportando información clave para las decisiones en las primeras etapas del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los mecanismos de procesamiento del ARN para validar dianas transcripto-específicas implicadas en la regulación de la expresión génica.
- Valor operativo: Proporciona un sistema controlado para evaluar cómo afectan las mutaciones en las señales de poliadenilación a la eficiencia de escisión y la estabilidad del ARN.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas de productos de escisión para apoyar la estandarización de ensayos en la selección de moduladores de factores de procesamiento de ARN.
- Valor operativo: Utiliza detección basada en geles para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad en múltiples sustratos de ARN y condiciones experimentales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización relacionada con enfermedades al vincular defectos en el procesamiento del ARN con isoformas de transcritos aberrantes observadas en estados patológicos.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica al definir umbrales bioquímicos para la maduración funcional del ARN.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El ensayo se integra en la fase temprana del descubrimiento, donde la validación del blanco de ARN precede a la identificación de compuestos líderes y a la evaluación preclínica al aclarar el impacto funcional del procesamiento del transcrito en la producción de proteínas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre elementos reguladores del ARN y la reducción de riesgos mecanicistas de dianas implicadas en la maduración del ARNm.
- Cribado: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante la preparación estandarizada de sustratos y la detección cuantitativa de productos mediante electroforesis en gel.
- Analítica: Permite comparar la eficiencia de escisión entre diferentes condiciones utilizando relaciones normalizadas producto-sustrato para la priorización de dianas basada en datos.
- Investigación Traductiva: Se conecta con trabajos preclínicos al definir la competencia de procesamiento como un biomarcador de idoneidad terapéutica basada en ARN.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para evaluar modalidades dirigidas al ARN en múltiples programas y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos de ARN al reducir la ambigüedad en los mecanismos de procesamiento de transcritos.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada de extractos nucleares y la cuantificación de sustratos marcados.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular la fidelidad del procesamiento de ARN con la expresión proteica esperada y los resultados funcionales.
- Impacto en la cartera: Permite un avance ajustado al riesgo al identificar objetivos con perfiles robustos y regulables de maduración del ARN.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular, bioquímica del ARN y técnicas de marcado radiactivo.
- Depende de infraestructura para ultracentrifugación, electroforesis en gel y autorradiografía para la preparación de extractos nucleares y la detección de productos.
- Necesita una estandarización entre equipos en el diseño de sustratos, condiciones de reacción y métodos de cuantificación para garantizar la comparabilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el ensayo a diversos sustratos de ARN o sistemas relevantes para enfermedades.
- Limitado por la complejidad técnica del aislamiento de extractos nucleares y la necesidad de una optimización cuidadosa para evitar degradación inespecífica.
