Name: Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprende a aislar fracciones nucleares enriquecidas de la región CA1 del hipocampo en ratas para estudiar la importación de proteínas dependiente de la actividad sináptica. Este método permite analizar cambios en fosfoproteínas nucleares tras inducir LTP.

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Este trabajo fue financiado por la DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), la subvención DIP (MRK), el EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), el Centro de Ciencias del Cerebro del Comportamiento (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK y SB), MM es beneficiario de la beca a largo plazo de la Organización Europea de Biología Molecular (EMBO) (EMBO ALTF 884-2011) y Marie-Curie IEF.

1 Preparación de aguda hipocampo rebanadas de cerebro de rata adulta <ol><li> Anestesiar las ratas con isoflurano. PRECAUCIÓN: Realice el procedimiento utilizando un desecador cerrado, no inhale el isoflurano. Asegúrese de que el animal está completamente anestesiado. </li><li> Decapitar a la rata, aislar rápidamente el cerebro, y sumergirlo en precarbonated (95% de O2 / 5% de CO mezcla de gas 2) solución de Gey (composición en mM en frío de hielo: 130 NaCl, 4,9 KCl, 1,5 CaCl 2 · 2H 2 O , 0.3 MgSO 4 · 2H 2 O, 11 MgCl2 · 6H 2 O, 0,23 KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucosa · H 2 O, 25 HEPES, 22 de NaHCO3, pH 7,32) durante 30 min 1,2,10,16. </li><li> Retire el cerebelo y parte de la corteza entorrinal. Separar los hemisferios corticales con un corte sagital medio, a continuación, coloque cada hemisferio abajo en su superficie medial. A partir de entonces hacerun 50-70 ° corte (50-70 ° transversal) a lo largo del borde dorsal de cada hemisferio 13,14. </li><li> Pegar cada hemisferio con la superficie recién cortada en la plataforma de corte del sistema de corte. La plataforma debe estar cubierto por la solución de Gey helada precarbogenated. </li><li> Cortar 350 micras 50-70 ° cortes transversales de anterior a posterior lado usando un vibratome ajustarse para minimizar la oscilación del eje z. La formación del hipocampo, las cortezas subicular y entorrinal, así como las cortezas que se encuentran dorsolateral al hipocampo serán parte de las rodajas utilizadas para los experimentos de 13,14. </li><li> Transferencia de cortes de hipocampo a una forma de U y el tipo sumergido incubadora y se incuba durante al menos 2 horas a 32 ° C con líquido cefalorraquídeo artificial carbogenated (ACSF que contiene en mM: 110 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl 2 · 2H 2 O, 1,5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1,24 KH 2 PO 4, 10 Glucosa · H 2O, 27.4 NaHCO3, pH 7,3) 1,2,10,16. </li></ol> 2. Posicionamiento de Electrodos, grabación de línea de base, y la inducción de la LTP <ol><li> Transferir el corte de hipocampo a una cámara de grabación de tipo sumergido montado bajo un microscopio. Perfusión (6-7 ml / min) con ACSF carbogenated por lo menos durante 30 minutos a 32 ° C. </li><li> Preparar microelectrodos capilares de vidrio llenas de ACSF (resistencia punta es de 3-5 mW). </li><li> Coloque unas microelectrodos de vidrio llenas de ACSF en las fibras CA1 Schaffer-garantía para la estimulación y en el estrato radiado CA1 para fEPSP grabación 1,2,10 (Figura 2). La distancia entre los electrodos debe ser de aproximadamente 300 micras. </li><li> Evocar campo excitatorios postsinápticos potenciales (fEPSPs) por la estimulación de fibras Schaffer-colaterales con impulsos de corriente rectangulares bifásicos (200 mseg / polaridad) en un rango de 3-4 V. </li><li> Realice la prueba de estimulación máxima midiendo el inprelación ut-producto y definir la intensidad de estimulación como el 40% de los valores máximos fEPSP-pendiente obtenidos y mantenerla constante durante todo el experimento. </li><li> Comienza la grabación de la línea de base durante al menos 15 minutos después de la prueba de estimulación máxima. Medir las respuestas a estímulos probar cada minuto durante todo el experimento. Realizar grabaciones de línea de base con la estimulación de baja frecuencia. </li><li> Anote la línea de base durante al menos 30 min. </li><li> Para Late-LTP inducción aplicar de alta frecuencia 100 Hz tetanización que consta de tres trenes de estímulo 1 seg a 100 Hz con un intervalo intertrain 5 min. Para aumentar el campo de la estimulación dentro CA1 región 5 M bicuculina se pueden lavar en 2 min antes de tetanización y se deben lavar inmediatamente después de la última tetanización. </li></ol> 3. Colección de rebanadas después de la inducción de LTP y Snap Congelación <ol><li> Detener grabación LTP 2 min o 30 min después de tres trenes de estimulación tetánica inducen Late-LTP. </li><li&gt; Retire los electrodos y rápidamente transferir la rebanada en una plataforma de metal precold colocado en hielo seco. Repita el procedimiento con una rodaja de control mantenidos en incubadora en forma de U. PRECAUCIÓN: Utilice guantes cuando se trabaja con hielo seco. </li><li> Recoge cada rebanada en un tubo de 1,5 ml y almacenar a -80 ° C. </li></ol> 4. Aislamiento de fracciones nucleares enriquecidos de la región CA1 del hipocampo <ol><li> Tomar 1,5 ml tubos Eppendorf con las rodajas congeladas de -80 ° C y mantenerlos en hielo. </li><li> Añadir 0,5 ml de solución tampón que contiene proteasa fresca fría TBS (PI) y los inhibidores de la fosfatasa (PS), en el tubo. Incubar durante 2-3 min y transferir a un microscopio estereoscópico. PRECAUCIÓN: Use guantes de protección y una bata de laboratorio mientras trabajaba con PI y PS. </li><li> Diseccionar la región estrato piramidal CA1 del hipocampo utilizando dos agujas. Utilice una aguja para sujetar la rebanada bajo el microscopio estereoscópico y la segunda aguja para el corte de la zona CA1. </li><li> Recoger el CA diseccionado1 regiones de 5 rebanadas (para cada grupo) en un nuevo tubo de 1,5 ml contiene 50 l de tampón de lisis (1x tampón de lisis hipotónica que contiene en mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl 2, 10 KCl, pH 7,9, con PI y PS). Tenga en cuenta que esta cantidad de material será suficiente para ejecutar 2-3 inmunotransferencias. </li><li> Homogeneizar los tejidos recogidos por cuidado de pipeteo hacia arriba y abajo. Utilice una pipeta de 200 l. Incubar el lisado en hielo durante 5-7 minutos para permitir que las células se hinchen. </li><li> Tomar 2 l de lisado, caer en un portaobjetos de microscopio, y visualizar la inflamación de las células bajo un microscopio de campo claro. Con hinchazón adecuada de las células de los núcleos aparecen como estructuras intactas ronda. </li><li> Recoger 20 l de muestra en un tubo de 1,5 ml fresco como &#39;fracción homogeneizado&#39;. Agregue 8 l de desnaturalización SDS muestra de amortiguación 4x. </li><li> Centrifugar los lisados ​​restantes a 11.000 rpm durante 1 min. </li><li> Recoger cuidadosamente el sobrenadante de la parte superior (&#39;fracción citosólica&#39;), transfer en un nuevo tubo y añadir 20 l de tampón de muestra 4x. </li><li> Resuspender el precipitado en 60 l de tampón hipotónico y añadir 20 l de tampón de muestra 4x. Esta fracción se conoce como una &quot;fracción nuclear enriquecido &#39;. </li><li> Homogenado, citosólicas y nucleares fracciones enriquecidas pueden ser almacenadas a -20 ° C o -80 ° C durante inmunotransferencia más tarde. </li></ol> 5. Inmunoblotting Semicuantitativo para Proteínas Synapto nucleares <ol><li> Descongelar las muestras y hervir durante 5 minutos a 95 ° C. </li><li> Tome 5 l de cada fracción y determinar la concentración de proteínas por amido negro de prueba o prueba BCA. </li><li> Carga igual cantidad de muestras de proteínas de homogeneizado, fracciones enriquecidas citoplasmáticas y nucleares en SDS-PAGE. Las muestras de control y LTP rebanadas deben ser colocados en el mismo gel para la comparación directa. </li><li> Realice un procedimiento de Western Blot estándar (se recomienda la transferencia húmeda). </li><li> Sondear las membranas con tél anticuerpo de elección. Posteriormente los mismos blots (o mismas muestras se ejecutan en paralelo) se pueden probaron con un marcador citoplásmico - enolase2 neuronal específica (NSE2) y el marcador nuclear - NeuN y un anticuerpo actina como control de carga. </li></ol> Análisis 6. Datos <ol><li> La eficiencia de la inducción de LTP puede ser analizado por el software Clampfit. La pendiente media de grabaciones de referencia se comparó con las pistas después de tetanización usando ANOVA de dos vías, p &lt;0,05 fue considerado significativamente diferentes. Los valores de pendiente fEPSP fueron representados en los diagramas como la media ± SEM </li><li> Para la cuantificación de inmunotransferencias, escanear la película de autorradiografía y analizar la densidad integrada de las bandas de proteínas por ImageJ o bandas de fluorescencia con un sistema Licor. Los valores de las bandas inmunorreactivas deben ser normalizados para el control de carga y secante. Para la comparación de los grupos control y LTP podría utilizarse un Mann-Whitney U-prueba no paramétrica. </li></ol><table border="0"cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Nombre del buffer </td><td> Reactivo </td><td> Concentración (mM) </td><td> Importe </td><td> Comentarios / Descripción </td></tr><tr><td> La solución de Gey (pH: 7,3 ~ 7,4) </td><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 7,6 g </td><td> filtración estéril </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 4.9 </td><td> 0,37 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0,22 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 0.3 </td><td> 0.0739 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCl2 · 6H 2 O </td><td> 11 </td><td> 2,24 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.23 </td><td> 0,0313 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Na 2 HPO 4 · 7H 2 O </td><td> 0.8 </td><td> 0.2145 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glucosa · H 2 O </td><td> 5 </td><td> 0.9909 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 5,96 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 22 </td><td> 1,85 g </td><td></td></tr><tr><td> ACSF (pH: 7,3 ~ 7,4) </td><td> NaCl </td><td> 110 </td><td> 6.428 g </td><td> filtración estéril </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 2.5 </td><td> 0.1865 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 2.5 </td><td> 0,368 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO 4 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.370 g </td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.24 </td><td> 0,169 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glucosa · H 2 O </td><td> 10 </td><td> 1,9817 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 27.4 </td><td> 2,3 g </td><td></td></tr><tr><td> 1x hipotónica (pH: 7,9) </td><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 0,23 g </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml </td><td> MgCl2 · 6H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0,0304 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KCl </td><td> 10 </td><td> 0,07455 g </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tampones.

<ol><li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276(2011).</li>
<li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li>
<li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABA%28A%29+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldendrin-Jacob%3A+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).</li>
<li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li>
<li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li>
<li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+%28ERK%29+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li>
<li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+protein+shuttling%3A+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li>
<li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li>
<li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li>
<li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation%3A+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos descritos en el protocolo anterior proporcionan una guía de cómo preparar aguda hipocampo rodajas de ratas jóvenes o adultos, inducir y registro LTP, diseccionar rápidamente área estimulada de la rebanada, y preparar fracción enriquecida nuclear para el estudio de la actividad dinámica de las proteínas dependientes. Este enfoque se deriva de la combinación de varios métodos diferentes usados ​​independientemente uno de otro. Hemos optimizado el flujo de trabajo y proporcionar suficientes detalles para el princ...

Sináptica N-metil-D-aspartato-receptores (NMDAR) juegan un papel crucial en la plasticidad sináptica y la supervivencia celular de señalización mientras que la activación de los NMDAR extrasinápticos puede desencadenar la neurodegeneración y la muerte celular. Estos cambios dependen de / actividad regulada la expresión génica dependiente fuertemente controlada y por lo tanto requieren una comunicación constante entre las sinapsis o dendritas activados y el núcleo 7. El MAP quinasas ERK1 / 2 son los efectores de NMDAR sinápticos de señalización y están involucrados en la expresión génica inducida por NMDAR activación, mientras que la señalización a través de NMDAR extrasynaptic no tiene o tiene un efecto inhibitorio sobre la ERK1 / 2 Actividad 8,11. Hay una serie de proteínas que han demostrado lanzadera entre dendritas distales y el núcleo. Muchas de estas proteínas contienen una señal de localización nuclear y son transportados activamente a lo largo de los microtúbulos en un dineína y forma importina dependiente al núcleo 6,9. Interestingly, algunos de estos mensajeros sólo de tránsito al núcleo en respuesta a estímulos sinápticos específicos. Por ejemplo, el transporte retrógrado de AMP cíclico elemento de respuesta a la proteína de unión 2 (CREB2) es inducida por LTD química pero no LTP 12. Localizada estimulación sináptica dependiente de NMDAR impulsa coactivador transcripcional CREB reguladas (CRTC1) en el núcleo, un proceso de translocación, que está implicado en la plasticidad del hipocampo a largo plazo 4. Se ha demostrado recientemente que el mensajero de proteínas Jacob se transloca al núcleo después de tanto, la activación NMDAR sinápticos y extrasynaptic y regula la transcripción génica dependiente de CREB 5. El origen sináptica o extrasynaptic de la señal se codifica en una modificación postraduccional de Jacob. La actividad sináptica induce ERK1 / 2 fosforilación dependiente de Jacob en una serina en la posición 180 fundamental (pJacobS 180), que es un requisito para la posterior translocación al núcleo del hipocampo en cultivo primario. Por otra parte, in neuronas CA1 del hipocampo rebanadas agudas pJacobS 180 transloca al núcleo después de Schaffer garantía LTP pero no LTD 1,10. PS180 Jacob lleva a un aumento de la expresión de genes relacionados con la plasticidad y la expresión de los genes se alimenta de nuevo a la función sináptica. En agudo contraste, Jacob que se transloca al núcleo después de la activación NMDAR extrasinápticos no está fosforilada en Ser180 y podría estar asociado con diferente complejo de proteínas en el núcleo causando &#39;CREB apagado&#39; y una retracción de los contactos sinápticos 10. Mayoría de los estudios publicados sobre la importación nuclear de synapto-nuclear proteína mensajera se han realizado en cultivos primarios neuronales disociadas. Por lo tanto, sería interesante ver si estos hallazgos pueden ser reproducidos en fisiológicamente más relevante condiciones utilizando rebanadas de hipocampo donde la conectividad neuronal y la función son mucho mejor conservado. Aquí presentamos un protocolo optimizado para la evaluación de LTP-deColgante translocación nuclear de los mensajeros de proteínas por inmunotransferencia. Este método también es adecuado para el análisis de la actividad de fosforilación dependiente de proteínas en una fracción nuclear crudo. En concreto, el actual protocolo implica la preparación de rodajas de hipocampo CA1 agudas, la inducción y la grabación de la LTP. A continuación, la región CA1 se diseccionó microscópicamente para aislar la región estimulada. Hemos combinado y modificado el protocolo para el aislamiento nuclear proporcionada por CellLytic NuCLEAR Extraction Kit con los cambios introducidos por Zhao y sus colegas 17. El procedimiento optimizado incluye la lisis de las regiones CA1 disecados en tampón hipotónico que permite hinchazón celular y liberación de núcleos. La lisis celular y la morfología de los núcleos pueden ser determinadas por examen microscópico. De enriquecimiento nuclear se logra mediante una etapa de centrifugación corta. Análisis de inmunotransferencia con anticuerpos contra NeuN y NSE2, marcadores específicos de fracciones citosólicas o nucleares, indica que este enfoque puede ser utilizado como un rápidoy el protocolo reproducible para aislar estas fracciones subcelulares y estudiar las modificaciones posteriores a la traducción muy lábiles como la fosforilación de proteínas. Además, este método es ventajoso para las pequeñas muestras de tejido que se derivan de regiones CA1 de cortes de hipocampo disecados y se puede utilizar en combinación para inmunohistoquímica de cortes de hipocampo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>CED 1401 AD/DA convertidor Cambridge</td><td>Electronics Design, UK</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Microscopio estereoscópico</a></td><td>Leica S4E, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrotomo</td><td>Leica VT1000S, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de impulsos aislado</td><td>A-M Systems, EE. UU.</td><td></td><td>Centrífuga modelo 2100</td></tr><tr><td></td><td>Sistema Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cooler</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivos celulares</td><td>Micromanipulador</td> Thermo Electron Corporation <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann, SM-5, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de transferencia y proveedor de energía eléctrica</td><td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de registro de tipo sumergido</td><td>hecha</td><td></td><td></td>a medida</tr> en <tr><td>forma de U e incubadora de tipo sumergido&nbsp;</td><td>hecho</td><td></td><td></td>a medida</tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas pequeñas</td> Bisturí Espátula fina Pipeta Pasteur de plástico Plato de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> cultivo de plástico&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vaso de precipitados</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td>Jeringa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivos</fuerte></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>Roth Art.-Nr.3957.1</td><td>&ge; 99.5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6781.1&</td><td>ge; 99.5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>5886.05</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>AppliChem</td><td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946</td><td>para biología molecular</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>12034.025</td><td>para biología molecular</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1.06574.1000</td> Glucosa <td>extra pura</td></tr><tr><td>&middot; H2O Roth</td><td></td><td>Art.-Nr.6887.1</td><td>para biología molecular</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.9105.4</td><td>PUFFERAN, &ge; 99.5%, p.a.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.1000</td><td>pro análisis</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphostop</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Tocris Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><fuertes>Anticuerpos</fuertes></td></tr><tr><td>Anticuerpos primarios</td><td>Número de catálogo</td> de <td>la empresa</td><td>Especie</td></tr><tr><td>pJac-s180</td><td>Biogenes</td><td></td><td>conejo (diluido 1:100)</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Milipore</td><td>MAB377</td><td>ratón (diluido 1:1.000)</td></tr><tr><td>NSE</td><td>Cell Signaling</td><td>D20H2</td><td>conejo (diluido 1:1.000)</td></tr><tr><td>Beta-actina</td><td>Sigma</td><td>A-5441</td><td>ratón (diluido 1:5.000)</td></tr><tr><td>Anticuerpos secundarios</td><td>Número de catálogo</td> de <td>la empresa</td><td>Especie</td></tr><tr><td>IgG HRP conjugada</td><td>DAKO</td><td></td><td>cabra anti-ratón (1:5.000)</td></tr><tr><td>IgG HRP conjugada</td><td>NEB</td><td></td><td>cabra anti-conejo (1:5.000)</td></tr></tbody></table>

aislamiento de ca1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente nuclear importación de proteínas mensajeras synapto nucleares

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

El estudio de la actividad de la expresión de proteínas dependientes, translocación subcelular, o fosforilación es esencial para entender los mecanismos celulares subyacentes de la plasticidad sináptica. La potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD) inducida en cortes de hipocampo agudos son ampliamente aceptados como modelos celulares de aprendizaje y la memoria. Existen numerosos estudios que usan imágenes de células o de inmunohistoquímica enfoques en vivo para visualizar la actividad dinámica de las proteínas dependientes. Sin embargo, estos métodos se basan en la idoneidad de los anticuerpos para inmunocitoquímica o sobreexpresión de proteínas de fluorescencia de etiquetado en las neuronas individuales. La inmunotransferencia de proteínas es un método alternativo que proporciona una confirmación independiente de los resultados. El primer factor limitante en la preparación de fracciones subcelulares de cortes de hipocampo tetanized individuales es la baja cantidad de material. En segundo lugar, el procedimiento de manejo es crucial porque las manipulaciones incluso muy cortos y menores de living rebanadas podría inducir la activación de ciertas cascadas de señalización. Aquí se describe un flujo de trabajo optimizado con el fin de obtener una cantidad suficiente de la fracción nuclear enriquecido de suficiente pureza a partir de la región CA1 de cortes de hipocampo agudos de cerebro de rata. Como ejemplo representativo se muestra que la ERK1 / 2 forma fosforilada de la proteína nuclear mensajero synapto-Jacob activamente transloca al núcleo después de la inducción de la LTP y se puede detectar en una fracción enriquecida nuclear de las neuronas CA1.

Hemos demostrado previamente que la proteína nuclear synapto-mensajero Jacob acumula en el núcleo después de la inducción de la LTP pero no LTD 1. Por otra parte, la translocación de Jacob después de la estimulación sináptica requiere la activación de la MAPK ERK1 / 2 y la fosforilación de Ser180 a Jacob (Figura 1). Jacob fosforilado se transloca al núcleo de una manera importin-dependiente y el estado fosforilado se puede conservar durante períodos prolongados de tiempo por la asociación con...

Proporcionamos un protocolo detallado para la inducción de la potenciación a largo plazo en la región CA1 del hipocampo y el posterior aislamiento de fracciones enriquecidas nucleares de la zona de tetanized de la rodaja. Este enfoque puede ser utilizado para determinar la actividad de importación nuclear dependiente de proteína en modelos celulares de aprendizaje y memoria.

Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

El objetivo general de este experimento es estudiar el transporte nucleocitoplasmático dependiente de la actividad de proteínas utilizando cortes hipocampales agudos en los que se conservan adecuadamente la conectividad y la función neuronales. Para alcanzar este objetivo, primero se aísla el hipocampo de una rata adulta macho y, en una segunda etapa, se preparan cortes transversales agudos. Los cortes hipocampales se transfieren a la cámara de registro y se induce la forma tardía de la potenciación a largo plazo (LTP) en la capa radiatum del CA1. A continuación, los cortes potenciados y los controles se congelan rápidamente, y las regiones estimuladas del CA1 se disecan con el fin de aislar la fracción enriquecida en núcleos para su posterior análisis mediante inmunotransferencia.Los resultados basados en el análisis mediante inmunotransferencia muestran diferencias en los niveles de fosfoproteínas nucleares entre los cortes potenciados y los controles, 30 minutos después de la inducción de la PTL. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a dos razones. Primero, la pequeña cantidad de muestra de tejido, y segundo, el marco temporal crítico requerido para la lisis de las muestras en tampón de lisis hipotónico, que permite la liberación de los núcleos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación vital del hipocampo y el aislamiento de la región C uno requieren disecciones rápidas y muy precisas, aunque existen ciertos trucos.Para facilitarlo, se deberá seguir tanto las instrucciones escritas como las visualizadas para la preparación de la fracción enriquecida en núcleos a partir del área C uno del hipocampo. La demostración del procedimiento será realizada por el Laboratorio Pinon Postal. Ella mostrará cómo preparar la lisado agudo del hipocampo e inducir la PTP.Después de la disección de la región C, un estudiante de Berra de nuestro laboratorio le mostrará cómo aislar el núcleo y la destrucción. Comience este procedimiento aislando el cerebro de rata y sumérjalo en una solución fría con hielo y previamente carbonatada. A continuación, retire el cerebelo y parte de la corteza enteral.Seccione los hemisferios corticales mediante un corte sagital medio. Posteriormente, realice un corte de entre 50 y 70 grados a lo largo del borde dorsal de cada hemisferio. Luego, coloque cada hemisferio sobre su superficie medial y sujételo con pegamento, dejando la superficie recién cortada hacia abajo sobre la plataforma de corte del vibrátomo.Posteriormente, cubra la plataforma con la solución fría de gaza pre-carbogenada. Corte secciones de 350 micrómetros que contengan la formación del hipocampo, las cortezas subiculares y entorrinales, desde el lado anterior al posterior con el vibrom. A continuación, transfiera las secciones a un incubador sumergido en forma de U y elévelas durante al menos dos horas a 32 grados Celsius con CSF carbogenado.Ahora transfiera un corte de hipocampo a la cámara de registro de tipo sumergido montada bajo un microscopio. Perfunda el corte con A CSF carbonatado a seis mililitros por minuto durante al menos 30 minutos a 32 grados Celsius. Después de 30 minutos, llene las microelectrodos de capilar de vidrio con A CSF.Coloque un microelectrodo en las fibras colaterales de Schaefer en el CA1 para la estimulación y otro en la capa estrato radiatum del CA1 para la grabación de los PESP de campo, con una distancia de 300 micrómetros entre ellos. Luego, evoque los PESP de campo aplicando pulsos de corriente rectangulares fásicos de tres a cuatro voltios a las fibras colaterales de Schaefer. Realice la prueba de estimulación máxima midiendo la relación entrada-salida y defina la intensidad de estimulación como el 40 % del valor máximo de la pendiente de los PESP de campo.A continuación, registre la línea base durante al menos 15 minutos midiendo las respuestas a los estímulos de prueba cada minuto a lo largo del experimento. Para inducir la PTP tardía, aplique tetanización de alta frecuencia para aumentar los PEPS de campo evocados en una región del hipocampo. Aplique cinco micromoles por litro de COE al ACSF dos minutos antes de la tetanización y lávelo inmediatamente después de la última tetanización.Detenga la grabación. Dos minutos o treinta minutos después de la inducción de la PTP tardía, retire los electrodos y transfiera rápidamente la sección a una plataforma metálica previamente enfriada colocada sobre hielo seco. Luego, recoja cada sección en un tubo Eppendorf de 1,5 mililitros y almacénelo a menos 80 grados Celsius.En este paso, retire los cortes congelados del ambiente de menos 80 grados Celsius y manténgalos sobre hielo. Añada 0,5 mililitros de tampón TBS frío fresco que contenga inhibidores de proteasa y fosfatasa en el tubo. Incúbelos durante dos a tres minutos antes de transferirlos a un microscopio estereoscópico.A continuación, diseccione la región de la capa paramacular del CA1 del hipocampo sosteniendo la sección con una aguja y cortando el área del CA1 con la otra. Posteriormente, recoja las regiones del CA1 diseccionadas de cinco secciones por grupo en un nuevo tubo de 1,0 mililitro que contenga 50 microlitros de tampón de lisis. Luego, homogenice los tejidos recolectados pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200 microlitros.Incube el lisado en hielo durante cinco a siete minutos para permitir que las células se hinchen. Después, tome dos microlitros del lisado y colóquelos en un portaobjetos para microscopio. Observe la hinchazón de las células bajo un microscopio de campo claro.Los núcleos aparecen como estructuras redondeadas e intactas con una hinchazón adecuada. Ahora, recolecte 20 microlitros de muestra en un tubo fresco de 1,5 mililitros como la fracción homogeneizada. Añada ocho microlitros de tampón muestral desnaturalizante 4X SDS.Luego, centrifugue el lisado restante a 1100 RCF durante un minuto. Después de un minuto, recoja cuidadosamente el sobrenadante de la parte superior y transfiéralo a un tubo nuevo. Posteriormente, agregue 20 microlitros de tampón de muestra cuatro x.Luego, resuspenda el precipitado en 60 microlitros de tampón hipotónico y agregue 20 microlitros de tampón de muestra 4x. Esta fracción se denomina fracción enriquecida en núcleos. Almacene el homogenato, las fracciones citosólica y enriquecida en núcleos a menos 20 grados Celsius o menos 80 grados Celsius.Para la inmunodetección posterior en este procedimiento, descongele las muestras y hiérvalas durante cinco minutos a 95 grados Celsius antes de medir la concentración de proteína mediante la prueba AM mito black o la prueba BCA. Cargue una cantidad igual de muestras de proteína provenientes de los fraccionamientos homogenizado, citoplasmático y enriquecido en núcleos. En un gel SDS-PAGE, las muestras provenientes de los cortes control y LTP deben colocarse en el mismo gel para permitir una comparación directa en el Western blot. Esta figura muestra una inmunodetección de los fraccionamientos homogenizado, citosólico y enriquecido en núcleos de un lisado de ca uno, analizados con marcadores citosólicos y nucleares.Este es un análisis de inmunotransferencia de los niveles de PJS 180 en el homogenato dos minutos y treinta minutos después de la inducción de teína, y este es un análisis de inmunotransferencia de los niveles de PJS 180 en la fracción enriquecida nuclear. Dos minutos y treinta minutos después de la fosforilación, los niveles de fosfo Jacob permanecieron sin cambios en los homogenados proteicos totales de CA1 y en la fracción enriquecida nuclear dos minutos después de la fosforilación. Sin embargo, se observó un aumento significativo en la inmunorreactividad de p Jacob, S 180, treinta minutos después de la inducción del PTL.Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar un volumen adecuado de la válvula de lisis hipotónica. Asimismo, debe estandarizarse el período crítico para la lisis de las muestras. En particular, cuando este método se aplica para el aislamiento de núcleos y fracciones a partir de muestras de tejido cerebral de rata o ratón distintas del hipocampo, tras seguir este procedimiento, otros métodos como la tinción inmunológica complementaria con anticuerpos frente a proteínas candidatas importadas al núcleo tras la inducción de OTP o moléculas de señalización como formas activas de quinasas o fosfatasas pueden ser útiles para verificar esos resultados.Se puede realizar un tratamiento farmacológico para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, qué cascadas de señalización están involucradas en la translocación de las proteínas mensajeras nucleares sinápticas, o cómo influyen en una función nuclear. Además, se podría estudiar el papel de las proteínas mensajeras nucleares sinápticas en enfermedades que afectan al hipocampo.Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.

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Research

Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

Este video demuestra la inhibición mediada por microARN de las corrientes sinápticas excitadoras en cortes de cerebro de hipocampo de ratón. Las neuronas CA3 se infectaron con un vector viral recombinante que alberga una construcción para expresar un indicador fluorescente, un canal de membrana activado por luz y un microARN que regula a la baja la expresión de los canales de calcio dependientes de voltaje. Al colocar un corte en una cámara de registro y parchear una neurona CA1 con una pipeta...

Inhibición mediada por microARN de las corrientes postsinápticas excitatorias en cortes de hipocampo de ratón

La localización y distribución de proteínas proporcionan información importante para entender sus funciones celulares. La resolución espacial superior de la microscopía electrónica (EM) se puede utilizar para determinar la localización subcelular de un antígeno dado después de inmunohistoquímica. Para los tejidos del sistema nervioso central (SNC), la preservación de la integridad estructural, mientras que el mantenimiento de la antigenicidad ha sido especialmente difícil en los estudios de EM.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

Este artículo de video describe procedimientos experimentales para estudiar la plasticidad a largo plazo y sus procesos asociativos, como el marcaje sináptico, la captura y el etiquetado cruzado en las neuronas piramidales CA1 utilizando cortes agudos del hipocampo de roedores.

Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos.

Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

Este protocolo describe la estabilización del nivel de oxígeno en un pequeño volumen de tampón reciclado y aspectos metodológicos de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la grabación en rebanadas hippocampal agudas sumergidas.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsive para la depresión severa. ECS a nivel mundial estimula la actividad en el hipocampo, a sinaptogénesis y plasticidad sináptica. Aquí, describimos los métodos para la inducción de ECS en ratas y para el fraccionamiento subcelular de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en proteínas sinápticas.

Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

El protocolo que aquí describe el análisis de la inmunofluorescencia, recuperación de biocitina y reconstrucciones de alta calidad de interneuronas de CA2 hipocampales siguiendo los registros electrofisiológicos intracelulares in vitro, permitiendo neuronal caracterización y finalmente fina anatomía neuronal para ser estudiado.

Recuperación de biocitina y reconstrucciones 3D de interneuronas lleno Hippocampal CA2

Este artículo tiene como objetivo describir un protocolo sistemático para obtener rebanadas cerebrales hipocampales horizontales en ratones. El objetivo de esta metodología es preservar la integridad de las vías de fibra del hipocampo, como la trayectoria perforante y el tracto de fibra musgo para evaluar los procesos neurológicos relacionados con el giro desánido.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

Aprende a aislar fracciones nucleares enriquecidas de la región CA1 del hipocampo en ratas para estudiar la importación de proteínas dependiente de la actividad sináptica. Este método permite analizar cambios en fosfoproteínas nucleares tras inducir LTP.

Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares

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