Aislamiento de CA1 nucleares enriquecidos fracciones de hipocampo rebanadas para estudiar la actividad dependiente Nuclear importación de proteínas mensajeras Synapto nucleares

Proporcionamos un protocolo detallado para la inducción de la potenciación a largo plazo en la región CA1 del hipocampo y el posterior aislamiento de fracciones enriquecidas nucleares de la zona de tetanized de la rodaja. Este enfoque puede ser utilizado para determinar la actividad de importación nuclear dependiente de proteína en modelos celulares de aprendizaje y memoria.

El objetivo general de este experimento es estudiar el transporte citoplasmático del núcleo de proteínas dependiente de la actividad utilizando cortes agudos del hipocampo donde la conectividad y la función neuronal están bien conservadas. Para lograr este objetivo, primero se aísla el hipocampo de una rata macho adulta y se preparan cortes transversales agudos como segundo paso. Los cortes del hipocampo se transfieren a la cámara de registro y se induce la forma tardía de LTP en el átomo de radio de un estrato de CA. A continuación, las rebanadas potenciadas y de control se congelan, y las regiones estimuladas de aproximadamente una se diseccionan con el fin de aislar la fracción nuclear enriquecida para un posterior análisis de inmunoblott.

Los resultados basados en el análisis de Western blot muestran diferencias en los niveles de fosfoproteína nuclear entre los cortes potenciados y los controles 30 minutos después de la inducción de LTP. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades por dos razones. En primer lugar, la baja cantidad de muestra de tejido, y en segundo lugar, el período de tiempo crítico que se repite para la lisis de las muestras en tampón de lisis hipotónica, lo que permite la liberación de los núcleos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación de la vida del hipocampo y el aislamiento de la región C one requieren disecciones rápidas y muy precisas, pero hay ciertos trucos.

Para hacerlo más fácil, sería necesario seguir instrucciones escritas y visualizadas para la preparación de la fracción nuclear enriquecida desde el área C uno del hipocampo. La demostración del procedimiento será realizada por el Laboratorio Postal Piñón. Mostrará cómo preparar la lisis aguda del hipocampo e inducir LTP.

Después de la disección de la región C uno a través de Berra g, el estudiante de nuestro laboratorio le mostrará cómo aislar la energía nuclear y la destrucción. Comience este procedimiento aislando el cerebro de la rata y sumérjalo en la solución de mirada helada precarbonatada. A continuación, extirpa el cerebelo y parte de la corteza enteral.

Separa los hemisferios corticales con un corte sagital medio. Después, haz un corte de 50 a 70 grados a lo largo del borde dorsal de cada hemisferio. A continuación, coloque cada hemisferio sobre su superficie medial, pegue cada hemisferio con la superficie recién cortada en la plataforma de corte del vibrato.

A continuación, cubra la plataforma con la solución de mirada helada precarboxinada. Corte cortes de 350 micrómetros que contengan la formación del hipocampo, cortezas subulares y enterales desde el lado anterior hasta el posterior con el vibram. Después de eso, transfiera las rodajas a una incubadora en forma de U y sumérjalas y cocélelas durante al menos dos horas a 32 grados centígrados con carbogen A CSF.

Ahora transfiera un corte de hipocampo a la cámara de registro de tipo sumergido montada bajo un microscopio. Perfundió la rebanada con CSF A carbonatado a seis mililitros por minuto durante al menos 30 minutos a 32 grados centígrados. Después de 30 minutos, llene los microelectrodos capilares de vidrio con un líquido cefalorraquídeo.

Coloque un microelectrodo en las fibras colaterales de Schaefer para la estimulación, y otro en el átomo listo para el estrato de CA para el registro de EPSP de campo con una distancia de 300 micrómetros. A continuación, evoque los SSP EP de campo suministrando de tres a cuatro voltios por pulsos de corriente rectangular fásicos a las fibras colaterales de Schafer. Realice la prueba de estimulación máxima midiendo la relación de entrada y salida y defina la fuerza de estimulación como el 40% del valor máximo de la pendiente de los EPSP de campo.

A continuación, registre la línea de base durante al menos 15 minutos midiendo las respuestas a los estímulos de prueba cada minuto durante todo el experimento. Para inducir LTP tardío, aplique teína de alta frecuencia para aumentar las EPSP de campo evocado en aproximadamente una región. Aplique cinco micromolares por COE al LCR A dos minutos antes de la tetina y lávese inmediatamente después del último tétanos.

Detenga la grabación. Dos minutos o 30 minutos después de la inducción tardía de LTP, retire los electrodos y transfiera rápidamente la rebanada a una plataforma de metal preenfriada colocada sobre hielo seco. A continuación, recoge cada rebanada en un tubo de 1,5 mililitros y guárdala a 80 grados centígrados negativos.

En este paso, saque las rodajas congeladas de los 80 grados centígrados negativos y manténgalas en hielo. Agregue 0,5 mililitros de tampón TBS fresco y frío que contenga inhibidores de proteasa y fosfatasa en el tubo. Incubarlos durante dos o tres minutos antes de pasarlos a un microscopio estereoscópico.

A continuación, diseccione el CA en una región del hipocampo del estrato parama sosteniendo el corte con una aguja y cortando el CA en un área con la otra. Posteriormente, recoja las regiones disecadas de cinco rodajas por grupo en un nuevo tubo de mililitros de un punto que contenga 50 microlitros de tampón de lisis. A continuación, homogeneice los tejidos recogidos pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 200 microlitros.

Incube el lisado en hielo durante cinco a siete minutos para permitir que las células se hinchen. Después de eso, tome dos microlitros del lisado y colóquelo en un portaobjetos de microscopio. Visualice la hinchazón de las células bajo un microscopio de campo brillante.

Los núcleos aparecen como estructuras redondas intactas con una hinchazón adecuada. Ahora, recoja 20 microlitros de muestra en un tubo nuevo de 1,5 mililitros como fracción homogeneizada. Agregue ocho microlitros de tampón de muestra desnaturalizante cuatro XSDS.

A continuación, centrifugar el lisado restante a 1100 RCF durante un minuto. Después de un minuto, recoja con cuidado el sobrenadante de la parte superior y transfiéralo a un nuevo tubo. A continuación, agregue 20 microlitros de cuatro tampones de muestra.

A continuación, vuelva a suspender el pellet en 60 microlitros de tampón hipotónico y añada 20 microlitros de cuatro tampones de muestra. Esta fracción se denomina fracción enriquecida nuclear. Almacene las fracciones homogeneizadas, citosólicas y enriquecidas nucleares a menos 20 grados Celsius o -80 grados Celsius.

Para la inmunotransferencia posterior en este procedimiento, descongele las muestras y hiérvalas durante cinco minutos a 95 grados Celsius antes de medir la concentración de proteínas mediante la prueba de negro AM ito, o carga de prueba BCA, una cantidad igual de muestras de proteínas de las fracciones homogeneizadas, citoplasmáticas y enriquecidas nucleares. En una página de SDS, las muestras de gel del control y los cortes de LTP deben colocarse en el mismo gel para la comparación directa en el Western blot. Esta figura muestra un inmunoblot para las fracciones homogeneizadas, citosólicas y enriquecidas nucleares de un lisado de ca one sondeadas con marcadores citosólicos y nucleares.

Se trata de un análisis inmuno-blot de los niveles de PJS 180 en el homogeneizado dos minutos y 30 minutos después de la inducción de la teína, y se trata de un análisis inmuno-sanguíneo de los niveles de PJS 180 en la fracción nuclear enriquecida. Dos minutos y 30 minutos después de la ización, los niveles de fosfo Jacob permanecieron inalterados en el total de CA una proteína homogeneizada y en la fracción nuclear enriquecida dos minutos después de la ización. Pero se encontró un aumento significativo en p Jacob, S 180 Inmunorreactividad 30 minutos después de la inducción de LTP.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar un volumen adecuado de válvula de lisis hipotónica. Además, es necesario estandarizar el marco de tiempo crítico para la lisis de las muestras. En particular, cuando este método se aplica para el aislamiento de muestras de tejido cerebral de rata o ratón distintas del hipocampo Después de este procedimiento, otros métodos como la tinción inmunitaria complementaria con anticuerpos contra proteínas candidatas importadas al núcleo después de la inducción de OTP o moléculas de señalización como formas activas de quinasa o fosfatasa, pueden ser útiles para verificar esos resultados.

Se puede realizar un tratamiento farmacológico para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, qué cascadas de señalización están involucradas en la translocación de la proteína nuclear sináptica meers, o cómo influyen en una función nuclear. Además, se podría estudiar el papel de las proteínas mensajeras nucleares de la sinapis en las enfermedades que afectan al hipocampo.

Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.