Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la

El objetivo general de este procedimiento es determinar los genes o vías implicados en la angiogénesis mediante el uso de un método in vitro rápido y cuantitativo. Esto se logra primero mediante el agotamiento de suero en células endoteliales primarias o inmortalizadas el día anterior al ensayo. El segundo paso consiste en incubar las células endoteliales con calcine durante 30 minutos, seguido de lavar las células con PBS.

A continuación, las células endoteliales se tripsinizan, se filtran para eliminar agregados y se cuentan. El paso final consiste en combinar las células endoteliales con medio condicionado que contiene posibles factores angiogénicos y distribuirlas sobre un extracto de membrana basal solidificado. Finalmente, se utiliza microscopía de luz o fluorescencia para visualizar las redes tubulares, las cuales pueden cuantificarse posteriormente mediante programas informáticos especializados.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos para evaluar la angiogénesis es que es fácil de establecer, relativamente económica, produce túbulos en cuestión de horas y es cuantificable, demostrando así esta técnica. ¿Es Erica Bullwinkle una estudiante de posgrado en el departamento de biología de la American University? Utilizando el medio adecuado, transfiera tres células B11 a un nuevo frasco dos días antes de comenzar el ensayo para obtener los mejores resultados; las células deben estar entre el segundo y sexto pase cuando se utilicen.

A continuación, cultive las células durante 24 horas en dmm suplementado. Cuando las células estén listas, se someten a privación de suero. Reemplazando el medio por un medio con suero reducido, cultive las células privadas de suero durante 24 horas adicionales.

Para obtener los mejores resultados, es importante confirmar con el fabricante que la concentración de la solución stock de BME es de 10 miligramos por mililitro. Descongele la BME con factores de crecimiento reducidos en el refrigerador. Dado que la BME se solidifica cuando está cálida, se mantiene fría antes de su uso.

A continuación, descongele los medios necesarios para el ensayo para su visualización mediante microscopía de fluorescencia o microscopía confocal, y agregue calcina AM al medio hasta una concentración final de dos microgramos por mililitro. Incube las células marcadas con calcina AM a oscuras durante aproximadamente 30 a 45 minutos. Transcurrido este tiempo, retire el medio y lave las células 3B11 con DPBS. A continuación, realice la tripsinización de las células añadiendo un mililitro de tripsina-EDTA. Una vez completada la tripsinización.

Re-suspenda las células hasta un volumen final de 10 mililitros. En dmm suplementado, elimine cualquier agregado de las células filtrándolas a través de un colador celular de 100 micrómetros. Después de contar las células re-suspendidas, ajústelas a la concentración final correcta para comenzar el ensayo de formación de tubos en frío.

Una placa de 24 pocillos y puntas de un mililitro durante 20 a 30 minutos antes de cargarlas. Esto evita que el BME se solidifique prematuramente. Cuando esté listo para comenzar, pipetee 250 microlitros de BME con factor de crecimiento reducido en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Evite crear burbujas no presionando la pipeta hasta su tope final.

Al pipetear, una vez cargadas las pocilas, verifique que quede suficiente BME en el centro de cada pocila. Cuando se forme el menisco, si la matriz es demasiado delgada, las células solo formarán una monocapa. A continuación, incube la placa durante 30 minutos para solidificar el BME.

Una vez que el BME haya solidificado, mezcle aproximadamente 300 microlitros de medio condicionado con 10 microlitros de suspensión de tres células B 11 y distribuya la suspensión celular en los pocillos de la placa. Después de colocar la placa en el incubador, los tubos comenzarán a formarse dentro de las dos a cuatro horas; dependiendo de la concentración del factor angiogénico en el medio condicionado, la formación máxima de tubos puede ocurrir entre las tres y doce horas. El momento del ensayo deberá optimizarse según las condiciones individuales del estudio.

Los tubos a menudo comienzan a deteriorarse dentro de las 18 horas, y las células endoteliales experimentarán apoptosis en el momento de la formación máxima de tubos. Aspire cuidadosamente el medio de cada pocillo para evitar alterar la red de tubos. A continuación, lave cada pocillo con un mililitro de DPBS para una visualización inmediata.

Agregue un mililitro de DPBS fresco a cada pocillo e imagine la red de tubos en un microscopio confocal para fijar una red de tubos para su posterior visualización. Añada paraformaldehído al 4 % a cada pocillo aspirado e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el paraformaldehído, lave dos veces con DPBS y luego agregue un mililitro de DPBS fresco a cada pocillo. Estas imágenes muestran que los factores angiogénicos secretados por queratinocitos o fibroblastos de ratón son capaces de inducir la formación de tubos.

Con el tiempo, las células endoteliales migran y comienzan a formar pequeñas ramificaciones entre una y dos horas después de la siembra. La formación máxima de tubos se alcanzó entre cuatro y seis horas. A las 24 horas, algunas ramificaciones permanecieron, pero muchas de las células se volvieron apoptóticas y los tubos comenzaron a desconectarse.

El número de células tiene un impacto profundo en la formación de tubos. Cuando se siembran un número insuficiente de células, se forman pocos tubos y la red es mínima; a medida que se siembran más células, la red de tubos se vuelve más extensa. Sin embargo, en concentraciones demasiado altas, las células comienzan a agruparse o a formar monocapas, y las diferencias entre los grupos de tratamiento quedan enmascaradas. Las células deben tener un mínimo de dos pasajes para asegurar una formación adecuada de tubos.

La tasa de crecimiento de tres B 11 es tan rápida que el 25% de las células pasadas un día producirán un frasco confluyente al día siguiente. Aquí, se utiliza Image J con el complemento de angiogénesis en una red de tubos teñidos con calcine AM para detectar el número total de nodos, tubos en malla en combinación y superpuestos en la red. Además, este programa puede utilizarse para detectar individualmente nodos, tubos o mallas, que pueden cuantificarse.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la angiogénesis in vitro de forma rápida y confiable, evitando al mismo tiempo los errores comunes.