Name: Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la In Vitro Estudio de la angiogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprende el ensayo de formación de tubos con células endoteliales para estudiar la angiogénesis in vitro. Este método rápido permite visualizar y cuantificar redes tubulares mediante microscopía.

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Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud, y por el NCI concede UA5CA152907.

1. Colección de medio condicionado a la Prueba de Potencial angiogénico <ol><li> Se cultivan las células primarias o inmortalizadas a ensayar para poder angiogénico y anti-angiogénico en medio de suero nativas o bajas y recoger el medio condicionado. <ol><li> Alternativamente, el uso de medios acondicionados de inmediato, o se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C durante varios meses. Utilizar los medios de suero nativa o bajo nonconditioned como un control negativo, y el uso de medios no acondicionado completa de crecimiento (10% de FBS, o la concentración apropiada) como control positivo. Alternativamente, para probar posibles estimuladores de la angiogénesis, suplemento de carbón despojado medios que carecen de factores de crecimiento con concentraciones conocidas de proteínas específicas de interés y se compara con el factor de crecimiento medios de comunicación libres por sí solos. </li></ol></li></ol> 2 Preparación de las células endoteliales antes del ensayo <ol><li> Dos días antes del ensayo, el paso 3B-11 células en un nuevo matraz T-75. Número de paso de las células es importante. Este ensayo funciona mejor cuando las células están entre el segundo y sexto pasajes. El ensayo no va a funcionar bien si las células endoteliales se utilizan antes de la segunda o después del décimo paso. </li><li> Se cultivan las células durante 24 horas en DMEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Un día antes del ensayo, el suero de hambre células 3B-11 como sigue: <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de las células 3B-11. </li><li> Añadir un medio de suero reducido de DMEM suplementado con 0,2% de FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Se cultivan las células durante 24 h más. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de los reactivos antes del ensayo NOTA: Las concentraciones de BME son muy variables dependientes en el lote. BME no funciona bien si la concentración es menor que 10 mg / ml, por lo tanto, el fabricante BME debe ser contactado antes de la compra para garantizaradquisición de un lote de concentrado adecuadamente. <ol><li> Descongelar reduce el factor de crecimiento BME en el refrigerador. BME se solidifica cuando se calienta, por lo que debe mantenerse en frío antes de su uso. BME se puede almacenar en el refrigerador por un par de semanas, o en alícuotas y se congeló a -80 ° C. </li><li> Un factor de crecimiento reducido BME se prefiere sobre el tradicional BME. La falta de factores angiogénicos en el BME, será más fácil observar el efecto que los factores a partir de los medios condicionados tienen en la formación del tubo. </li><li> Descongele los medios de comunicación a ensayar. </li></ol> 4 Preparación de las células endoteliales Inmediatamente antes del ensayo <ol><li> Lavado 3B-11 células en DPBS. <ol><li> Si se desea la visualización con fluorescencia o microscopía confocal, antes de lavar las células 3B-11, añadir calceína AM a las células endoteliales en los medios a una concentración final de 2 mg / ml. Coloque células marcadas calceína en la oscuridad a 37 ° C y 5% de CO 2 antes del inicio del ensayo. Disolver de stock calceınaAM en DMSO y una vez calceína se diluye en concentración final de DMSO medios de comunicación no debe exceder de 0,1%. Después de 30 a 45 min de lavado calceína AM de las células (paso 4.1) y continuar con el experimento siguiente. </li></ol></li><li> Tripsinizar las células mediante la adición de 1 ml de tripsina-EDTA al matraz T-75. </li><li> Después de tripsinización es completa, neutralizar la tripsina resuspendiendo las células a un volumen final de 10 ml en DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. </li><li> Las células de filtro a través de filtro de células 100 micras para eliminar grumos. </li><li> Contar las células y volver a suspender las células a una concentración final de 7,5 x 10 6 células / ml en DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina. </li></ol> Ensayo de Formación 5. Tubo <ol><li> Coloque la placa de 24 pocillos y 1 ml de recomendaciones en el refrigerador o en hielo durante 20-30 minutos antes de cargar la placa para que el BME no Prematurely solidificar. </li><li> Pipetear 250 l de factor de crecimiento reducido BME en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Evitar la creación de burbujas por no presionar la pipeta hasta la última parada, mientras que la dispensación. Tenga cuidado de que suficiente BME se mantiene en el centro del pozo cuando se forma el menisco; si la matriz es demasiado delgada, las células sólo se forman una monocapa. </li><li> Incubar la placa de 24 pocillos a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 30 minutos para solidificar BME. </li><li> Una vez que BME ha puesto, mezcle aproximadamente 300 l de medio condicionado con 10 l de resuspendidas 3B-11 células (aproximadamente 75.000 células). <ol><li> Ajustar el volumen de medio acondicionado y número de células sembradas en función del tipo de célula endotelial utilizado, y probar las diluciones seriadas de los medios acondicionados para demostrar la actividad. Si las células que comparan cultivadas bajo diferentes condiciones, normalizar acondicionado volumen de medios de comunicación para el número de células que fueron utilizadas para acondicionar los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Tubos will comienzan a formarse dentro de 2-4 horas. Dependiendo de la concentración de factor angiogénico en los medios acondicionados, la formación de pico tubo puede ocurrir entre 3 y 12 horas y el momento del ensayo tendrá que ser optimizado. Si se trabaja con células endoteliales primarias en lugar de células inmortalizadas, la formación inicial del tubo se puede retrasar por varias horas. <ol><li> Tubos a menudo comienzan a deteriorarse dentro de 18 hr y células endoteliales se someterá a la apoptosis. </li></ol></li><li> En el momento de la formación del tubo de pico, medios de comunicación cuidadosamente aspirado desde el pozo para evitar la interrupción de la red en el tubo de BME. <ol><li> Lavar cada pocillo con 1 ml de DPBS, y aspirar. <ol><li> Para la visualización inmediata, añadir 1 ml de DPBS frescas a cada tubo de la red bien y la imagen usando un microscopio invertido conectado a una cámara digital, o fluorescencia / microscopio confocal si las células se tiñeron con calceína AM como en 4.1.1. </li><li> Para arreglar la red de metro para la visualización posterior, y añadir 4% de paraformaldehído a cadaaspirado pocillo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente. <ol><li> Eliminar paraformaldehído, lavar dos veces con DPBS, a continuación, añadir 1 ml de DPBS frescos a cada pocillo. </li><li> Microscópicamente imagen antes de la fijación como unos tubos pueden romper durante este procedimiento. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. Cuantificación de tubo Red <ol><li> Cuantificar la red de metro de diferentes maneras dependiendo de las preferencias del investigador, y varios programas de ordenador tienen capacidad para medir los siguientes parámetros: número de tubos; número de bucles / mallas; número de sitios de sucursal / nodos; longitud de los tubos. </li><li> Utilice programa informático representativo como imagen J con el plugin Angiogénesis analizador 16 para la cuantificación de las redes de metro. </li></ol>

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<li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+contribution%3A+Angiogenesis+Analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ+News%22%5BJournal%5D)">ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La angiogénesis está implicada en los procesos fisiológicos y patológicos. El estudio de los mecanismos implicados en la angiogénesis requiere el uso de ensayos que recapitular los pasos principales en la angiogénesis. El ensayo de formación de tubo celular endotelial ofrece varias ventajas sobre otros ensayos. Es fácil de configurar, es relativamente barato, produce túbulos en cuestión de horas, y es cuantificable. Además, se puede completar en 24 ó 96 placas de pocillos, y por lo tanto se puede utilizar para selección...

La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, es vital para una variedad de procesos que incluyen el crecimiento de órganos, el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y 1-3. Nuevo desarrollo de los vasos sanguíneos, se alinearon por las células endoteliales, el suministro de oxígeno y nutrientes a los tejidos, la promoción de la vigilancia inmunológica de las células hematopoyéticas y eliminar los productos de desecho 2,4. La angiogénesis es de vital importancia durante el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo, este proceso permanece latente en el adulto, excepto en tiempos de cicatrización de heridas, el crecimiento del esqueleto, el embarazo o durante el ciclo menstrual 1-3. En las últimas dos décadas, los mecanismos moleculares que regulan la angiogénesis clave han comenzado a surgir. La angiogénesis es un evento estrictamente regulados, equilibrada por señales pro y antiangiogénicos, que incluyen las integrinas, quimiocinas, angiopoyetinas, agentes de detección de oxígeno, moléculas de unión y los inhibidores endógenos 5. Una vez proangiogenic señales tales como el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF) activan los receptores de las células endoteliales de las células endoteliales liberan proteasas para degradar la membrana basal. Las células endoteliales proliferan y migran a continuación, la formación de brotes a una velocidad de varios milímetros por día 6,7. La angiogénesis está asociada con diversas condiciones patológicas, incluyendo cáncer, psoriasis, retinopatía diabética, artritis, asma, trastornos autoinmunes, enfermedades infecciosas, y la aterosclerosis 8-10. Debido a la importancia de la angiogénesis en diversas enfermedades, la comprensión de los genes y las vías que regulan este proceso es fundamental para el diseño de mejores terapias. El ensayo de formación de tubo es un método rápido y cuantitativo para la determinación de genes o rutas implicadas en la angiogénesis. Descrita por primera vez en 1988,los principios subyacentes de este ensayo son que las células endoteliales conservan la capacidad de dividirse y migrar rápidamente en respuesta a las señales angiogénicas 11-13. Además, las células endoteliales son inducidas a diferenciarse y formar estructuras similares a tubos cuando se cultivan sobre una matriz de extracto de membrana basal (BME). Estos tubos contienen un lumen rodeado por las células endoteliales unidas entre sí a través de complejos de unión. La formación del tubo se produce rápidamente con la mayoría de los tubos que forman en este ensayo a las 2-6 horas dependiendo de la cantidad y tipo de estímulos angiogénicos. Varios tipos de células endoteliales pueden ser utilizados para este ensayo incluyendo tanto células primarias y líneas celulares inmortalizadas 14,15. La línea celular utilizada para este artículo fue ratón 3B-11, pero la misma metodología se puede aplicar con otras líneas de células endoteliales tales como SVEC4-10 (ratón) o células endoteliales primarias tales como las células HUVEC (humanos). Dependiendo de la línea celular se utiliza y si el ce endotelialLLS se transforman o no transformadas, tendrá que ser llevado a cabo para identificar el momento ideal necesaria para la formación correcta del tubo de optimización.

<table><tbody><tr><td>Costar placa tratada con cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel matriz de membrana basal, factor de crecimiento reducido</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Gibco 0,05% tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Gibco pluma strep</td><td>Life Tecnologías</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DMEM (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A Calceína</td><td></td></tr><tr><td>AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em&gt; in vitro</em&gt; estudio de la angiogénesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

La angiogénesis es un proceso vital para el desarrollo del tejido normal y la curación de heridas, pero también se asocia con una variedad de condiciones patológicas. Usando este protocolo, la angiogénesis se puede medir in vitro de una manera rápida, cuantificable. Células endoteliales primarias o inmortalizadas se mezclan con medio condicionado y se sembraron en la matriz de la membrana basal. Las células endoteliales forman estructuras similares a capilares en respuesta a señales angiogénicas que se encuentran en los medios condicionados. La formación del tubo se produce rápidamente con células endoteliales comenzando a alinearse dentro de 1 hora y túbulos que contienen lumen-comenzando a aparecer dentro de 2 horas. Los tubos pueden ser visualizados utilizando un microscopio invertido de contraste de fase, o las células pueden ser tratadas con calceína AM antes del ensayo y tubos visualizado a través de fluorescencia o microscopía confocal. El número de sitios de sucursal / nodos, bucles / mallas, o el número o la longitud de los tubos formados pueden ser fácilmente cuantificado como una medida de en vitro angiogénesis. En resumen, este ensayo se puede usar para identificar los genes y las vías que están involucrados en la promoción o inhibición de la angiogénesis en una manera rápida, reproducible y cuantitativo.

Ratón 3B-11 células endoteliales fueron sembradas en el factor de crecimiento reducido solidificado BME - en este ensayo, el producto Matrigel se utilizó - y siguió a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 1, los factores angiogénicos secretados por cualquiera de los queratinocitos o fibroblastos de ratón son capaces de inducir la formación de tubos con el tiempo. Las células endoteliales migran y se empiezan a formar las ramas pequeñas dentro de 1-2 horas de la siembra. Formación de tubo máx...

El ensayo de formación de tubo es un método rápido, cuantificable para medir la angiogénesis in vitro. Las células endoteliales se combinan con los medios condicionados y se sembraron en extracto de membrana basal. La formación del tubo se produce dentro de horas y los túbulos recién formadas cuantificarse fácilmente.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudio de la angiogénesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar los genes o vías implicados en la angiogénesis mediante el uso de un método in vitro rápido y cuantitativo. Esto se logra primero mediante el agotamiento de suero en células endoteliales primarias o inmortalizadas el día anterior al ensayo. El segundo paso consiste en incubar las células endoteliales con calcine durante 30 minutos, seguido de lavar las células con PBS.A continuación, las células endoteliales se tripsinizan, se filtran para eliminar agregados y se cuentan. El paso final consiste en combinar las células endoteliales con medio condicionado que contiene posibles factores angiogénicos y distribuirlas sobre un extracto de membrana basal solidificado. Finalmente, se utiliza microscopía de luz o fluorescencia para visualizar las redes tubulares, las cuales pueden cuantificarse posteriormente mediante programas informáticos especializados.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos para evaluar la angiogénesis es que es fácil de establecer, relativamente económica, produce túbulos en cuestión de horas y es cuantificable, demostrando así esta técnica. ¿Es Erica Bullwinkle una estudiante de posgrado en el departamento de biología de la American University? Utilizando el medio adecuado, transfiera tres células B11 a un nuevo frasco dos días antes de comenzar el ensayo para obtener los mejores resultados; las células deben estar entre el segundo y sexto pase cuando se utilicen.A continuación, cultive las células durante 24 horas en dmm suplementado. Cuando las células estén listas, se someten a privación de suero. Reemplazando el medio por un medio con suero reducido, cultive las células privadas de suero durante 24 horas adicionales.Para obtener los mejores resultados, es importante confirmar con el fabricante que la concentración de la solución stock de BME es de 10 miligramos por mililitro. Descongele la BME con factores de crecimiento reducidos en el refrigerador. Dado que la BME se solidifica cuando está cálida, se mantiene fría antes de su uso.A continuación, descongele los medios necesarios para el ensayo para su visualización mediante microscopía de fluorescencia o microscopía confocal, y agregue calcina AM al medio hasta una concentración final de dos microgramos por mililitro. Incube las células marcadas con calcina AM a oscuras durante aproximadamente 30 a 45 minutos. Transcurrido este tiempo, retire el medio y lave las células 3B11 con DPBS. A continuación, realice la tripsinización de las células añadiendo un mililitro de tripsina-EDTA. Una vez completada la tripsinización.Re-suspenda las células hasta un volumen final de 10 mililitros. En dmm suplementado, elimine cualquier agregado de las células filtrándolas a través de un colador celular de 100 micrómetros. Después de contar las células re-suspendidas, ajústelas a la concentración final correcta para comenzar el ensayo de formación de tubos en frío.Una placa de 24 pocillos y puntas de un mililitro durante 20 a 30 minutos antes de cargarlas. Esto evita que el BME se solidifique prematuramente. Cuando esté listo para comenzar, pipetee 250 microlitros de BME con factor de crecimiento reducido en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Evite crear burbujas no presionando la pipeta hasta su tope final.Al pipetear, una vez cargadas las pocilas, verifique que quede suficiente BME en el centro de cada pocila. Cuando se forme el menisco, si la matriz es demasiado delgada, las células solo formarán una monocapa. A continuación, incube la placa durante 30 minutos para solidificar el BME.Una vez que el BME haya solidificado, mezcle aproximadamente 300 microlitros de medio condicionado con 10 microlitros de suspensión de tres células B 11 y distribuya la suspensión celular en los pocillos de la placa. Después de colocar la placa en el incubador, los tubos comenzarán a formarse dentro de las dos a cuatro horas; dependiendo de la concentración del factor angiogénico en el medio condicionado, la formación máxima de tubos puede ocurrir entre las tres y doce horas. El momento del ensayo deberá optimizarse según las condiciones individuales del estudio.Los tubos a menudo comienzan a deteriorarse dentro de las 18 horas, y las células endoteliales experimentarán apoptosis en el momento de la formación máxima de tubos. Aspire cuidadosamente el medio de cada pocillo para evitar alterar la red de tubos. A continuación, lave cada pocillo con un mililitro de DPBS para una visualización inmediata.Agregue un mililitro de DPBS fresco a cada pocillo e imagine la red de tubos en un microscopio confocal para fijar una red de tubos para su posterior visualización. Añada paraformaldehído al 4 % a cada pocillo aspirado e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el paraformaldehído, lave dos veces con DPBS y luego agregue un mililitro de DPBS fresco a cada pocillo. Estas imágenes muestran que los factores angiogénicos secretados por queratinocitos o fibroblastos de ratón son capaces de inducir la formación de tubos.Con el tiempo, las células endoteliales migran y comienzan a formar pequeñas ramificaciones entre una y dos horas después de la siembra. La formación máxima de tubos se alcanzó entre cuatro y seis horas. A las 24 horas, algunas ramificaciones permanecieron, pero muchas de las células se volvieron apoptóticas y los tubos comenzaron a desconectarse.El número de células tiene un impacto profundo en la formación de tubos. Cuando se siembran un número insuficiente de células, se forman pocos tubos y la red es mínima; a medida que se siembran más células, la red de tubos se vuelve más extensa. Sin embargo, en concentraciones demasiado altas, las células comienzan a agruparse o a formar monocapas, y las diferencias entre los grupos de tratamiento quedan enmascaradas. Las células deben tener un mínimo de dos pasajes para asegurar una formación adecuada de tubos.La tasa de crecimiento de tres B 11 es tan rápida que el 25% de las células pasadas un día producirán un frasco confluyente al día siguiente. Aquí, se utiliza Image J con el complemento de angiogénesis en una red de tubos teñidos con calcine AM para detectar el número total de nodos, tubos en malla en combinación y superpuestos en la red. Además, este programa puede utilizarse para detectar individualmente nodos, tubos o mallas, que pueden cuantificarse.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la angiogénesis in vitro de forma rápida y confiable, evitando al mismo tiempo los errores comunes.

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Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Aquí, evaluamos los efectos del extracto de agua de Ruta graveolens en la formación de la red de recipientes mediante el uso de un ensayo de formación de tubos en una matriz de sótano gelizado.

HUVEC Ensayo de formación de tubos para evaluar el impacto de los productos naturales en la angiogénesis

El objetivo de este método es obtener matrices 3D derivadas de fibroblastos como un andamio natural para ensayos celulares posteriores. Los fibroblastos se sembran en una placa de cultivo pretratada y se estimulan con ácido ascórbico para la generación de matrices. Las matrices se descelularizan y se bloquean para cultivar células relevantes (por ejemplo, células endoteliales).

Sistema de matriz 3D derivado de fibroblastos aplicable al ensayo de formación de tubos endoteliales

Aquí se presenta un protocolo para el análisis de hibridación de ARN in situ de montaje completo en ensayos de formación de peces cebra y tubos en células endoteliales derivadas de células madre inducidas por el paciente para estudiar el papel de la endoglina en la formación vascular.

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Este ensayo utiliza células madre embrionarias de ratón diferenciadas en cuerpos embrioides cultivados en gel de colágeno 3D para analizar los procesos biológicos que controlan la angiogénesis germinada in vitro. La técnica se puede aplicar para probar medicamentos, modelar enfermedades y estudiar genes específicos en el contexto de deleciones que son embrionariamente letales.

In vitro Ensayo de germinación tridimensional de angiogénesis utilizando células madre embrionarias de ratón para el modelado de enfermedades vasculares y pruebas de fármacos

El presente protocolo permite la recuperación de estructuras en forma de tubo formadas en el ensayo clásico de formación de tubos de angiogénesis in vitro , donde las células, como las células trofoblásticas, se organizan en estructuras similares a capilares sobre una capa de matriz de membrana basal extracelular. Las estructuras recuperadas se utilizan para el aislamiento de ARN y proteínas para diversos análisis bioquímicos.

Ensayo de recuperación de células trofoblásticas de angiogénesis y formación de tubos para el análisis de la expresión de marcadores de diferenciación

Aprende el ensayo de formación de tubos con células endoteliales para estudiar la angiogénesis in vitro. Este método rápido permite visualizar y cuantificar redes tubulares mediante microscopía.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la

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