Name: Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprende a cartografiar propiedades mecánicas de tejidos vegetales mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) en Arabidopsis. Este protocolo permite correlacionar cambios mecánicos de paredes celulares con procesos de desarrollo y morfogénesis.

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Damos un agradecimiento especial a Yves Couder útil para muchos debates. Agradecemos a Atef Asnacios para la calibración de los voladizos y discusión. Damos las gracias a Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, y Oliver Hamant para la lectura crítica. Este trabajo fue financiado en parte por la Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C subvención; la Agence Nationale de la Recherche proyecta&#39;&#39; Growpec&#39;&#39; y&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. Preparar cristal diapositivas para la Muestra de montaje <ol><li> Preparar imbedding medios de agarosa: 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión en el 10% de manitol (en agua). </li><li> El uso de un instrumento de metal fuerte (por ejemplo, la punta de perforación, cal), grabar un área de 0,5 x 0,5 cm en el centro de un portaobjetos de vidrio microscopía. O en lugar, pegar un pequeño trozo de lámina de vidrio (aproximadamente 20 x 200 m) a la lámina de vidrio con pegamento Araldite. NOTA: Este hace rugosa la superficie a fin de facilitar la adhesión de la agarosa para garantizar que los palos de los medios de comunicación de agarosa o correcciones a la diapositiva. Esta diapositiva se puede reutilizar. </li><li> Coloque una gota de aproximadamente 20 l de imbedding medios de agarosa en la región grabada al agua fuerte de la lámina de vidrio. Esto da una película delgada de agarosa. </li><li> Guarde la placa de vidrio en una caja húmeda y esperar a que los medios de comunicación de agarosa para solidificar. </li></ol> 2. Disecante y montaje Muestras de meristemas <ol><li> Microdissect meristemos para imagi confocalng: quitar las yemas florales, uno por uno desde el tallo tirando hacia abajo con pinzas ultrafinas. Es importante eliminar todas las yemas florales hasta los brotes que no presentan sépalos (es decir, los primordios P1 14). </li><li> Uso de una hoja de afeitar o la punta de las pinzas, cortar el meristemo de distancia desde el vástago. El corte debe ser paralelo a la región de la superficie meristemo que se va a medir con el AFM. El ápice obtenido debe estar entre 300 my 600 m de alto para caber debajo de la punta del AFM. </li><li> Empuje el ápice en la película de los medios de agarosa preparado en el paso 1.1.4. Elija una posición sobre el portaobjetos de vidrio / agarosa y empuje suavemente de forma que el meristemo es tanto directamente en contacto con el portaobjetos de vidrio y sobresale hacia fuera de la agarosa. Es crucial para posicionar el meristemo en la agarosa dentro de los pocos segundos que siguen a su corte del tallo. NOTA: Este es con el fin de evitar que el meristemo de secado. En esta etapa, el meristemo será de pie en un CRACk debido a que la agarosa se fracturó en la aplicación de presión. </li><li> Preparar varios meristemas de esta manera para formación de imágenes por lotes, siempre que sean de la misma altura y están posicionados de menos de 500 micras una de otra en la diapositiva. Mantenga los meristemos preparados en la caja húmeda mientras la disección de más muestras. NOTA: Se limita la variación procedente de la calibración. Idealmente 2 muestras de cada condición se podrían preparar y medidos al azar. Hasta el momento no hay efecto observado de imágenes por lotes en la medición (el estrés inducido por la respuesta). Esto podría ser gracias a la dilución de las moléculas de señalización de estrés en el agar y / o la solución de montaje. Alternativamente, la respuesta de estrés es la misma independientemente de la cantidad de muestra preparada. </li><li> Antes de pasar al siguiente paso, asegúrese de que la frontera entre el meristemo y las yemas florales es seco. Si no es así, retire suavemente el exceso de agua con papel de filtro. Esto debe evitar que en la siguiente etapa de que el derretidoagarosa inunda la muestra debido a las fuerzas de capilaridad. </li><li> Con una pipeta de 20 l, añadir una cantidad suficiente de montaje de agarosa derretida para rellenar la grieta creada en el paso 1.2.3. y para rodear cada meristemo. La agarosa debe alcanzar el nivel de la cicatriz de la yema floral eliminado (primordio). Para lograr esto, puede ser necesario añadir agarosa en cada extremo de la grieta. </li><li> Cuando se añade la agarosa, se inundará de forma rápida dentro de la grieta; con la pipeta, chupar parte del fundido de montaje de agarosa para asegurar que el meristemo es el punto más alto en la diapositiva. Esto fija el meristemo de manera que no se pueda mover durante la exploración. </li></ol> 3. Montaje de raíces o hipocótilo Muestras <ol><li> Para raices e hipocotilos, sin disección es necesario. En la película fina de agarosa en el portaobjetos de vidrio preparado, hacer un surco bien directamente por encima de un grabado en el vidrio oa lo largo de una lámina de vidrio. Coloque la raíz o del hipocotilo en esta ranura asegurándose de que está en contacto con lavidrio a lo largo de toda su longitud. </li><li> Antes de pasar al siguiente paso, asegúrese de que la muestra está seca en su superficie. Si no es así, retire suavemente el exceso de agua con papel de filtro. </li><li> Añadir derretida montaje agarosa alrededor de la muestra como en el paso 1.2.6. </li></ol> 4. Preparación AFM y Calibración de la sensibilidad (para una JPK Nanowizard AFM) <ol><li> Montar un voladizo en el AFM. El voladizo debe ser montado con penetrador de forma redonda. El radio determinará la x, y, z resolución y la profundidad de penetración en el que la medición precisa podría ser archivada. <ol><li> Para tomar mediciones de meso-escala nanométrica en la superficie de la epidermis, use un penetrador redondo de 50 NM de radio; para tomar medidas de mesoescala, use un micras radio penetrador ronda 0.5; para tomar mediciones a microescala (a través de 2-3 células), utilice un penetrador ronda 2,5 m de radio. </li></ol></li><li> Coloque el láser en la punta del cantilever. Alinear el láser para el mediodel captor con el espejo. </li><li> Coloque un vaso limpio bajo el AFM. NOTA: el siguiente está destinada a transformar la señal de la posición del láser en el receptor AFM en una deformación de la palanca y, mediante la evaluación de la constante elástica del cantilever, para traducirlo en una fuerza. </li><li> Enfoque con un &quot;punto de ajuste&quot; fuerza objetivo de 1 V. </li><li> Seleccione &quot;espectroscopia de fuerza&quot;. Haga una muesca estableciendo el &quot;punto de referencia relativo&quot; máxima a 2 V, el &quot;ampliar la velocidad&quot; a 40 m / s, y la &quot;longitud z&quot; a 5 micras. </li><li> En el menú &quot;Calibración de negocios&quot;, seleccionar la parte lineal de la curva forward para adaptarse a la sensibilidad con el botón &quot;seleccionar la cocinar&quot;. El &quot;punto de ajuste relativa&quot; debe transformarse de &quot;V&quot; en &quot;metros&quot;. </li><li> En el menú &quot;Gestor de calibración&quot;, seleccione &quot;constante de resorte&quot; para evaluar la elasticity del cantilever usando las fluctuaciones térmicas. Pulse el botón &quot;Ejecutar&quot; para obtener el diagrama de densidad espectral del cantilever. Encuentre el pico de resonancia con la frecuencia más baja. Ajuste mediante el botón &quot;seleccionar la cocinar&quot;. NOTA 1: Para más detalles sobre la sintonía fluctuaciones térmicas, leer Cook et al 15. NOTA 2: Es preferible utilizar un método directo para evaluar la elasticidad de la viga en voladizo con una referencia (o material con rigidez conocida). El que se utiliza aquí fue amablemente donada por Atef Asnacios 16. </li><li> Añadir 200 l de solución de manitol al 10% debajo de la punta en voladizo. Vuelva a alinear el láser para el medio de la captor usando el espejo. </li><li> Vuelva a calibrar la sensibilidad: en el menú &quot;Calibración gerente&quot;, haga clic en el botón &quot;desconocido&quot;; repita los pasos 2.3 hasta 2.5. </li></ol> . 5 Adquisición de Datos: Aparente Módulo de Young Cartografía <ol&gt; <li> Coloque las muestras montadas debajo de la AFM y añadir una gota de 500 l de solución de manitol al 10% sobre la muestra. La solución de manitol plasmolyzes las células en cuestión de minutos. </li><li> Enfoque con una fuerza de objetivo (&quot;punto&quot;), de 20 nN (&quot;punto de ajuste&quot; no debe ser más de 3 V) </li><li> Sangría con un &quot;punto de referencia relativo&quot; de 200 nN, un &quot;extender velocidad&quot; de 40 m / s, y &quot;longitud z&quot; de 5 micras. </li><li> Ajuste el &quot;punto de referencia relativo&quot; con el fin de obtener una sangría de 100 nm para la 200 nm montado en voladizo o 0,5 m para el montado en voladizo 1 m / 5 m. </li><li> En el modo &quot;mapeo de la fuerza&quot;, seleccione una región a escanear: para meristemos, 70 micras x 70 micras con una resolución (&quot;píxeles&quot;) de 64 x 64; para hipocotilos y raíces, 100 m x 100 m con una resolución de 64 x 64. </li><li> Pulse SCAN para iniciar los experimentos. Guarde la salida. </li&gt; </ol> . 6 Análisis de Datos: Cálculos aparente módulo de Young <ol><li> Abrir el archivo de datos en el software de análisis de datos. </li><li> Seleccione &quot;procesamiento por lotes&quot; para aplicar el mismo análisis a todas las curvas de un solo mapa. </li><li> Seleccionar &quot;corregir la altura de la flexión del voladizo&quot; de modo para extraer la profundidad de penetración. </li><li> Seleccione &quot;módulo en forma de función de Young&quot; que se asume que la fuerza es proporcional al área de sangría. Ajuste la &quot;plena forma&quot; para parabólicos para suponer que la forma de sangría es una parabólica. </li><li> Indique el radio de la punta. </li><li> Seleccionar preferentemente la curva de &quot;retracción&quot; para el análisis, ya que es menos sensible a la topografía de la curva de &quot;extender&quot;. Sin embargo, si hay adherencia significativa de la sonda durante la &quot;retracción,&quot; utilizar la curva de &quot;extender&quot;, que es insensible a pegarse. </li><li> Conjuntola relación de Poisson de 0,5. Presione en analizar y guardar el resultado. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En las plantas, el cambio de propiedades mecánicas juegan un papel importante en dirigir el crecimiento y la morfogénesis. Hasta la fecha no ha habido un gran progreso en el descubrimiento de las redes genéticas y químicas que controlan el crecimiento de las plantas, pero nuestro conocimiento de cómo estas redes contribuyen y se ven afectados por los cambios en las propiedades mecánicas es rudimentaria. Este método nos debería permitir a llenar este vacío, y por lo que debe ser de gran interés para los científicos que e...

El crecimiento de las plantas se logra por la expansión coordinada de las paredes celulares rígidas que rodean a cada célula del organismo. La acumulación de pruebas indica que es a través de la modificación de la química de la pared celular que las plantas locales controlan esta expansión. La expansión se piensa que es impulsado principalmente por la tensión en las paredes de las células, causados ​​por la alta presión de turgencia de la célula; Esta respuesta cepa a la presión de turgencia se rige por las propiedades mecánicas de las paredes celulares 1. Poco se sabe de estas propiedades mecánicas y la forma en que cambia durante el desarrollo. Además, se sabe poco de cómo se controlan estas propiedades mecánicas y si evaluaciones contribuyen a alterar la química de la pared celular de una manera que está aparentemente coordinados a través de un tejido. Si vamos a entender la conexión entre los cambios químicos y mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo, y en última instancia, cómo estas interacciones microscópicas gobiernan una plantaSe requiere &#39;s crecimiento macroscópico, un método que puede controlar las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos en la escala celular o tisular. El método de microscopía de fuerza atómica (AFM) descrito aquí, que se basa en micrómetros o nanómetros compresiones de tejido o indentaciones, fue desarrollado precisamente para medir las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos simultáneamente en resoluciones subcelulares y a través de regiones enteras de tejido. Otros métodos tienen ya sea una resolución que es demasiado bajo o demasiado alto: el extensómetro sólo es capaz de medir las propiedades mecánicas medias de un tejido completo en la escala milimétrica 2-4, una escala que sea, por ejemplo, demasiado grande para medir los primeros eventos en organogénesis; la microindenter puede efectuar mediciones en resolución subcelular en la escala nanométrica, pero se limita a la medición de las células aisladas y no grupos de células u órganos 5-7. Con la AFM, la requierend tejido, celular, y las resoluciones subcelulares se pueden alcanzar 8-10. Recientemente, varios protocolos han sido desarrollados específicamente para medir la mecánica de los tejidos de plantas que también se podrían utilizar 11, 12. Vamos a presentar aquí la forma de evaluar la elasticidad del tejido a través de la medición del módulo de Young de la aparente 13. El módulo de Young se usa comúnmente para describir la rigidez de un material. Durante pequeña deformación la fuerza requerida para deformar un material es proporcional al área de indentación. El módulo de Young es este coeficiente. En el caso de un material homogéneo continua el mismo coeficiente se mide independientemente del tipo de indentación (tamaño y forma), pero va a cambiar con la velocidad de la medición. En el caso de la compleja estructura del tejido de las plantas, hemos observado hasta el momento que la fuerza es proporcional a la deformación que permite la determinación deun coeficiente de proporcionalidad que denominamos &quot;módulo de elasticidad aparente&quot;. En contraste a partir de medios continuos en las plantas, este módulo de Young aparente es sensible al tamaño de la indentación. No corresponde a la joven módulos de una pared celular pura. Es mejor describe la elasticidad del andamiaje de la pared celular del tejido.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>Todas las 3 generaciones son capaces de hacer el trabajo con la misma preferencia.</td></tr><tr><td>Etapa AFM</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>Requerido para muestras con topografía baja (menos de 11 y micro; m entre el punto más bajo y el punto más alto en el área de escaneo forzado).</td></tr><tr><td>Óptica AFM</td><td>JPK</td><td>Top View Óptica</td><td>Muy importante para posicionar la muestra. Podría ser reemplazado por binoculares de largo alcance o un microscopio.</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>Cualquier tipo de microscopio estereoscópico podría servir.</td></tr><tr><td>Nanosensores en voladizo montados de 150 nm</td><td>Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suiza</td><td>R150-NCL-10</td><td>Para medir solo la pared celular en la superficie de la epidermis use.</td></tr><tr><td>1 y micro; m en voladizo</td><td>Nanosensores Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suiza</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>Para medir la mecánica de la pared celular ortogonal a la superficie de la epidermis.</td></tr><tr><td>Voladizo sin punta</td><td>Nanosensores Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchâtel, Suiza</td><td>TL-NCH-20</td><td>Para medir la mecánica local del tejido (2-3 células de ancho) utilice un 5 &micro; m en voladizo montado. Adjuntamos un 5 &micro; m Cordón de borosilicato a un voladizo sin punta.</td></tr><tr><td>5 y micro; m microesferas de silicio</td><td>Corpuscular</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, Francia</td><td></td><td>Araldite para la fijación del cordón al voladizo sin punta.</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, Nueva Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176; C temperatura de gelificación</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 EE. UU.</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 pinzas de acero inoxidable n.º 5</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Suiza&nbsp;</td><td></td><td></td>951199</tr></tbody></table>

cartográficas basadas en afm de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las resoluciones subcelulares

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Se describe un método recientemente desarrollado para medir las propiedades mecánicas de las superficies de los tejidos vegetales utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM) micro / nano-indentaciones, para un JPK AFM. En concreto, en este protocolo se mide el módulo aparente de Young de las paredes celulares en resoluciones subcelulares entre regiones de hasta 100 m x 100 m en los meristemos florales, hipocotilos y raices. Esto requiere una cuidadosa preparación de la muestra, la correcta selección de los micro-penetradores y profundidades sangría. Para tener en cuenta las propiedades de la pared celular sólo, las mediciones se realizan en soluciones altamente concentradas de manitol con el fin de plasmolizar las células y por lo tanto eliminar la contribución de la presión de turgencia de la célula. En contraste con otras técnicas existentes, mediante el uso de diferentes penetradores y profundidades de indentación, este método permite mediciones multiescala simultánea, <em&gt; Es decir, en las resoluciones subcelulares ya través de cientos de células que comprende un tejido. Esto significa que ahora es posible caracterizar espacialmente-temporalmente los cambios que tienen lugar en las propiedades mecánicas de las paredes celulares durante el desarrollo, lo que permite que estos cambios sean correlacionados con el crecimiento y la diferenciación. Esto representa un paso clave para entender cómo los cambios celulares microscópicas coordinadas provocar eventos morfogenéticos macroscópicas. Sin embargo, varias limitaciones siguen siendo: el método sólo se puede utilizar en bastante pequeñas muestras (alrededor de 100 m de diámetro) y sólo en los tejidos externos; el método es sensible a la topografía de tejido; mide sólo algunos aspectos de las propiedades mecánicas complejas del tejido. La técnica se está desarrollando rápidamente y es probable que la mayoría de estas limitaciones se resolverán en un futuro próximo.

En la Figura 1 se presenta típicos mapas móduli jóvenes de meristemos florales (Figuras 1A y 1B), hipocotilos jóvenes y mayores (figuras 1C-F), y meristemas de la raíz (Figura 1G y 1H). En todos los experimentos el penetrador es semiesférica, pero su radio es diferente por lo que las diferentes resoluciones espaciales se pueden lograr figuras 1C y 1D muestran resultados típicos para pen...

Describimos un método para mapear las propiedades mecánicas de los tejidos vegetales utilizando un microscopio de fuerza atómica (AFM). Nos centramos en cómo registrar los cambios mecánicos que tienen lugar en las paredes celulares durante el desarrollo de las plantas a mesoescala de campo amplio, lo que permite correlacionar estos cambios con el crecimiento y la morfogénesis.

Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

El objetivo general de este procedimiento es mapear las propiedades mecánicas de tejidos vegetales utilizando un microscopio de fuerza atómica. Primero, prepare láminas de vidrio pipeteando una gota de agarosa de baja temperatura de fusión sobre una región grabada de la lámina para formar una película delgada de agarosa. El segundo paso consiste en diseccionar y montar la muestra.Retire los capullos florales del tallo, corte el tallo de marris lejos del tallo y, inmediatamente, incruste el tallo cortado en la película delgada de Agros sobre el vidrio. A continuación, deslice y agregue suficiente agar de montaje fundido para llenar la grieta creada cuando el tallo de Maris fue incrustado en la película de Aros. El último paso consiste en configurar el microscopio de fuerza atómica para la adquisición de datos.En última instancia, el análisis de datos y las mediciones del módulo aparente de Young de las paredes celulares generan un mapa mecánico de las propiedades de las paredes celulares simultáneamente a resoluciones subcelulares y en toda una región del tejido. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que puede medir las propiedades mecánicas de la pared celular simultáneamente a resolución subcelular y en toda una región del tejido. El medio Aros para la inclusión de muestras se prepara a partir de 0,7 % de aros de baja temperatura de fusión, en 10 % de manitol en agua.Utilizando un instrumento metálico resistente, como la punta de un taladro, trace un área de 0,5 por 0,5 centímetros en el centro de un portaobjetos para microscopía. Este procedimiento roughiza la superficie para facilitar la adhesión del agros y asegurar que el medio de agros se adhiera o fije al portaobjetos. Aplique con pipeta una gota de aproximadamente 20 microlitros de medio de agros de inclusión sobre la región grabada del portaobjetos.Esto produce una película delgada de agros. Almacene el portaobjetos de vidrio en una caja húmeda y espere a que el medio Agros solidifique las muestras de Arabidopsis. Ana se utilizará para microscopía de fuerza atómica con el fin de preparar muestras de meristemos.Retire uno por uno los capullos florales del tallo tirando de ellos hacia abajo con pinzas ultrafinas. Es importante eliminar todos los capullos florales hasta llegar a aquellos que no presentan secuelas conocidas como primordio en estadio P1. Con una cuchilla de afeitar o la punta de las pinzas, corte el meristemo separándolo del tallo.El corte debe ser paralelo a la región de la superficie del meristemo que se va a medir con el microscopio de fuerza atómica o un MF. El ápice obtenido debe tener entre 300 micrones y 600 micrones de altura para que no se desmorone durante el experimento. Inmediatamente, introduzca el ápice en la película delgada del medio aros preparado previamente. Elija una posición sobre la laminilla de vidrio o el aros e introduzca suavemente de modo que el meristemo esté en contacto directo con la laminilla de vidrio y sobresalga del aros.La agros se fractura al aplicar presión, por lo que el tallo mari quedará ahora de pie en una grieta. Es crucial colocar el tallo marit en el aros dentro de los pocos segundos siguientes a su corte del tallo. Esto evita que el tallo MA se seque.Pueden prepararse varios tallos de MA de esta manera para la obtención de imágenes por lotes, siempre que tengan la misma altura y estén posicionados a menos de 500 micrones uno del otro. Sobre el portaobjetos, mantenga los tallos de MA preparados en la caja húmeda mientras disecciona otras muestras. Antes de pasar al siguiente paso, use papel de filtro para eliminar suavemente cualquier exceso de agua en el límite entre el meristemo y los brotes florales.Esto se hace para evitar que el agar fundido inunde la muestra debido a las fuerzas capilares. Posteriormente, con una pipeta de 20 microlitros, añada suficiente agar fundido como para rellenar la grieta creada previamente y rodear cada meristemo; el agar debe alcanzar el nivel de la cicatriz del botón floral o primordio gimnástico eliminado. Para lograrlo, puede ser necesario añadir agar en ambos extremos de la grieta.Cuando se añade el agaros, este inundará rápidamente la grieta. Utilice la pipeta para aspirar un poco del agaros de montaje fundido y asegurarse de que el tallo de me sea el punto más alto del portaobjetos. Esto fija el tallo de me para que no pueda moverse durante la obtención de imágenes de raíces y hipo códigos.No es necesaria ninguna disección en la película delgada de agaros. Sobre el portaobjetos preparado, utilice pinzas microscópicas para hacer una ranura directamente encima de una muesca en el vidrio o a lo largo de una lámina de vidrio; coloque la raíz o el hipocótilo en esta ranura, asegurándose de que esté en contacto con el vidrio a lo largo de toda su longitud. Añada agaros de montaje fundido alrededor de la muestra de la misma manera que se mostró para la muestra de tallo me.Un mago nano JP PK. En esta demostración se utiliza un FM. Para comenzar este procedimiento, monte un cantilever con una muesca de forma redondeada en el FM. El radio determinará la resolución en X, Y, Z y la profundidad de indentación a la cual se puede lograr una medición precisa.Para realizar mediciones a escala meso a nano en la superficie de la epidermis, utilice una indentación redonda de radio de 50 nanómetros. Para realizar mediciones a escala meso, utilice una indentación redonda de radio de 0,5 micrómetros, y para realizar mediciones a escala micro a través de dos o tres células, utilice una indentación redonda de radio de 2,5 micrómetros; coloque el láser en la punta del cantiléver. Alinee el láser al centro del captor utilizando el espejo.Coloque un vaso de vidrio limpio debajo del enfoque de AFM con un objetivo para un punto de ajuste de un voltio y seleccione espectroscopía. Realice una indentación estableciendo el punto de ajuste relativo máximo en dos voltios, la velocidad de extensión en 40 micrómetros por segundo y la longitud Z en cinco micrómetros. En el menú del gestor de calibración, seleccione la parte lineal de la curva hacia adelante para ajustar la sensibilidad.Utilizando el botón de selección de rango de ajuste, el punto de referencia relativo debe transformarse de vol a metro a 200 microlitros de solución de manitol al 10%. Debajo de la punta del cantiléver, vuelva a alinear el láser al centro del captor usando el espejo, y moviendo el respecter, recalibre la sensibilidad desde el menú del administrador de calibración. Haga clic en el botón desconocido, seleccione cuatro espectroscopías y realice una indentación como se mostró anteriormente.Seleccione la parte lineal de la curva hacia adelante para ajustar la sensibilidad utilizando el botón seleccionar rango de ajuste para comenzar este procedimiento, coloque las muestras montadas debajo del A FM y agregue una gota de 500 microlitros de solución de manitol al 10% sobre las muestras. La solución de manitol plasma las células en cuestión de minutos; acérquese con el objetivo de punto de referencia de 20 nano Newtons en indentación con un punto de referencia relativo de 200 nano newtons y una velocidad de extensión de 40 micrones por segundo y una longitud Z de cinco micrones. Ajuste el punto de referencia relativo para obtener una indentación de 100 nanómetros para el cantiléver montado de 200 nanómetros o 0.5 micrones para el de un micrón.Modo de mapeo de fuerza con cantilever montado de cinco micrones. Seleccione una región para escanear tallos de mar en 70 por 70 micrómetros con una resolución de 64 por 64 y raíces en 100 por 100 micrómetros con una resolución de 64 por 64. Pulse escanear para iniciar los experimentos y guarde la salida.Comience abriendo el archivo de datos en el software de análisis de datos. Luego seleccione el procesamiento por lotes para aplicar el mismo análisis a todas las curvas de un solo mapa.Seleccione la altura correcta para la flexión del cantiléver para extraer la profundidad de indentación. Seleccione la función de ajuste del módulo de Young. Esto supondrá que la fuerza es proporcional al área de indentación.Configure la forma de la punta como parabólica para asumir que la forma de la indentación es una parábola. Indique el radio de la punta. A continuación, seleccione la curva de retracción para el análisis.La curva de retracción es preferible a la curva de extensión porque es menos sensible a la topografía. Establezca la relación poso en 0,5. Por último, pulse en analizar y guarde el resultado.Se muestran aquí mapas modulares típicos de FM-A de tallos florales de Mars jóvenes y viejos, hipocondros y tallos MA de raíz en todos los experimentos. La indentación es hemisférica, pero su radio varía de modo que se pueden alcanzar diferentes resoluciones espaciales. Estos mapas muestran resultados típicos para indentaciones a escala meso a nano con un radio de 50 nanómetros y profundidades de indentación de 50 nanómetros.El cardiograma revela heterogeneidades a escala microscópica en las paredes celulares superficiales de las células epidérmicas hipocodales. También se muestran resultados típicos para indentaciones a escala mesoscópica con un radio de 500 nanómetros y profundidad de indentación de 500 nanómetros en el meristemo floral, el hipocodo y la raíz. Este cardiograma para indentaciones a escala microscópica con un radio de 2,5 micrómetros y profundidad de indentación de 500 nanómetros reveló un ablandamiento del tejido durante la iniciación de órganos que precedió a cualquier crecimiento visible.Sin embargo, este escaneo se interrumpió debido a que el rango de altura de la muestra excedió el rango Z máximo del microscopio de fuerza atómica (AFM). El movimiento de la muestra durante el experimento debido a una fijación inadecuada puede provocar un escaneo borroso como se muestra aquí. Las regiones cubiertas con agros tampoco pueden medirse adecuadamente, como se ilustra en este ejemplo. Una vez dominada, esta técnica podría realizarse en una hora si se lleva a cabo correctamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La rigidez de la matriz extracelular influye fuertemente en múltiples conductas de las células adherentes. Matriz de rigidez varía espacialmente a lo largo de un tejido, y sufre modificaciones en las condiciones de diversas enfermedades. Aquí desarrollamos métodos para caracterizar las variaciones espaciales en la rigidez de los tejidos del ratón normal de los pulmones y fibrosis con microindentation microscopia de fuerza atómica.

Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Se desarrolló un novedoso protocolo de imagen utilizando un actuador mecánico accionado por motor personalizado para permitir la medición de las respuestas en tiempo real a la tensión mecánica en células vivas. Relevante para la mecanobiología, el sistema puede aplicar deformaciones de hasta el 20% al tiempo que permite obtener imágenes casi en tiempo real con microscopía confocal o de fuerza atómica.

Imágenes de células vivas durante el estiramiento mecánico

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante.  Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Aquí, presentamos la microscopía de fuerza atómica (AFM), operada como una herramienta de nano- y micro-indentación en células y tejidos. El instrumento permite la adquisición simultánea de la topografía de superficie 3D de la muestra y sus propiedades mecánicas, incluyendo el módulo de Young de la pared celular, así como la presión del turgencia.

Uso de la Microscopía de Fuerza Atómica para Medir las Propiedades Mecánicas y la Presión Turgor de Células Vegetales y Tejidos Vegetales

Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

Aquí se presenta el protocolo de la técnica Conpokal, que combina la microscopía de fuerza confocal y atómica en una sola plataforma de instrumento. Conpokal proporciona la misma célula, misma región, cerca de imágenes confocales simultáneas y caracterización mecánica de muestras biológicas vivas.

Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

El protocolo de indentación de microscopía de fuerza atómica ofrece la posibilidad de diseccionar el papel de las propiedades físicas de la pared celular de una célula particular de un tejido u órgano durante el crecimiento normal o restringido (es decir, bajo déficit de agua).

Microscopía de fuerza atómica para estudiar las propiedades físicas de las células epidérmicas de raíces vivas de Arabidopsis

Los estudios de biomecánica de la pared celular son esenciales para comprender el crecimiento y la morfogénesis de las plantas. Se propone el siguiente protocolo para investigar las paredes celulares primarias delgadas en los tejidos internos de órganos de plantas jóvenes utilizando microscopía de fuerza atómica.

Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

La cuantificación del área de contacto y la fuerza aplicada por la punta de una sonda de microscopio de fuerza atómica (AFM) a una superficie de muestra permite la determinación de propiedades mecánicas a nanoescala. Se discuten las mejores prácticas para implementar la nanoindentación basada en voladizo AFM en aire o fluido en muestras blandas y duras para medir el módulo elástico u otras propiedades nanomecánicas.

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

Este protocolo visualiza cómo preparar criosecciones de tejido pulmonar murino, realizar experimentos de mapas de fuerza de microscopía de fuerza atómica y analizar los datos para determinar el módulo de Young de la membrana basal pulmonar murina nativa.

Extracción del módulo de Young de las membranas basales pulmonares murinos nativas de los mapas de fuerza derivados de la microscopía de fuerza atómica

Aprende a cartografiar propiedades mecánicas de tejidos vegetales mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) en Arabidopsis. Este protocolo permite correlacionar cambios mecánicos de paredes celulares con procesos de desarrollo y morfogénesis.

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Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

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