Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

El objetivo general de este procedimiento es mapear las propiedades mecánicas de los tejidos vegetales utilizando un microscopio de fuerza atómica. Primero prepare los portaobjetos de vidrio pipeteando una gota de aros a baja temperatura de fusión sobre una región grabada del portaobjetos para formar una fina película de aros. El segundo paso es diseccionar y montar la muestra.

Retire los capullos florales del tallo, corte el tallo de marris del tallo e inmediatamente incruste el tallo cortado en la fina película Agros en el vidrio. A continuación, deslice la dia, agregue suficientes agros de montaje derretidos para rellenar la grieta creada cuando el tallo de Maris se incrustó en la película de Aros. El paso final es configurar el microscopio de fuerza atómica para la adquisición de datos.

En última instancia, el análisis de datos y las mediciones del módulo aparente de Young de las paredes celulares generan un mapa mecánico de las propiedades de las paredes celulares simultáneamente a resoluciones subcelulares y en regiones enteras de tejido. La principal ventaja de esta técnica sobre el método existente es que puede medir las propiedades mecánicas de la pared celular simultáneamente a la resolución subcelular y en toda la región del tejido. El medio Aros para la inclusión de muestras se prepara a partir de una temperatura de fusión baja del 0,7%, aros en un 10% de manitol en agua.

Con un instrumento metálico fuerte, como la punta de un taladro, grabe un área de 0,5 por 0,5 centímetros en el centro de un cristal de microscopía. El deslizador hace que la superficie sea rugosa para facilitar la adherencia de los agros y asegurar que el medio de agros se adhiera o fije al portaobjetos. Gota de pipeda de unos 20 microlitros de medios agros incrustados en la región grabada del portaobjetos de vidrio.

Esto produce una película delgada de agros. Guarde el portaobjetos de vidrio en una caja húmeda y espere a que los medios Agros solidifiquen las muestras de Arabidopsis. Ana se utilizará para la microscopía de fuerza atómica para preparar muestras de meristemas.

Retire los botones florales uno por uno del tallo tirando de ellos hacia abajo con pinzas ultrafinas. Es importante eliminar todas las yemas florales hasta las yemas que no presentan secuelas conocidas como P de una etapa primor. Con una cuchilla de afeitar o con la punta de las pinzas, corta el meristemo del tallo.

El corte debe ser paralelo a la región de la superficie del meristemo que se va a medir con el microscopio de fuerza atómica o un FM. El ápice obtenido debe tener entre 300 micras y 600 micras de altura para que no se desmorone durante el experimento. Empuje inmediatamente el ápice en la fina película de aros media preparada anteriormente. Elija una posición en el portaobjetos de vidrio o aros y empuje suavemente de modo que el meristemo esté en contacto directo con el portaobjetos de vidrio y sobresalga del aros.

El agros se fractura con la aplicación de presión, por lo que el tallo mari ahora estará parado en una grieta. Es crucial colocar el tallo marit en los aros dentro de unos segundos que siguen a sus cortes desde el tallo. Esto evita que el vástago MA se seque.

De este modo, se pueden preparar varios tallos MA para la obtención de imágenes por lotes, siempre que tengan la misma altura y se coloquen a menos de 500 micras entre sí. En el portaobjetos, mantenga los tallos preparados en la caja húmeda mientras disecciona más muestras. Antes de continuar con el siguiente paso, use papel de filtro para eliminar suavemente el exceso de agua en el límite entre el meristemo y los brotes florales.

Esto es para evitar que los agros derretidos inunden la muestra debido a las fuerzas capilares. Más tarde, con una pipeta de 20 microlitros en suficientes agros de montaje derretidos para rellenar la grieta creada anteriormente y rodear cada meristemo, los aros deben alcanzar el nivel de la cicatriz del botón floral o primor eliminado. Para lograr esto, puede ser necesario agregar agros en cada extremo de la grieta.

Cuando se agrega el agros, se inundará rápidamente en la grieta. Con la pipeta, aspire algunos de los agros de montaje fundidos para asegurarse de que el vástago sea el punto más alto de la corredera. Esto fija el tallo para que no pueda moverse durante la obtención de imágenes de raíces y hipomimos.

No es necesaria ninguna disección en la película delgada de agros. En el portaobjetos de vidrio preparado, use micropinzas para hacer una ranura, ya sea directamente sobre un grabado en el vidrio o a lo largo de una lámina de vidrio, coloque la raíz o el hipo cuña en esta ranura, asegurándose de que esté en contacto con el vidrio a lo largo de su longitud de sujeción. Agregue agros de montaje derretidos alrededor de la muestra de la misma manera que se muestra para la muestra de tallo me.

Un mago JP PK nano. En esta demostración se utiliza un FM. Para comenzar este procedimiento, monte un voladizo con una dentadura de forma redonda en el A FM. El radio determinará la resolución X, Y, Z y la profundidad de indentación a la que se puede archivar una medición precisa.

Para realizar mediciones de meso a nanoescala en la superficie de la epidermis, utilice una dentadura redonda de 50 nanómetros de radio. Para tomar medidas de mesoescala, use una dentadura redonda de 0,5 micras de radio, y para tomar mediciones a microescala en dos o tres celdas, use una cantonura redonda de 2,5 micras de radio, coloque el láser en la punta del voladizo. Alinee el láser con el centro del captor usando el espejo.

Coloque un vidrio limpio debajo de la aproximación A FM con un objetivo para el punto de ajuste de un voltio, seleccione para espectroscopia. Realice una sangría estableciendo el punto de ajuste relativo máximo en dos voltios, la velocidad de extensión a 40 micras por segundo y la longitud Z a cinco micras. En el menú del administrador de calibración, seleccione la parte lineal de la curva de avance para que se ajuste a la sensibilidad.

Usando el botón de selección de rango de ajuste, el punto de ajuste relativo debe transformarse de vol a metro a 200 microlitros de solución de manitol al 10%. Debajo de la punta en voladizo, realinee el láser al centro del captor usando el espejo y, moviendo el respector, recalibre la sensibilidad desde el menú del administrador de calibración. Haga clic en el botón desconocido, seleccione cuatro espectroscopías y realice una sangría como se muestra anteriormente.

Seleccione la parte lineal de la curva de avance para que se ajuste a la sensibilidad usando el botón seleccionar rango de ajuste para comenzar este procedimiento, coloque las muestras montadas debajo del A FM y agregue una gota de 500 microlitros de solución de manitol al 10% sobre las muestras. La solución de manitol plasma las células en cuestión de minutos se acercan con el objetivo para el punto de ajuste de 20 nano Newtons en dent con un punto de ajuste relativo de 200 nano newtons y extienden la velocidad de 40 micras por segundo y la longitud Z de cinco micras. Ajuste el punto de ajuste relativo para obtener una hendidura de 100 nanómetros para el voladizo montado de 200 nanómetros o de 0,5 micras para el de una micra.

Modo de mapeo de fuerza en voladizo montado en cinco micras. Seleccione una región para escanear los tallos de 70 por 70 micras con una resolución de 64 por 64 para hypo cos y raíces de 100 por 100 micras con una resolución de 64 por 64. Presione escanear para iniciar los experimentos, guarde la salida.

Comience abriendo el archivo de datos en el software de análisis de datos. A continuación, seleccione el procesamiento por lotes. Aplicar el mismo análisis a todas las curvas de un solo mapa.

Seleccione corregir la altura para el doblado del voladizo para extraer la profundidad de indentación. Seleccione la función de ajuste del módulo de Young. Eso supondrá que la fuerza es proporcional al área de indentación.

Establezca la forma de la punta en parabólica para suponer que la forma de la sangría es una parábola. Indica el radio de la punta. A continuación, seleccione la curva de retracción para el análisis.

Se prefiere la curva de retracción a la curva de tendencia x, ya que es menos sensible a la topografía. Establezca la relación poso en 0,5. Por último, presione en, analice y guarde la salida.

En todos los experimentos se muestran mapas modulares típicos de tallos florales de Marte, hipomidos jóvenes y viejos, y tallos de raíz MA, se muestran aquí. La dentadura es hemisférica, pero su radio difiere para que se puedan lograr diferentes resoluciones espaciales. Estos mapas muestran resultados típicos para dentaduras a escala meso a nanoescala con un radio de 50 nanómetros con indentaciones de profundidad de 50 nanómetros.

El cardiógrafo revela heterogeneidades a microescala en las paredes celulares superficiales de las células epidérmicas hipocodales. También se muestran los resultados típicos para dentaduras de mesoescala con un radio de 500 nanómetros con hendiduras de profundidad de 500 nanómetros para meristemo floral, hipo coddle y raíz. Este cardiógrafo para dentaduras a microescala con un radio de 2,5 micras con hendiduras de profundidad de 500 nanómetros reveló el ablandamiento del tejido durante la iniciación del órgano que precedió a cualquier crecimiento visible.

Sin embargo, este escaneo se abortó debido a que el rango en la altura de la muestra excedía el rango Z máximo del A FM. El movimiento de la muestra durante el experimento debido a una fijación incorrecta puede dar lugar a un escaneo borroso, como se muestra aquí. Las regiones que están cubiertas de agrotóxicos tampoco se pueden medir adecuadamente, como se ilustra en este ejemplo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente.