Name: Nanopodia - Proyecciones membrana delgada y frágil con papeles en Movimiento Celular y intercelulares Interacciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende a visualizar nanopodios en células endoteliales y cancerosas mediante inmunofluorescencia de TM4SF1. Este protocolo optimizado preserva estas estructuras frágiles para estudiar el movimiento celular y las interacciones intercelulares.

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Reconocemos el Dr. Harold Dvorak útil para los debates, incluyendo la sugerencia de probar la fijación en 37 ° C PFA. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención CA92644 P01 y por un contrato de la Fundación Nacional para la Investigación del Cáncer.

1. Cultivo de células en el disco de vidrio recubierto de colágeno <ol><li> Lugar discos de vidrio (12 mm de diámetro) en un frasco de vidrio (4 oz) y autoclave para esterilizar los discos. </li><li> Ponga etanol 25 ml de 70% en un tubo Falcon de 50 ml y colocarlo en una campana de cultivo celular. Esta solución puede ser reutilizado varias veces hasta que el nivel de la solución se reduce a 20 ml. </li><li> Coloque unas afiladas pinzas con un punto extra fino en el etanol al 70% durante 5 minutos antes de usarla para manejar el disco de vidrio. </li><li> Retire con cuidado la pinza del tubo y cerrar la tapa, a continuación, coloque suavemente la pinza de etanol tratada en la parte superior del tubo se seque al aire durante 2 min. No permita que la punta del fórceps tocar nada en la campana. </li><li> Utilice las pinzas estériles para agarrar uno de los discos de vidrio estéril del frasco de vidrio y lo coloca en un pozo de la placa de cultivo celular de 24 pocillos. Repita hasta que el número deseado de pozos se ha rellenado con los discos. </li><li> Ponga 500 l de solución de colágeno bovino (50 ng / ml) en cada pocillo que contiene un disco de vidrio y colocarlo en un 37 ° C, 5% de CO 2 de células cultura incubadora durante al menos 30 min. No hay ningún daño en una incubación más largo. </li><li> Harvest HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana) o PC3 (células de tumor de próstata) que ya se cultivan en 150 mm placa de cultivo celular mediante tripsinización y bloquean la actividad de la tripsina utilizando su medio de cultivo completo. Recoger las células en un tubo Falcon de 15 ml. </li><li> Contar el número de células y asegúrese de que la viabilidad es superior al 90%. </li><li> Sedimentar las células por centrifugación a 200 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Utilice el medio de cultivo para diluir las células a 10 5 células / ml. Coloque las células en hielo. </li><li> Aspirar el colágeno en la campana de cultivo de células y colocar suavemente 500 l de suspensión celular a cada pocillo en el que los discos de vidrio se recubrieron previamente con colágeno. 5 x 10 4 células / pocillo en la placa de 24 pocillos darán 60% confluency para HUVEC y 30% de confluencia para células PC3. Nota: añadir más suspensión de células de más alta densidad celular. </li><li> Cultura de las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, o de 24 horas para realizar un seguimiento de las actividades nanopodia y pase celular. Normalmente, las células se adherirán a la disco de vidrio en los primeros 30 minutos, y luego comienzan a polarizarse y migrar en la primera hora, y llevar a cabo las interacciones intercelulares y la división celular en las horas siguientes. </li></ol> 2. La fijación de la célula <ol><li> Cada pozo tendrá 500 l 4% PFA (paraformaldehído) para fijar las células. De cualquier fabricado comercialmente o recién hecho PFA al 4% puede ser utilizado. Calcular la cantidad de PFA necesario basado en el número de pozos preparados, y colocar PFA en un tubo Falcon de 15 ml. PRECAUCIÓN: paraformaldehído es un posible carcinógeno. </li><li> Coloque el tubo de halcón en un soporte de espuma de poliestireno que ya estaba en su lugar en un 37 ° C incubadora. Deje el tubo en la incubadora durante 30 min a la guerram hasta la PFA a 37 ° C. </li><li> Coloque una almohadilla térmica en la campana de cultivo y vuelva a encenderlo. </li><li> Saque la placa de cultivo celular de 24 pocillos y la PFA precalentado de la incubadora y colóquelo en la parte superior de la almohadilla. </li><li> Utilice una mano para aspirar el medio de un pozo, e inmediatamente después de usar la otra mano para deslizar suavemente 500 l PFA en el pozo a través del borde también. Para la aspiración más fácil, la inclinación de la placa de cultivo a aproximadamente 45 º, que se inclina contra el soporte de espuma de poliestireno de modo que es estable en ese ángulo. Esto facilitará la aspiración y la adición de solución de PFA al pozo sin molestar a las células en cultivo. Este es el paso más importante para preservar la estructura celular original de actividades celulares. </li><li> Repita el proceso hasta que todos los pozos con un disco de vidrio han recibido PFA. Nota: todos los pasos que hay que cambiar la solución pre-existente del pozo se aplicarán mismos procedimientos de aspiración. </li><li> Colocar la placa en 37 ° C durante 5 min. </li&gt; <li> Tome la placa posterior de la campana de cultivo y la inclinación en contra de espuma de poliestireno, como se describe en el paso 2.5. Utilice una mano para transferir suavemente la PFA desde el pozo en un tubo de recogida; utilizar la otra mano para colocar inmediatamente después de al menos 500 l temperatura de PBS habitación en el pozo. Después de todos los pozos se han lavado, volver y repetir el lavado PBS una vez más en todos los pozos. Vacíe la PFA recogido en un contenedor de residuos peligrosos. </li><li> Prepare el tampón de bloqueo ICC mediante la adición de 2% de suero bovino fetal al PBS. Azida de sodio 0,04% (diluir de 20% solución de reserva) se añade como conservante. ATENCIÓN: La azida de sodio es un compuesto tóxico. El tampón puede ser almacenado en 4 ° C durante un largo período de tiempo sin la contaminación bacteriana. </li><li> Con la placa de cultivo todavía inclinado en contra de un stand, una vez más, pasar por cada pozo de aspiración para eliminar PBS e inmediatamente después de añadir 500 l de tampón de bloqueo de la CPI. Las células están listas para la tinción de inmunofluorescencia. Si es necesario, lacélulas fijadas se pueden almacenar en un refrigerador a 4 º C durante una semana sin pérdida significativa de proteína TM4SF1. </li></ol> 3. TM4SF1 Inmunofluorescencia La tinción de Nanopodia <ol><li> En cada pocillo, reemplace el amortiguador de bloqueo 500 l ICC con un nuevo tampón de bloqueo que contenía 0,01% de Triton X-100 y se deja reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. No utilice más alta que 0,03% de Triton X-100 ya que eliminará TM4SF1 de las membranas celulares. PBS lavó las células de la etapa 2.10 puede ser movido directamente al tampón de bloqueo que contenía Triton si la tinción está listo para ser empezar de inmediato. </li><li> Diluir el anticuerpo primario anti-TM4SF1 (o anti-CD9) a 0,5 g / ml en tampón de bloqueo CPI. </li><li> En cada pozo, eliminar el tampón Triton ICC/0.01% y reemplazarlo con 300 l de la solución anti-TM4SF1-anticuerpo. Incubar 2 horas a temperatura ambiente o dejar toda la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar cada pocillo con no menos de 500 l de PBS. Repita 3 veces; cada vez que dan en least 5 min de tiempo de incubación. </li><li> Preparar una solución de anticuerpo y faloidina secundaria en CPI tampón de bloqueo, utilizando una dilución de 1000 veces de Alexa 488 anticuerpo secundario de burro anti-ratón marcado (/ ml de concentración final 2 g) y 1000 x dilución de faloidina (50 ng / ml de concentración final). </li><li> Retire PBS y añadir 300 l de la solución de anticuerpo secundario y phalloidin a cada pocillo y se incuba durante 2 horas o deja toda la noche a 4 ° C. </li><li> Repita los pasos de lavado PBS con al menos una incubación de 5 min por lavado. En el último lavado, deje cada pocillo en PBS durante 1 hora. </li><li> Caída de una sola gota (~ 10 l) de montaje anti-fade medios en un portaobjetos de vidrio. </li><li> Doble la punta de un 19 G 1 ½ en jeringa de aguja 90 ° presionando suavemente sobre una superficie dura. Utilice una mano para sostener la aguja doblada y suavemente levante un disco de vidrio del pozo, y con la otra mano para agarrar el disco con las pinzas cortantes. </li><li> Gire el disco y vidrio# 160; boca abajo dejando que el contacto con las células del medio de montaje en la placa de vidrio. Coloque con cuidado el disco de vidrio y deje que se seque durante la noche en un lugar oscuro a temperatura ambiente. </li><li> Proceder a la imagen de la inmunofluorescencia manchado nanopodia o almacenar las diapositivas de una caja de portaobjetos a -20 ° C. Las diapositivas permanecerán visibles durante unos meses en -20 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li>
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<li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD13+%28aminopeptidase+N%29+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Nanopodia son canales de la membrana celular delgadas que se adhieren firmemente a la matriz a través de TMED y pueden extenderse a más de 100 m de una célula móvil polarizada para detectar el medio ambiente y mediar en las interacciones intercelulares 2,3. Nanopodia adherirse a la matriz tan firmemente que los residuos se quedan atrás ya que los celulares se aleja (Figuras 1 y 2). Así Nanopodia permite el estudio de cómo las células perciben su entorno y determinar la trayec...

Durante la polarización para el movimiento, las células animales se extienden una variedad de salientes, de membrana dinámicos de sus superficies, incluyendo filopodios, lamelipodios, fibras de retracción, y volantes 1. Recientemente añadido a esta lista fueron nanopodia, un tipo recién reconocido de fina (100-300 m de diámetro), alargadas (hasta 50-100 m de largo) de proyección de la membrana que proporcionan los canales de membrana para la extensión de las estructuras de actina F, como filopodios y retracción de la fibra, y que la mancha positivamente con TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) en endoteliales y tumorales células cultivadas 2,3. TM4SF1 es una proteína con topología de tetraspanin como que se conocía originalmente como un antígeno de célula tumoral 4 antes de que el descubrimiento de que la molécula es un biomarcador de células endoteliales que desempeña un papel esencial en la proliferación celular endotelial y la migración 2,3. La tinción de inmunofluorescencia reveló que TM4SF1 se localiza en perinucLear y vesículas a la membrana plasmática, y se enriquece en TM 4SF1 e nriched omains d micro (TMED). TMED nanopodia anclaje a la matriz y el presente en un patrón de bandas espaciadas regularmente de 1-3 longitud TMED / m de nanopodia. Nanopodia típicamente se extienden desde delante líder de una célula y de salida trasera durante la polarización de las células para el movimiento. Debido a la naturaleza adherente firme de TMED, nanopodia son incapaces de retraer de nuevo en la celda de medida que se aleja; por tanto, los residuos abandonados nanopodia trazan la trayectoria de movimiento celular. Nanopodia proporcionar canales de membrana para la extensión F-actina y la retracción, y son los sitios de las interacciones intercelulares y comunicaciones 2,3. Estas características hacen que nanopodia proporcionan una oportunidad única para estudiar los mecanismos subyacentes conjunto de F-actina durante la polarización celular, la detección celular del medio ambiente, la determinación de la ruta de acceso y la dirección de movimiento de la célula, y las interacciones intercelulares unND comunicaciones. Debido a la naturaleza altamente hidrofóbica de TMED y la naturaleza membranosa delgada y frágil de nanopodia, especial cuidado debe tomarse con el fin de preservar la TMED y nanopodia. La destrucción de nanopodia y remoción de TMED por métodos comunes de laboratorio es una posible razón por la que sólo sesenta y tres publicaciones han aparecido en TM4SF1 desde su primer descubrimiento en 1986 1 y por la falta total de conocimiento de enriquecimiento TM4SF1 en 100-300 micras microdominios en la superficie de la célula hasta que el informe de TM4SF1 en las células endoteliales en 2009 2. Métodos de inmunotinción convencionales suelen utilizar disolventes orgánicos como etanol, metanol, o acetona para fijar las células y el uso de 0,1% o mayor concentración de Triton X-100 para permeabilizar las células 5. Los estudios aquí descritos implementaron tres grandes cambios con el método convencional para revelar TMED y nanopodia: (i) utilizan 37 ° C 4% PFA y fijar las células en un 3776; incubadora, (ii) aplicar el lavado de PBS temperatura ambiente suave, y (iii) el uso de menos de 0,03% de Triton X-100 sólo brevemente para permeabilizar las células antes de la adición de anticuerpo primario, como X-100 mayor que 0,03% extraerá Tritón TM4SF1. Todos los tetraspanins forman microdominios en la membrana de la célula 6 y algunos colocalize con TMED en endoteliales y células tumorales 2,3. Como tetraspanins como CD9, CD81, CD151 y se expresan de manera ubicua, el protocolo de tinción descrito aquí se puede extender a muchos tipos diferentes de células que carecen de TM4SF1 para los estudios de la función nanopodia.

<table><tbody><tr><td>Discos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td> Tarro de vidrio de <td>12 mm de diámetro</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Certified Clean Clear Glass Frascos de lados rectos, 4 oz</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio liso Fisherfinest Premium</td></tr><tr><td>50 ml Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Tubo centrífugo cónico de polipropileno de alta claridad de 50 ml, clasificación de 16.000 rcf. Estéril.</td></tr><tr><td>Tubo Falcon de 15 ml con gradilla de espuma de poliestireno</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP Tubos de centrífuga</td></tr><tr><td>Pinzas afiladas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Pinzas de disección de astillas puntiagudas extrafinas</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>de 24 pocillos Placa de cultivo celular</td></tr><tr>de<td>150 mm BD</td><td>Bioscience</td><td>353025</td><td>placa de cultivo celular de 150 mm</td></tr><tr><td>19 G 1 y frac12; Aguja de jeringa</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 & frac12;</td></tr><tr><td>Laboratorios</td><td>de Etanol Decon, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon's Pure Ethanol 200 Proof Solución de</td></tr><tr><td>colágeno</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Colágeno I, Alta Concentración, cola de rata, 100 mg</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0.25% Tripsina-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM alta glucosa (1x), líquida, con L-glutamina, sin piruvato de sodio</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Solución, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehído)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% en PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Suero Fetal Bovino</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Medio Basal 500 ml y EGM-2 SingleQuot Kit Suplemento & Factores</td></tr><tr><td>de crecimiento Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Solubilizado en agua. 4% de solución madre y concentración de trabajo es 0.4%.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-humano TM4SF1 para ratones&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MAB3127</td><td>Epitope se encuentra en el dominio extracelular</td></tr><tr><td>Ratón anti-anticuerpo CD9 humano &nbsp;</td>El epítopo <td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>se encuentra en el dominio extracelular</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H + L)</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Phalloidin conjugada con rodamina</td></tr><tr><td>Medios de montaje anti-decoloración&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>ProLong Gold Reactivo antidecoloración con DAPI</td></tr><tr><td>70% de etanol &nbsp;</td><td></td><td></td><td>17,5 ml de etanol (200 grados) 7,5 ml de agua de doble desionización</td></tr><tr><td>10x PBS (hacer 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml de 10x PBS 180 ml de agua de doble desionización</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (hacer 20 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml de Triton X-100 16 ml de agua de doble desionización</td></tr><tr><td>4% NaN3 (rinde 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g de NaN3 25 ml de agua doblemente desionizada</td></tr><tr><td>50 ng/ml Solución de colágeno bovino en PBS (haga 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Solución madre de 50 &mu; g/ml (50 ml) 830 &mu; l de colágeno I (3 mg) 50 ml PBS</td></tr><tr><td>Tampón bloqueante ICC (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS 2% FBS (añadir 1 ml) 0,04% NaN3 (añadir 100 &mu; l de 4% NaN3)</td></tr><tr><td>Tampón de bloqueo ICC/0.01% Triton X-100 (haga 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml de tampón de bloqueo ICC 25 &mu; l de 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">www.lonza.com</a></td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org</a></td></tr><tr><td>Campana de cultivo celular</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Serie 60) Cabina de seguridad biológica&nbsp;</td></tr><tr><td>37 y s&deg; C, 5% CO2 Incubadora de cultivos celulares&nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO2</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica para incubadora con camisa de agua&nbsp;</td><td>K& H Fabricación</td><td>1020</td><td>K& H Lectro Almohadilla térmica para jaula con cubierta de vellón libre (<a href="http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y">www.amazon.com</a>)</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Hemocitómetro centrífugo de sobremesa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Hemocitómetro Bright-Line</td></tr></tbody></table>

nanopodia - proyecciones membrana delgada y frágil con papeles en movimiento celular y intercelulares interacciones

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Las células adherentes en cultivo mantienen un estado polarizado para apoyar el movimiento y las interacciones intercelulares. Nanopodia son delgadas, alargadas, en gran parte proyecciones de membrana F-actina negativos en las células endoteliales y de cáncer que se pueden visualizar a través TM4SF1 (transmembrana-4-L-seis-familia-1) la tinción de inmunofluorescencia. Racimos TM4SF1 en 100-300 micras de diámetro TMED (TM 4SF1 e nriched micro omains d) que contiene 3 a un máximo de 14 TM4SF1 moléculas individuales. TMED están dispuestas intermitentemente a lo largo nanopodia con una separación regular de 1 a 3 TMED por μ m y anclar firmemente nanopodia a la matriz. Esto permite nanopodia extender más de 100 μ m de la parte delantera o trasera que conduce trasera del endoteliales tumorales o células polarizadas, y hace que los residuos de la membrana a quedar atrás en matrIX cuando la célula se aleja. TMED y nanopodia han pasado por alto debido a su extrema fragilidad y sensibilidad a la temperatura. Lavado de rutina y fijación interrumpen la estructura. Nanopodia se conservan por fijación directa en paraformaldehído (PFA) a 37 ° C, seguido por una breve exposición a 0,01% de Triton X-100 antes de la tinción. Nanopodia abrir nuevas perspectivas en la biología celular: prometen a remodelar nuestra comprensión de cómo las células perciben su entorno, detectar e identificar otras células a distancia, iniciar interacciones intercelulares en estrecho contacto, y de los mecanismos de señalización que participan en el movimiento, la proliferación celular y la comunicaciones en células. Los métodos que se desarrollan para el estudio nanopodia derivados de TM4SF1 pueden ser útiles para los estudios de nanopodia que se forman en otros tipos de células a través de la agencia de tetraspanins clásicos, especialmente el CD9 expresión ubicua, CD81, CD151 y.

Para el Paso 1: Si las células (como HUVEC y PC3 utilizado en este estudio) son capaces de crecer normalmente, las células se unen al disco revestido con colágeno dentro de 30 minutos después de que se siembran, se polarizan y se convierten en móvil poco después, y se extienden nanopodia por delante de su camino de movimiento. Figuras 1A y 1B, respectivamente, muestran un polarizada y la proliferación de HUVEC. Figura 2A muestra células PC3 pol...

Nanopodia son los canales de membrana delgada pero frágiles que se extienden hasta 100 micras de los principales delantero o trasero trasero de una célula y perciben el entorno celular. La fijación directa a 37 ° C, lavado suave, y la evitación de disolventes orgánicos como etanol, metanol, o acetona y de mayores Triton X-100 concentraciones están obligados a observar estas estructuras celulares.

Nanopodia - Proyecciones membrana delgada y frágil con papeles en Movimiento Celular y intercelulares Interacciones

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar nano podios a través de la tinción inmunofluorescente en células cultivadas. In vitro. Esto se logra cultivando primero las células de interés en discos de vidrio recubiertos de colágeno.En el segundo paso, las células se fijan al disco con PFA caliente, a continuación, las células se lavan y luego se incuban en tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente. En el paso final, las células se tiñen con anticuerpos contra TM 4, SF 1 y se montan en un portaobjetos de vidrio. En última instancia, la presencia de extensiones de nano podios en células móviles que proliferan o interactúan puede visualizarse mediante microscopía de inmunofluorescencia.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia y el diagnóstico de los cánceres humanos, ya que el movimiento de proliferación de las células endot y las células tumorales y las interacciones intercelulares son procesos clave involucrados en la angiogénesis y el crecimiento de las células tumorales. La demostración del procedimiento será de dos magros, un postdoctorado de un laboratorio Comience esterilizando en autoclave discos de vidrio de 12 milímetros en un frasco de vidrio de cuatro onzas mientras se esterilizan los discos. Coloque un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de etanol al 70% en una campana de cultivo celular.Coloque una pinza afilada con una punta extra fina en el etanol durante cinco minutos, y luego retire con cuidado las pinzas y tape el tubo, colocando las pinzas encima del tubo para que se sequen al aire durante dos minutos. Cuando las pinzas estén secas, coloque un disco de vidrio estéril por pocillo en uno de cada uno de los pocillos deseados de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Luego cubra cada disco con 500 microlitros de solución de colágeno bovino y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos.Mientras los discos se incuban, gotea y observa las células de interés, deteniendo la reacción con medios de cultivo completos. Cuando las células se hayan desprendido, recoja las células flotantes en un tubo Falcon de 15 mililitros y luego cuéntelas después de confirmar que su viabilidad es superior al 90%Granule las células durante 10 minutos a 200 G y cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y luego diluya las células a una vez 10 a la quinta célula por mililitro en medios de cultivo celular, y coloque las células en hielo.Ahora aspire la solución de colágeno de cada pocillo en la campana de cultivo celular y luego dispense suavemente 500 microlitros de las células en cada cultivo de disco recubierto de colágeno. Las células durante la cantidad de tiempo adecuada para rastrear las actividades de los nano podios y el paso de las células. Por lo general, las células se unirán al disco de vidrio en los primeros 30 minutos, comenzarán a polarizarse y migrar en la primera hora, y realizarán interacciones intercelulares y división celular en las horas siguientes para fijar las células primero en calentar lo suficiente el PFA para todos los discos en una incubadora a 37 grados Celsius durante 30 minutos.A continuación, coloque una almohadilla térmica en la campana de cultivo. Enciéndalo y luego coloque el PFA precalentado encima de la almohadilla térmica. La adición de PFA a los discos es el paso más crucial para preservar la estructura celular original de las actividades celulares para facilitar la eliminación del medio de cultivo y la adición del PFA sin perturbar las células en cultivo, coloque la placa a unos 45 grados, apoyándola contra un soporte de espuma de poliestireno para que sea estable en el ángulo Con una mano.A continuación, aspire el medio de cada pocillo y luego use inmediatamente la otra mano para deslizar 500 microlitros de PFA en cada pocillo a través del borde del pocillo e incube los discos durante otros cinco minutos. A continuación, retire el PFA como se acaba de demostrar para los medios de cultivo celular, dispensando el PFA usado en un tubo de recolección con una mano e inmediatamente reemplazando el PFA con 500 microlitros de PBS a temperatura ambiente con la otra después de que los pocillos se hayan lavado dos veces con PBS, retire el lavado final de PBS como se acaba de demostrar y agregue 500 microlitros de tampón de bloqueo de inmunoquímica a cada disco. Para visualizar los nano podios mediante microscopía de fluorescencia, primero reemplace el tampón de bloqueo de inmunocitoquímica en cada pocillo con un tampón de bloqueo de 0.01% tritton X 100 a temperatura ambiente durante una hora.A continuación, sustituya el tampón de bloqueo de tritton por 300 microlitros de solución de anticuerpo anti TM four SF one recién diluida durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, lave cada disco tres veces con PBS como se acaba de demostrar, dejando el PBS en los discos durante cinco minutos durante cada lavado después del último lavado. Incubar cada pocillo con 300 microlitros de anticuerpo secundario recién diluido y solución de Phin e incubar los discos durante otras dos horas a temperatura ambiente.Ahora lave los discos tres veces más, dejando el lavado final de PBS en los pocillos durante una hora. Luego, en una sola gota de 10 microlitros de medios de montaje Antifa en un portaobjetos de vidrio para cada disco. A continuación, doble suavemente la punta de una aguja de jeringa de una pulgada y media de calibre 19 90 grados sobre una superficie dura.Luego, sosteniendo la aguja con una mano, levante suavemente el disco de vidrio uno por uno con pinzas afiladas para agarrar el disco con la otra mano. Coloque cada disco de vidrio boca abajo sobre el medio de montaje en los portaobjetos de vidrio y, a continuación, coloque con cuidado los portaobjetos en un lugar oscuro a temperatura ambiente para que se sequen durante la noche. A continuación, los nanopodios teñidos pueden ser fotografiados o almacenados en una caja de portaobjetos a menos 20 grados centígrados.Normalmente, las células en crecimiento se adhieren a los discos recubiertos de colágeno dentro de los 30 minutos posteriores a la sentación, se polarizan y se vuelven móviles poco después de extender los nanopodios por delante de su trayectoria de movimiento. Como se demuestra en estas imágenes, los individuos aislados H-U-V-E-C generalmente mostrarán una morfología claramente polarizada con proyecciones de f actina en la periferia de la célula incrustadas dentro de los nano podios PC, tres células mostrarán una morfología polarizada con sus nano podios revelando la trayectoria del movimiento de tres células PC. Si las células están en el estado de división celular, como se ve aquí en un H-U-V-E-C en división, los nano podios se adhieren firmemente a la matriz a través de TM E y permiten que la actina F se extienda o se retraiga dentro de los nano podios.Las interacciones intercelulares que conducen a la formación de uniones celulares también se observan comúnmente a través de nano podios, temperaturas subóptimas como se muestra en estos ejemplos, el uso de cuatro grados Celsius, la fijación de PFA y el lavado frío de PBS perturbarán y destruirán la estructura de los nanopodios en las células polarizadas. En las células proliferativas frías de PFA y PBS frías carecerán de podios y, por lo tanto, se observará la retracción de la fractina dentro de los nanopodos. Y los espacios en las uniones intercelulares se producirán artificialmente como nano podios son proyecciones de membrana delgadas y largas que se unen a la matriz extracelular a través de un equipo.Es probable que la intensidad combinada deba mejorarse a través de las funciones de brillo y contraste en el software de procesamiento de imágenes para revelar la trayectoria del movimiento celular a través de los residuos de nanopodia. Como se hizo en el recuadro de esta imagen aquí, en esta imagen se muestran H-U-V-E-C que se cultivaron durante seis horas después de la siembra con una fluidez de 60% de carbono en un disco de vidrio recubierto de colágeno, y luego se fijaron a 37 grados Celsius, 4% de PFA como se acaba de demostrar. Los nano podios se revelaron con el anticuerpo anti CD nueve y la actina F se tiñó con Phin, lo que demuestra que el CD nueve también se localiza en los nano podos.Siguiendo el procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo en la sangre occidental, para responder a preguntas adicionales como, ¿cómo influyen ciertos tratamientos en los niveles de expresión de TM cuatro SF one y, por lo tanto, afectan el movimiento celular, la proliferación y las interacciones intracelulares? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el sostenimiento inmunocongelado para estudiar el papel de los nanopodios en el movimiento celular y las interacciones intercelulares.

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Investigación

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Biología

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Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.

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