Name: Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a preparar hidrogeles de poliacrilamida reticulados con ADN para estudiar la rigidez tisular y su efecto en la función celular. Este método permite modular dinámicamente las propiedades mecánicas del sustrato.

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Los autores desean agradecer a: Dr. Frank Jiang, Dr. David Lin, el Dr. Bernard Yurke y el Dr. Uday Chippada por sus contribuciones en el desarrollo de la tecnología de gel de ADN; Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter por sus comentarios y ediciones de este manuscrito; fuentes de financiación, incluida la Comisión de Nueva Jersey en la médula espinal de Investigación (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) y Nueva Jersey Instituto de Neurociencias (MLP); y editores de Ingeniería de Tejidos, Parte A para la autorización de reimprimir las figuras 2 y 4 y Biomateriales permiso para reimprimir la figura 3.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La capacidad de los geles de ADN para suavizar o endurecer antes y después de la adhesión celular las hace un modelo ideal para estudiar el papel de la rigidez del tejido dinámico en función de la célula. Todos los tres diseños se han utilizado en estudios mecánicos y biológicos. Sin embargo, los tres diseños tienen elasticidades similares en diversos porcentajes de reticulación, lo que indica la longitud de reticulación no influye elasticidad del gel de ADN (Tabla 2). En contraste, la concentración de ...

Sustratos estáticos y dinámicos son dos categorías de biomateriales que se desarrollaron para estudiar los efectos de la elasticidad de los tejidos o rigidez en la función celular. Sustratos estáticas son incapaces de cambiar sus propiedades físicas después de que se fabrican y / o una vez se siembran las células. Poliacrilamida (PA) geles fueron los primeros sustratos bidimensionales estáticas, que se sintetizaron las investigaciones mecanobiología 5,17. Geles de PA son fáciles de preparar, de bajo costo, versátil, y puede ser fabricado con una amplia gama de módulos elásticos. Aunque estas ventajas técnicas hacen PA geles un sustrato general aplicada, sustratos estáticas no son indicativos de la naturaleza dinámica de la matriz extracelular (MEC) y que rodea entorno celular in vivo. Por ejemplo, el ECM sufre alteraciones de rigidez como resultado de una lesión, el desarrollo, o la enfermedad. Por lo tanto sustratos dinámicos son favorecidos como los modelos de sustrato que imitan los tejidos en los estudios mecanobiología <sup&gt; 22,24,25. Numerosos sintética, bidimensional biomateriales, tridimensionales, estáticas y dinámicas naturales se han desarrollado para imitar la rigidez del tejido 1,3,6,16,23,26. Algunos sustratos dinámicos requieren calor, UV, la corriente eléctrica, los iones, y los cambios de pH para alterar sus propiedades mecánicas 2,4,7,8,12,15,16, pero estos estímulos pueden restringir bio-aplicación del hidrogel. Hidrogeles de poliacrilamida reticulada de ADN-ADN (geles) son sustratos elásticos bidimensionales dinámicos. Entrecruzamientos de ADN permiten la modulación temporal, espacial, y reversible de la rigidez en gel de ADN mediante la adición de ADN de cadena sencilla (ssDNA) a los medios o tampón 9-11,13,14,18,21. A diferencia de los geles dinámicas mencionadas anteriormente donde se aplican los estímulos para la modulación de elasticidad, los geles de ADN se basan en la difusión de ssDNA aplicada para la alteración de la elasticidad. Por lo tanto, la superficie del gel superior, donde se cultivan las células, es la primera área modulada porque el o tasamodulación f elasticidad es dependiente del espesor de gel. Geles de ADN son similares a sus homólogos de gel de PA en que tienen un esqueleto de poliacrilamida, sin embargo, las reticulaciones-bis acrilamida se reemplazan con reticulaciones compuestas de ADN (Figura 1). Dos ssDNAs (SA1 y SA2) se hibridan con una cadena reticulante (L2) para compensar los entrecruzamientos de ADN del gel. SA1 y SA2 tienen secuencias distintas que ambos contienen una modificación Acrydite en el extremo 5 &#39;para su incorporación efectiva a la red PA. Para la preparación de los geles, SA1 y SA2 se polimerizan individualmente en una cadena principal de PA y, posteriormente, el SA1 SA2 polimerizado y se mezclan juntos. L2, el agente de reticulación, se añade a la SA1 y SA2 mezcla. La secuencia de bases es complementaria a L2 ambas secuencias SA1 y SA2 y L2 se hibrida con SA1 SA2 más para formar los entrecruzamientos de ADN. , Elasticidad del gel de ADN inicial es determinado por ambas concentraciones L2 y reticulación (Tablas 1 </strong&gt; y 2). Geles de ADN que contienen cantidades estequiométricas iguales de L2, SA1, SA2 y son los geles más rígidas porque SA1 y SA2 son 100% reticulado por L2 (designado como 100% geles). Concentraciones más bajas de L2 resultado en un menor porcentaje de reticulación del ADN y, por tanto, geles más blandos de ADN. Geles tan bajas como 50% reticulado (designado como 50% en geles) se han construido 9-11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> Figura 1. reticulación de gel de ADN y uncrosslinking esquemática 9-11,13,14,18,21 Paso 1:. SA1 (rojo) y SA2 (azul) se polimerizan de forma individual en una columna vertebral de poliacrilamida (negro). Después de la polimerización, soluciones polimerizadas SA1 y SA2 se mezclan juntos. Paso 2: L2 (verde) se añade y se hibrida con SA1 SA2 más para formar los entrecruzamientos del gel. Paso 3: R2 hibrida con tél punto de apoyo de la L2. Paso 4: hibridación de punto de apoyo de R2 impulsa la descompresión de la L2 de SA1 y SA2. A diferencia de los geles de PA, geles de ADN pueden endurecerse y suavizar después de la síntesis. Por esa razón, las células cultivadas en geles de ADN pueden ser sometidos a alteraciones de rigidez dinámica. Para endurecer geles de células adherente, L2 puede ser añadido al medio de cultivo de los geles porcentuales bajos para aumentar el porcentaje de reticulaciones. Para suavizar los geles de células adherente, L2 se puede quitar para disminuir el porcentaje de entrecruzamientos 10,13,21. L2 tiene una secuencia de punto de apoyo adicional en el extremo 3 &#39;para permitir L2 para uncrosslink de SA1 y SA2 (Tabla 1). La eliminación de L2 se lleva a cabo mediante hibridación de una hebra de reversión llamado R2. R2 es complementaria a la longitud completa de L2 y se hibrida primero con el punto de apoyo L2. Hibridación propulsa el punto de apoyo de descompresión de L2 de SA1 y SA2, que elimina la reticulación y reduce la rigidez de gel. En el presente informe yvideo, paso a paso las instrucciones se proporcionan para la preparación de rigidización y suavizar los geles de ADN. Si bien se describen preparaciones de gel 100% y 80%, este protocolo se puede adaptar para crear geles de ADN de otros porcentajes reticulados inicial y final. En general, 100% y 80% en geles se preparan, inmovilizan sobre cubreobjetos de vidrio, funcionalizados, y se sembraron con células. L2 se añade a los medios de 80% de geles y R2 se añade a los medios de comunicación de 100% geles, 48 ​​hr después de la siembra. La adición de L2 a los medios endurece 80% a 100% geles reticulados, mientras que la adición de R2 a los medios suaviza 100% en geles de 80% reticulado. Geles endurecidas se designan como 80 → 100% geles y geles ablandados se designan como 100 → 80% de geles en el texto. Para controlar o geles estáticas, ssDNA que consiste en Ts o Como se entrega a otro conjunto de 100% y 80% en geles. Después de un mínimo de dos días siguientes modulación de elasticidad, las células pueden ser procesados ​​y analizados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Entrecruzamiento de ADN </td><td rowspan="2"> # De bases </td><td> Secuencia (punto de apoyo) </td><td rowspan="2"> Modificación </td><td rowspan="2"> Temperatura de fusión (T m, ° C) </td><td rowspan="2"> Comentarios </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Diseño 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 34.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 23.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC T CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Una secuencia de 10 pb punto de apoyo está incluido. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 es complementaria a L2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Diseño 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 46.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC A GTC CTA TGC CAC T GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> A 12 pb secuencia de punto de apoyo está incluido. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2 es complementaria a L2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &#39;Acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG T ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> Punto de apoyo no está incluido. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Control de </td><td rowspan="2"> Control de </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (etc.) o </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (etc.) </td></tr></tbody></table> Cuadro 1 secuencias de base para ssDNA 9-11,13,14,18,21. Celular y estudios mecánicos han utilizados varios ddiseños de reticulación ifferent para generar geles de ADN con una gama de propiedades mecánicas estáticas y dinámicas. Los parámetros modulados en el diseño de reticulación son secuencia de bases y longitud de la secuencia o la longitud de reticulación. Negrita y cursiva ilustran base de sincronización entre SA1 y L2 y entre SA2 y L2, respectivamente. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Diseño </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Concentración de acrilamida (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 SA2 más hibridado con L2 (% reticulado) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Elasticidad (kPa, media ± SEM) </td><td> 6,6 ± 0,6 </td><td> 17,1 ± 0,8 </td><td> 29,8 ± 2,5 </td><td> 5,85 ± 0,62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25,2 ± 0,5 </td><td> 10,4 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. módulo de Young (E) de geles de ADN. 9-11,13,14,18,21 concentración de acrilamida, el porcentaje de reticulación, y la longitud de reticulación puede ser modulada en geles de ADN. Diseños 1, 2 y 3 tienen 20, 28, y 40 pb longitudes de reticulación, respectivamente. 100% de geles para todos los diseños tienen módulos similares, indicando la longitud de reticulación no afecta a la elasticidad del gel. Sin embargo, las variaciones en la concentración de acrilamida alteran elasticidad del gel del ADN.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>No vórtice ssDNA. Invierta suavemente el vial y/o la solución de pipeta para mezclar.</td></tr><tr><td>PBS con calcio y magnesio</td><td></td><td></td><td>de cualquier marca.</td></tr><tr><td>100x Tampón Tris-EDTA (tampón TE</td><td>)Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón Tris-Borato-EDTA (tampón TBE)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE es una toxina reproductiva.</td></tr><tr><td>Solución de acrilamida al 40%</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>BP14021</td><td>La acrilamida es una toxina.</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>Prepare una solución al 2% en tampón TE. El APS es una toxina e irritante.</td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>Prepare una solución al 20% en tampón TE. TEMED es inflamable, corrosivo y tóxico.</td></tr><tr><td>Cubertor redondo de 12 mm de diámetro</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Norland adhesivo óptico 72</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td><td></td> de cultivo de tejidos de 24 pocillos <td>Cualquier marca.</td></tr><tr>Tubos de <td></td><td></td><td>microcentrífuga</td><td>de cualquier marca.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem o Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com o thermofisher.com</td><td>C111 o 22589</td><td>Prepare una solución de 0,315 mg/ml en agua inmediatamente antes de usar. Disolver a 37 &deg; C y filtro de esterilización. Es normal observar sulfo-SANPAH no disuelto en el filtro. Sulfo-SANPAH es sensible a la luz y, por lo tanto, la solución debe protegerse de la luz hasta la exposición a los rayos UV.</td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>Prepare una solución de 0,2 mg/ml en agua y filtre la esterilización.</td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>Prepare una solución de 0,2 mg/ml en ácido acético 0,2 N. La solución debe permanecer fría en todo momento para evitar la polimerización. El ácido acético es inflamable, tóxico y corrosivo.</td></tr><tr><td>22 x 60 cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de desplazamiento positivo</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Fuente</td><td></td><td></td> de luz UV <td>Coloque los geles lo más cerca posible de la luz UV. La luz ultravioleta puede causar lesiones en la piel o los ojos.</td></tr><tr><td>Termómetro:</td><td></td><td></td><td>Cualquier marca.</td></tr><tr><td>Gas nitrógeno</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td> <td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de adn-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mecanobiología es un área científica emergente que aborda el papel fundamental de las señales físicas en la dirección de la morfología y la función celular. Por ejemplo, el efecto de la elasticidad de los tejidos en función de la célula es un área importante de la investigación mecanobiología porque la rigidez del tejido modula con la enfermedad, el desarrollo, y las lesiones. Materiales estáticos que imitan tejidos o materiales que no pueden alterar la rigidez una vez que se siembran las células, se utilizan principalmente para investigar los efectos de la rigidez del tejido en las funciones celulares. Si bien la información obtenida de los estudios estáticos es valiosa, estos estudios no son indicativos de la naturaleza dinámica del microambiente celular in vivo. Para abordar mejor los efectos de la rigidez dinámica en función de la célula, se desarrolló un sistema de hidrogel de poliacrilamida ADN reticulado (geles de ADN). A diferencia de otros sustratos dinámicos, geles de ADN tienen la capacidad de aumentar o disminuir la rigidez después de la fabricación y sin estímulos. Geles de ADN consisten en ADN crossltintas que se polimerizan en un esqueleto de poliacrilamida. Adición y eliminación de enlaces cruzados a través de la entrega de ADN de cadena sencilla permite temporal, espacial y de control reversible de la elasticidad del gel. Hemos demostrado en los informes anteriores que la modulación dinámica de la elasticidad del gel del ADN influye en el comportamiento de fibroblastos y la neurona. En el presente informe y el vídeo, ofrecemos un esquema que describe los mecanismos de reticulación de gel de ADN y las instrucciones paso a paso sobre los geles de ADN preparación.

Antes de nuestros estudios, se observaron las interacciones célula-ECM en biomateriales compatibles estáticas o en sustratos dinámicos irreversibles y unidireccionales. Estos sustratos no reflejan con exactitud la naturaleza dinámica del microambiente celular. Nuestro trabajo cambia los paradigmas técnicos existentes al proporcionar un modelo más fisiológico para el estudio de las interacciones célula-ECM de ablandamiento y endurecimiento biomateriales dinámicos. En estudios anteriores, se analizaron los efectos de sust...

Nuestro laboratorio ha desarrollado hidrogeles de poliacrilamida de ADN-reticulada, un sistema dinámico de hidrogel, para entender mejor los efectos de la modulación de la rigidez del tejido en función de la célula. Aquí, ofrecemos esquemas, descripciones y protocolos para preparar estos hidrogeles.

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar hidrogeles de poliacrilamida entrecruzados con ADN que puedan endurecerse o ablandarse mediante la pipetación de ADNs de cadena sencilla en el medio de cultivo después de sembrar las células sobre ellos. Esto se logra primero reconstituyendo las soluciones liofilizadas de SA uno, SA dos L dos R dos y los ADNs de cadena sencilla de control en tampón y polimerizando individualmente las soluciones de SA uno y SA dos en un armazón de poliacrilamida. El segundo paso consiste en mezclar las soluciones polimerizadas de SA uno y SA dos con la solución de L dos para formar el gel de ADN.A continuación, la solución de gel de ADN se inmoviliza sobre laminillas de vidrio con adhesivo óptico. El paso final consiste en funcionalizar los geles tratándolos con sul sampa y luego con PDL. Finalmente, se siembran células sobre los geles de ADN y la elasticidad del gel se modula mediante la adición de R dos L dos o ADN monocatenario de control para ablandar, endurecer o no cambiar la elasticidad del gel, respectivamente.Los resultados de estos experimentos muestran que la naturaleza dinámica del sustrato subyacente dirige el comportamiento celular. La ventaja de utilizar esta técnica frente a otros métodos, como CROs, lingo, hidrogeles de bolas, es que los geles de ADN no requieren un estímulo como la luz UV para modular su elasticidad. En cambio, los geles de ADN se endurecen y ablandan mediante la difusión de L dos o R dos, ADN de cadena sencilla, a través del gel, respectivamente. Primero, centrifugue el ADN de cadena sencilla SA uno liofilizado a 2000 ×g durante 15 segundos para asegurar que todo el ADN de cadena sencilla se encuentre en el fondo del tubo.Después de la centrifugación, prepare tres milimolares de solución de SA uno agregando 107 microlitros de tampón tris, EDTA o TE 1x al tubo. Caliente el tampón NTE de SA uno a 70 grados Celsius durante cinco minutos o hasta que el precipitado de ADN de cadena sencilla se disuelva completamente. A continuación, prepare la solución polimerizada de SA uno agregando 45 microlitros de acrilamida al 40 % y 18 microlitros de tampón tribo, EDTA o TBE 10x y centrifugue esta mezcla para facilitar la homogeneización.Inserte una punta P 200, acople a una fuente de gas nitrógeno e introduzca lentamente gas nitrógeno a través de la solución durante dos o tres minutos. A continuación, centrifugue la muestra durante 15 segundos a 2000 Gs para recoger la solución. Una vez finalizado, añada 4,5 microlitros de sulfato de amonio al 2 % o PS a la muestra para iniciar la polimerización del gel, e invierta el tubo varias veces para mezclar. Después de centrifugar la muestra para reunir la solución y lograr una polimerización homogénea, añada 4,5 microlitros de tetraetilmetilendiamina al 20 % o TEED a la muestra para catalizar la polimerización. Una vez que la muestra haya sido mezclada y centrifugada, desgasifique la solución con gas nitrógeno durante tres a cinco minutos para completar la polimerización y minimizar los monómeros no reactivos.A continuación, incube la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente para completar la polimerización y obtener una solución polimerizada de SA uno. Repita los pasos anteriores con el ADN monocatenario liofilizado de SA dos, añadiendo 45, 18, 4, 0,5 y 4,5 microlitros de acrilamida, T-B-E-A-P-S y teed, respectivamente, a 108 microlitros de la solución de SA dos. Para preparar las soluciones L dos, R dos y control, centrifugue el ADN monocatenario liofilizado y añada las siguientes cantidades de tampón TE al ADN monocatenario liofilizado correspondiente según se describió previamente; caliente la solución hasta su disolución para la solución de gel.Caliente las soluciones polimerizadas de SA uno y SA dos a 70 grados Celsius durante aproximadamente un minuto, hasta que se reduzca la viscosidad de la solución. Añada 10 microlitros o 10 partes de la solución polimerizada de SA uno a 10 microlitros o 10 partes de la solución polimerizada de SA dos.Luego, mezcle las soluciones polimerizadas SA uno y SA dos alternando calentamiento durante 15 segundos a 70 grados Celsius y agitación durante 15 segundos con la punta de una pipeta, durante un total de un minuto. Después de mezclar seis microlitros o seis partes de la solución al 100 % L dos para formar un gel al 100 %. Una vez que la muestra se haya mezclado como se describió anteriormente, pipetee el gel al 100 % en una placa de Petri de 60 milímetros y caliente el gel durante una hora a la temperatura óptima de hibridación.A continuación, permita que los entrecruzamientos de ADN continúen rehibridándose incubando los geles durante cuatro horas a temperatura ambiente. Cubra el gel con PBS que contenga calcio y magnesio tras la incubación nocturna a temperatura ambiente, retire el tampón restante de la placa de Petri y coloque el gel en un tubo de microcentrífuga. En este punto, caliente el gel al 100 % a 70 °C durante aproximadamente 30 segundos o hasta que el gel sea menos viscoso.Para la pipeta, coloque las laminillas de vidrio sobre un bloque calefactor a 70 grados Celsius y déjelas calentar durante uno o dos minutos. Añada una gota de adhesivo óptico a cada laminilla de vidrio. Luego añada 20 microlitros del gel al 100% a cada laminilla, y permita que el gel se derrita y se extienda sobre ellas.Retire cada vaso que contenga gel del bloque térmico y colóquelo en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Exponga los geles a una luz UV de 365 nanómetros durante 15 minutos. Después de calentar el gel durante una hora a la temperatura anal óptima y permitir que los entrecruzamientos de ADN se rehibriden durante cuatro horas, añada PBS a los geles.Luego, incubar los geles durante la noche a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, eliminar el tampón de los pocillos con una pipeta, teniendo cuidado de no aspirar el gel. A continuación, añadir sulfa sampa para cubrir cada gel.Una vez que los geles hayan estado expuestos a luz ultravioleta de 365 nanómetros durante 15 minutos, retire el sulfa sampa. Enjuague los geles una vez con PBS para eliminar el exceso de sulfa sampa tras repetir los pasos anteriores, incube los geles en aproximadamente 300 microlitros de poli-D-lisina al 0,2 miligramos por mililitro durante la noche a cuatro grados Celsius. Al finalizar, lave los geles dos veces con PBS durante cinco minutos para eliminar el exceso de polilisina y agregue medio de cultivo. Una vez que los geles hayan sido incubados en medio de cultivo durante 30 minutos, retire inmediatamente el medio justo antes de sembrar las células para el cultivo celular y la obtención de imágenes.Los fibroblastos cultivados en geles que se endurecen no presentaron alteraciones en la relación de aspecto, pero exhibieron un área de proyección mayor que los fibroblastos cultivados en geles al 100%. Los fibroblastos cultivados en geles al 100% tuvieron un área de proyección más pequeña y una relación de aspecto mayor que los fibroblastos cultivados en geles al 80%. Estos resultados indican que el comportamiento de los fibroblastos depende de la naturaleza dinámica del microentorno.Las neuronas cultivadas en geles que se ablandan no presentaron diferencias en el número de dendritas primarias ni en la longitud del axón, pero exhibieron dendritas primarias más cortas que las neuronas cultivadas en geles al 50%. Como en los estudios con fibroblastos, los fenotipos neuronales en geles estáticos fueron diferentes a los fenotipos neuronales en geles dinámicos. Las neuronas cultivadas en geles al 50% tuvieron menos dendritas primarias y axones más largos que las neuronas cultivadas en geles al 100%.Al intentar este procedimiento, es extremadamente importante recordar pipetear con precisión el gel viscoso, ya que las concentraciones son fundamentales para evitar la ruptura del gel; la pipetación precisa puede requerir varios intentos, y ofrecemos varias opciones adicionales en la sección de discusión de este protocolo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se presentan los protocolos de 3 dimensiones (3D) en la encapsulación de células dentro de los hidrogeles sintéticos. El procedimiento de encapsulación, se destaca por dos métodos utilizados para el entrecruzamiento (michael-tipo y además iniciada por la luz los mecanismos de los radicales libres), así como una serie de técnicas para evaluar el comportamiento de células encapsuladas.

La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

El efecto de la rigidez del sustrato en la función celular puede ser...

El estudio de los efectos de la matriz de rigidez en la función celular usando como base la acrilamida-hidrogeles

En este vídeo, que muestran las técnicas experimentales utilizadas para la fabricación de cumplimiento, la matriz extracelular (ECM) sustratos recubiertos adecuadas para el cultivo celular, y que son susceptibles de microscopía de fuerza de tracción y observando los efectos de la rigidez de ECM en el comportamiento celular.

Preparación de las matrices de demanda para la cuantificación de la contracción celular

Presentamos un nuevo hidrogel de poliacrilamida, llamado hidroxi-Paam, que permite una unión directa de las proteínas ECM con costo o experiencia mínima. La combinación de hidroxi-Paam hidrogeles con impresión por microcontacto facilita el control independiente de muchas señales del microambiente celular natural para el estudio de mechanostransduction celular.

Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

Rigidez mecánica en el microambiente tumoral juega un papel fundamental en el impulso de comportamiento maligno mediante el aumento de la actividad invadopodios y actomyosin contractilidad. Geles de poliacrilamida utilizando (PaaS), ensayos de invadopodios y de la fuerza de tracción se pueden utilizar para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas en respuesta a la matriz rigidez.

Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas

Aquí, se describe un método que permite la preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en un formato de placa multipocillo. El método no requiere ningún equipo especializado y podría ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio de investigación. Sería particularmente útil en investigaciones centradas en la comprensión de las respuestas celulares dependientes de la rigidez.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Este protocolo describe la caracterización de ADN polimerasa síntesis de ADN modificado a través de la observación de los cambios en el ADN fluorescente etiquetado infrarroja usando proyección de imagen de gel y electroforesis en gel. Geles de acrilamida se usan para obtener imágenes de alta resolución de la separación de los ácidos nucleicos cortos, que migran a distintas velocidades dependiendo del tamaño.

Ensayo de actividad polimerasa de la DNA usando la DNA etiquetado fluorescente infrarroja visualizado por electroforesis en Gel de acrilamida

Tradicionalmente, el corte vertical y la preparación de todo el montaje de la retina se han utilizado para estudiar la función de los circuitos de la retina. Aquí se describe la novela de corte método para preservar la morfología dendrítica de neuronas intactas retina.

Preparación de corte horizontal de la retina

Este video muestra un procedimiento para la generación de cultivos neuronales a partir de finales de embriones y la corteza temprana de ratón postnatal. Estos cultivos pueden ser utilizados para inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, calcio y sodio de imagen y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación del gen letal después del parto.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

Aprende a preparar hidrogeles de poliacrilamida reticulados con ADN para estudiar la rigidez tisular y su efecto en la función celular. Este método permite modular dinámicamente las propiedades mecánicas del sustrato.

Preparación de ADN-poliacrilamida reticulada hidrogeles

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