Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

El objetivo de este procedimiento es mostrar cómo se implementa la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total basada en polarización para el estudio de la remodelación de la membrana durante la exocitosis regulada. Esto se logra asegurándose primero de que los elementos ópticos, es decir, la placa de cuarto de onda y los cubos de polarización, estén colocados correctamente para generar polarizaciones de excitación p y s discretas. El segundo paso es verificar que los haces p y s sean de colina, atraviesen el eje óptico del microscopio e iluminen la misma porción del campo de visión cuando están en fluorescencia de reflexión interna total o TIRF.

A continuación, las células que se van a fotografiar se tiñen con el die de carbo cianuro, se mueren D y se estimulan con estímulos despolarizantes para desencadenar la exocitosis. El paso final es capturar imágenes de la fusión de vesículas de núcleo denso mientras se está en TIRF. En última instancia, P-T-I-R-F se utiliza para adquirir imágenes en tiempo real para monitorear los cambios topológicos de la membrana que resultan de la exocitosis de las células de cromina.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la pirometría y la capacitancia de membrana, es que el ptro F informa directamente de una curvatura de la membrana y, por extensión, de la dilatación del puerto de fusión. La parte más empinada de la curva de aprendizaje con esta técnica es primero aprender a alinear las polarizaciones de excitación p y s, de modo que viajen en línea a través del eje óptico del microscopio e iluminen la misma parte del campo de imagen. Un segundo problema que surge a menudo se refiere a la tinción celular, es decir, cuánto tiempo exponer las células a dd y qué constituye una célula bien teñida frente a una que está mal teñida.

La demostración del procedimiento estará a cargo de TA Square Row, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Para comenzar a encender todos los componentes del microscopio, los láseres y las computadoras dirigen un haz desde el láser de 488 nanómetros al plano focal posterior de la lente de apertura numérica de 1,49. Si el rayo láser se enfoca en el plano focal posterior, emergerá, se intercalará y aparecerá como un punto pequeño y bien definido en el techo directamente encima del objetivo.

A continuación, ajuste el espejo del galvanómetro X para que el rayo láser se desvíe del eje y emerja del objetivo en ángulos progresivamente más pronunciados con respecto a la normal del objetivo. A continuación, verifica que se logre la reflexión interna total o TIR. Agregue 10 microlitros de microesferas fluorescentes a un volumen de mililitro de solución salina fisiológica y solo se debe detectar la fluorescencia de las microesferas en el fondo de la placa más cercana a la interfaz TIR.

La detección de microesferas flotantes indica que el ángulo entre la luz incidente y la normal del objetivo es insuficiente. Para obtener imágenes basadas en polarización, utilice el haz alineado de 488 nanómetros como guía y ajuste la posición del rayo láser de 561 nanómetros en bruto para que viaje a lo largo de una trayectoria óptica idéntica. El láser de 561 nanómetros se utilizará para obtener imágenes del tinte de cianuro carbo.

Una lente divergente y espejos se encuentran aguas abajo del láser de 561 nanómetros. Con las perillas de ajuste de los espejos, ajuste el haz para que esté alineado con el haz de 488 nanómetros y el punto esté enfocado en el techo. Cuando los espejos del galvanómetro están en la posición cero, un cubo de polarización refleja el componente vertical del campo eléctrico y pasa el componente horizontal.

Se coloca aguas abajo del haz polarizado elípticamente en una pequeña etapa de traslación. Para facilitar la alineación posterior de la polarización, las trayectorias del haz utilizan un segundo cubo de polarización y espejos para recombinar los haces. Se coloca un obturador entre el primer cubo de polarización y el espejo de componente vertical.

Se coloca un segundo obturador entre el espejo componente horizontal y el segundo cubo de polarización. Estos obturadores están controlados por el software de imagen, lo que permite al usuario seleccionar rápidamente entre las polarizaciones del haz. Utilice un filtro polarizador para verificar la orientación del campo eléctrico en cada trayectoria del haz.

Un filtro polarizador solo permitirá la transmisión en línea con el eje del filtro. Verifique que los componentes vertical y horizontal del rayo láser estén alineados entre sí y con el haz de 488 nanómetros, realice los ajustes necesarios. Los tres haces deben estar enfocados en el plano focal posterior y emerger agrupados desde el objetivo hasta el mismo punto en el techo.

Este punto se puede marcar con una X para facilitar la alineación futura. A continuación, coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo. Coloque el plato que contiene microesferas fluorescentes.

En el objetivo, ingrese TIR moviendo el espejo del galvanómetro X en el software de movimiento del espejo en TIR. El componente vertical del haz es la polarización S y el componente horizontal del haz es ahora el centro de polarización P, una placa de un cuarto de onda o qw en la trayectoria del haz. Inmediatamente después de la apertura del láser, vea cada campo evanescente polarizado con una muestra de domine de varilla, que se predice que estará orientada aleatoriamente.

Gire la placa qw para que coincida con las intensidades de píxeles promedio. Aísle las células de cromona sanas de la glándula suprarrenal del gato, como se describe en el protocolo de texto, cuente las células con un hemocitómetro y prepárese para la transfección, transfecte las células con ADN que codifica la proteína de interés utilizando el sistema de electroporación, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los ajustes que proporcionan el mejor equilibrio entre la eficiencia de la transfección y la tasa de supervivencia celular.

Para esta preparación de las celdas de cromina bovina se utilizan 1,100 voltios, 40 milisegundos y un pulso siguiendo las celdas de placa de transfección suavemente sobre placas tratadas con poli de licina y colágeno en un mililitro de medios de electro desfile calentados. Coloque los platos en una incubadora a 37 grados centígrados. Agregue un mililitro de dos medios antibióticos a cada plato Después de seis horas, cambie el medio a medio normal al día siguiente.

Por lo general, las células de cromina se obtienen de 48 horas a cinco días después de la electroporación con el sistema de imágenes en el software de adquisición de inicio. Verifique que los láseres estén alineados. Compruebe el perfil de campo evanescente mediante microesferas.

Preparar el sistema de profusión global y local. Limpie los depósitos de solución con agua desionizada filtrada y llénelos con soluciones salinas fisiológicas basales y estimulantes. Antes de obtener imágenes de las celdas crominas, verifique que la polarización P y la excitación de polarización S iluminen la misma región del campo de visión y que las intensidades de iluminación sean aproximadamente equivalentes como se detalla en el protocolo de texto.

Ahora proceda a teñir las células de croma bovino con DD.Enjuague los medios de cultivo de la placa que contiene las células de cromina y reemplácelos con dos mililitros de solución salina fisiológica basal. Agregue 10 microlitros de DD de 10 milimolares directamente a la placa que contiene las células. Agite suavemente el plato durante dos a 10 segundos antes de retirar la solución.

Lave el plato de tres a cuatro veces con solución salina fisiológica basal para eliminar cualquier DD residual, las células ahora están teñidas y listas para usar. Añade una gota de aceite de inmersión al objetivo. Coloque el plato que contiene células de cromina teñidas con Dai D en la parte superior del objetivo.

Coloque la aguja de perfusión local de modo que esté a una distancia aproximada de 100 micras de la célula. Concéntrese en la membrana celular y active el hardware de enfoque automático inmediatamente antes de la adquisición de imágenes de estimulación celular. Comience la adquisición de imágenes Perfunde las células durante 10 segundos con una solución basal y, a continuación, durante 60 segundos con una solución despolarizante de cloruro de potasio de 56 milimolares.

Adquiera imágenes mientras obtura rápidamente entre la polarización P de 561 nanómetros y la polarización s de 561 nanómetros para monitorear los cambios en las emisiones p y s de DD y excitación de 488 nanómetros. Para obtener una imagen de la sonda de vesícula transfectada, se logra un etiquetado exuberante de la membrana de las células de cromina después de una breve incubación con Dai D.In este ejemplo, la membrana celular se tiñe bien. Una célula adherente sana exhibirá claras diferencias en las emisiones de p y s.

La imagen de emisión P muestra un borde de celda más brillante con respecto al resto de la celda. La imagen de emisión S muestra una fluorescencia aproximadamente uniforme en toda la huella de la célula, calculada píxel a píxel P sobre S y p más dos s. Las imágenes son sensibles a la curvatura de la membrana y a la concentración de colorante, respectivamente.

El CHRO y la célula mostrados también se han transfectado con synap OIN un florín para marcar las vesículas secretoras. El CHRO y la célula se estimulan con cloruro de potasio para despolarizar la membrana celular y desencadenar la exocitosis. Una serie de manchas fluorescentes se hacen repentinamente evidentes a medida que las densas vesículas centrales se fusionan.

Se dibuja una caja blanca alrededor de un evento de fusión Para analizar este evento de fusión, se examinaron los cambios cuadro por cuadro en las intensidades de imagen de sit one florin po VS y p plus two s. La intensidad fluorescente de la fluorescencia CIT uno disminuye rápidamente a medida que la proteína se difunde lejos del sitio de fusión. La hendidura que representa el complejo de membrana plasmática de vesículas fusionadas disminuye a un ritmo relativamente más lento.

Esta ilustración representa una interpretación de estas mediciones. La deformación rápida y localizada de la membrana es el resultado de un estímulo evocado por el influjo de calcio, la despolarización de la membrana provoca un aumento significativo en la fluorescencia G Camp 5G, lo que significa un aumento en los niveles de calcio subplasmático. Se selecciona una región de 30 por 20 píxeles de la celda y se cambian fotograma a fotograma en G camp 5G PS y p más dos s.

Las intensidades de píxeles se muestran en las imágenes y gráficos. El tiempo cero designa el fotograma antes de que se note un cambio en el PS. Las puntas de flecha blancas indican que la deformación de la membrana se acompaña de una disminución de la emisión de p más dos S.

La proteína citosólica G CAMP 5G es excluida del área por la vesícula de núcleo denso fusionado. Nótese también la disminución repentina de la intensidad 5G del campo G en los momentos cero. El aumento de larga duración en POS y la disminución en p más dos s sugiere un poro de fusión que se dilata lentamente, como se ilustra.

Aquí Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo construir un sistema PTU F y obtener imágenes de las células para observar los cambios topológicos de la membrana mientras está en el césped después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran los cambios en la forma de la membrana durante la exocitosis, la endocitosis, la citocinesis y la motilidad celular en células vivas.