Name: Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en Pseudomonas aeruginosa Uso de Mini- Himar1 La mutagénesis mediada por transposón Mariner (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a identificar nuevos genes reguladores de alginato en Pseudomonas aeruginosa mediante mutagénesis con transposón mini-Himar1. Este método permite generar bibliotecas de mutantes de alta densidad para estudiar la formación de biofilms.

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Este trabajo fue apoyado por la National Aeronautics and Space Administration West Virginia Espacio de Grant Consorcio (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) y ​​NIH P20RR016477 y P20GM103434 a la Red IDEA West Virginia para la Investigación Biomédica de Excelencia. Damos las gracias a M. Vonya Eisinger para la asistencia técnica con este trabajo.

1. Preparación de cepas bacterianas y biparental Conjugación <ol><li> Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC en 5 ml de caldo Luria (LB) suplementado con 15 g / ml de gentamicina y colocar en una incubadora de agitación durante la noche a 37 ° C. </li><li> Inocular P. aeruginosa cepa PAO1 en 5 ml de LB, y colóquelo en un incubador con agitación durante la noche a 42 ° C. </li><li> Mida OD 600 de cultivos de una noche y mezclar cantidades iguales de PAO1 y E. coli Pfac de tal manera que el volumen final es de entre 1-1,4 ml. </li><li> Mezcla Centrifugar a 6000 xg durante 5 min. </li><li> Mientras tanto, secar placas de LB para la conjugación: deje los platos abiertos en una incubadora a 37 ° C durante 10-15 min. </li><li> Retire todos menos 50 l de sobrenadante de la mezcla de células. </li><li> Resuspender el sedimento celular en los 50 l restantes de sobrenadante y la pipeta sobre una placa de LB seco en una gotita compacto. </li><li> Coloque con cuidado la placa bajo una campana extractora que se seque (IMPONota rtante: No permita que las células se distribuyen en la placa, esto disminuirá significativamente la eficacia de la conjugación). </li><li> Una vez que la gotita está seco, invertir la placa de LB y se incuba a 37 ° C durante 4-6 horas. </li><li> Mientras que la mezcla de células se está incubando, preparar grandes (150 mm DE x 15 mm) Placas de PIA con 300 g / ml de gentamicina. Antes de su uso, eliminar la humedad residual mediante la colocación en una incubadora a 37 ° C durante 15-20 min. </li><li> Después de la incubación de la mezcla de células es completa, recoger las células usando un asa de inoculación estéril y en un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de LB y vórtice, o una pipeta, para mezclar a fondo. </li><li> Separe las células uniformemente sobre las planchas de PIA contienen 300 g / ml de gentamicina. (IMPORTANTE: Para este paso, lo mejor es añadir volúmenes crecientes de la mezcla de células para separar las placas (por ejemplo, la placa 1: 10 l, de la Plata 2: 50 l, de la Plata 3: 100 l, de la Plata 4: 500 l, etc) . </li><li> Incubar durante la noche a 37° C. </li></ol> 2. Detección y aislamiento de colonias mucosas <ol><li> Retire las placas de la incubadora y examinar las colonias mucoides. </li><li> Aislar una sola colonia mucoide y consecutivas para el aislamiento en placas pequeñas (OD 100 x 10 mm) con PIA y 300 g / ml de gentamicina. </li><li> Incubar toda la noche a 37 ° C. </li><li> Repita el paso 2.2 en el cultivo de la noche anterior. </li><li> Repita los pasos 2.2 hasta 2.4 dos veces más para determinar la estabilidad de la cepa mucoide. </li><li> Después de la etapa final de aislamiento, inocular 4,5 ml de LB con una sola colonia mucoide e incubar en agitador durante la noche a 37 ° C. </li><li> Al día siguiente, la etiqueta 3 tubos de microcentrífuga para cada mutante mucoide. </li><li> Preparar dos alícuotas de 1,25 ml de cultivo de una noche en 2 tubos para la extracción de ADN genómico y la identificación del sitio de inserción del transposón (véase el Protocolo 3). </li><li> Además, archivar cada mutante mucoide con la pipeta 1 ml de cultivo durante la noche en una CRÉDITOScriovial Ely marcado que contiene un volumen igual de leche descremada 10%. Almacenar a -86 ° C. </li></ol> 3. ADNg digestión de restricción y la ligadura <ol><li> Extracto de ADNg de la mutante mucoide usando cualquier método preferido (fenol-cloroformo, por ejemplo, la columna. Espín, etc.) </li><li> Determinar la concentración de la ADNg, digerir un total de 2 g con 1 l de la endonucleasa de restricción SalI, 0,5 l de albúmina de suero bovino, 5 l de tampón de enzima SalI (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50, 10 mM de MgCl 2 , 1 mM de ditiotreitol (DTT), pH 7,9 a temperatura ambiente), y el volumen apropiado de dH2O para conseguir un volumen total de 50 l. </li><li> Digerir el ADN durante la noche a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Dependiendo de la eficiencia de la enzima de restricción, puede ser necesario añadir un adicional de 1 l para la noche a la mañana digest y se incuba a 37 ° C durante 1-2 horas Esto es además de la noche a la mañana digest.) </li><li> Se purifica el digeSTED ADN usando cualquier método preferido (por ejemplo, purificación en gel de agarosa, columnas de centrifugado) y se eluye con 25 l de tampón. </li><li> Se liga el ADN digerido mediante la mezcla de 11 l de ADN purificado con una concentración preferida de ~ 10-20 ng / l, 1,5 l de tampón de ligadura (330 mM de Tris-acetato, pH 7,5, 660 mM de acetato de potasio, acetato de magnesio 100 mM, 5 mM TDT), 1,5 l de ATP 100 mM y 1 l de ADN ligasa. </li><li> Incubar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente, y después inactivar la enzima por incubación durante 15 min a 70 ° C. (Nota: la incubación de la mezcla a temperatura ambiente durante más tiempo puede aumentar el éxito de la ligadura). </li></ol> 4. PCR inversa (iPCR) y Análisis de Secuencia <ol><li> Realice iPCR el producto de ligación utilizando la siguiente adelante y atrás primers y ciclos térmicos condiciones: -Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA -Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA Termociclador Condiciones: 1. 94 ° C durante 1 min. 2. 94 ° C durante 1 min. 3. 58 ° C durante 2 min. 4. 72 ° C durante 2 min. 5. 72 ° C durante 8 min. 6. 10 ° C espera. Repita los pasos 2-4 para 34 ciclos. (NOTA: Los productos de Amplified iPCR pueden almacenarse a 4 ° C) </li><li> Realice la electroforesis en gel de agarosa para confirmar la amplificación exitosa iPCR. </li><li> Lleve a cabo la secuenciación del producto iPCR utilizando los cebadores Gm3OUT y Gm5OUT. El sitio de inserción y la orientación de Himar1 se asignan a cabo. </li></ol>

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</ol>

El autor Hongwei D. Yu es el oficial científico jefe y cofundador de progénesis Technologies, LLC.

Es importante señalar que este método se puede utilizar en otras especies de Pseudomonas con estas alteraciones: incubar P. y P. fluorescens putida a 30 ° C, y P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri debe cultivarse en placas de LB suplementadas con 150 g / ml de gentamicina; en el paso 1,11, p células stutzeri deben transferirse en 500 l de LB en lugar de 1 ml. Además, hay dos pasos críticos para este protocolo. En primer lugar, la cepa receptora debe cultivarse a...

La capacidad de la oportunista, patógenos Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa para sobreproducir alginato es un factor importante en su capacidad para establecer un biofilm. La sobreproducción de alginato es un fenotipo a menudo referido como mucoidy. El aislamiento de colonias mucosas de los esputos de los individuos que sufren de fibrosis quística (FQ) es indicativo de una infección crónica y se asocia directamente con una disminución general de la salud del paciente 1. En la actualidad, se entiende que la regulación y la producción de alginato en P. aeruginosa se ​​produce principalmente en dos operones. El primero es el operón biosintético de alginato, que contiene 12 genes (algD - Alg8 - Alg44 - algK - Alge - AlgG - Algx - algL - Algi - algJ - algF - alga) que son responsables de la síntesis y la exportación del polímero de alginato través el periplasma para el med extracelularnt 2-5. El segundo operón es un grupo de genes a partir de la alternativa sigma factor AlgU / T y continuando con mucA, mucB y MUCD. AlgU / T es un regulador positivo, mientras que MUCAB-D se clasifican como reguladores negativos de la producción de alginato 6-8. Además, los reguladores transcripcionales, tales como ALGB, AlgQ, ALGR, y RpoN, así como post-transcripcional y post-translacional modificación por el control de la represión catabólica, la actividad quinasa (KinB) y intramembrane proteólisis, también se han demostrado estar involucrados en alginato regulación 9-14. El vector transposón mini-Himar1 conocida como Comisión PFA fue creado originalmente en el laboratorio del Dr. Mekalanos &#39;en Harvard Medical School 15. El plásmido PFA consta de un elemento transponible flanqueado por dos repeticiones invertidas de 27 pb y un casete de gentamicina de resistencia en el medio (aacC1: 534 pb), un gen que codifica la hyperactive transposasa Mariner 16, y una codificación de β-lactamasa gen (bla) (Figura 1). Secuencia de la información para el elemento de transposición de la Comisión PFA está disponible en el número de acceso de GenBank: DQ366300 13. En la Comisión PFA, hay un sitio de clonación múltiple (MCS) detrás del gen aacC1 que se utiliza para la identificación del sitio de inserción cromosómica utilizando PCR inversa. Una gran ventaja con el uso del transposón mini-Himar1 es que no se requieren factores del huésped específicos de transposición (mutagénesis). Además, hay una alta abundancia de los sitios de inserción de dinucleótidos TA se encuentran en todo el genoma de P. aeruginosa. Por ejemplo, AT sitios de inserción dinucleótido produce 94.404 y 100.229 veces en el PAO1 (6.264.404 bps, número de acceso GenBank NC_002516.2) y PA14 (6.537.648 bps; número de acceso GenBank NC_008463) genomas, respectivamente. Debido a la abundancia de TA dinucleótido en el genoma, mini-Himar1 </em&gt; Transposón puede causar que el de alta densidad y mutagénesis aleatoria, que es particularmente adecuado para el análisis de genes de virulencia y los genes que están altamente regulados. Teóricamente, el transposón mini-Himar1 puede insertar en cualquier gen no esencial dentro del genoma de P. aeruginosa. Esto proporciona aproximadamente 18 sitios de inserción de asistencia técnica al marco de lectura abierto en el genoma PAO1. Aquí se describe un protocolo utilizando mini-Himar1 transposón mutagénesis mediada por identificar nuevos reguladores de mucoidy en P. aeruginosa. Más específicamente, biparental conjugamos el vector de la Comisión PFA contiene un transposón mini-Himar1 de E. coli SM10/λpir en el nonmucoid cepa PAO1 prototrophic. Después de que el transposón se integra en el genoma, la cepa receptora se cultiva en Pseudomonas aislamiento agar (PIA) que contiene triclosán que inhibe el crecimiento de E. coli. Por lo tanto, una biblioteca de mutantes de <em&gt; P. aeruginosa puede ser seleccionado por el crecimiento en la placa de PIA suplementado con gentamicina y la presencia del fenotipo mucoide. Tenga en cuenta, un transposón mediada vs un mutante verdadera integración tendrá un fenotipo resistente y carbenicilina sensible gentamicina. En este estudio, aproximadamente 80.000 mutantes de inserción de PAO1 se aislaron a través de cuatro conjugaciones separadas. Hemos examinado a continuación para los aislados mucoides, y se determinó el sitio de inserción por la digestión con enzimas de restricción, ligación y PCR inversa. Se realizó análisis de transferencia de Southern usando la casete de resistencia a gentamicina como una sonda para ver el número de inserción por genoma. Se determinó que más de 90% de los mutantes obtenidos por la conjugación utilizando este protocolo tenía sólo una única copia de la Himar1 en el genoma y se muestra el fenotipo resistente y-carbenicilina sensible gentamicina. Se identificaron un total de 32 cepas mucoides, 22 de ellas fueron asignadas a diferentes loci del P. aeruginosa PAO1cromosoma. Esta tasa de inserción proporciona una cobertura adecuada para identificar varios reguladores novedosos de la sobreproducción de alginato.

<table><tbody><tr><td>Caldo Luria</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>vía Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas agar de aislamiento</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>vía Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Placas pequeñas (100 diámetro exterior x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Placas grandes (150 diámetro exterior x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación de sobremesa</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>agitar a 200 rpm</td></tr><tr><td>Incubadora de armario</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Espectrofotómetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>o método/proveedor preferido</td></tr><tr><td>Asas de inoculación desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Viales criogénicos de 2,0 ml</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>vía Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNeasy Sangre y Tejidos (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>o método/proveedor preferido</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>o método/proveedor preferido</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>o método/proveedor preferido</td></tr><tr><td>Kit de ligadura de ADN FastLink II</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>a través de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Accu block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>vía Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sal1, endonucleasa de restricción</td><td>New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>via Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Taq DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler, Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Viales criogénicos</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; uso de mini-<em&gt; himar1</em&gt; la mutagénesis mediada por transposón mariner

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa, del medio ambiente con capacidades metabólicas versátiles. P. aeruginosa es una bacteria patógena oportunista que produce infecciones pulmonares crónicas en pacientes con fibrosis quística (FQ). La sobreproducción de un polisacárido capsular llamado alginato, también conocido como mucoidy, promueve la formación de biopelículas mucoides que son más resistentes que las células planctónicas a la quimioterapia antibiótico y las defensas del huésped. Además, la conversión de la nonmucoid a fenotipo mucoide es un marcador clínico para el inicio de la infección crónica en la FQ. Sobreproducción de alginato por P. aeruginosa es un proceso que en gran medida endergónica impuestos sobre la energía celular. Por lo tanto, la producción de alginato está muy regulada en P. aeruginosa. Para entender mejor la regulación de alginato, se describe un protocolo usando el transposón de mutagénesis de mini-Himar1 para la identificación de nuevos regulador de alginatos en una cepa PAO1 prototípico. El procedimiento consta de dos pasos básicos. En primer lugar, hemos transferido el transposón mini-Himar1 (PFA) del huésped E. coli SM10/λpir en receptor P. aeruginosa PAO1 a través de la conjugación biparental para crear una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad, los cuales fueron seleccionados en placas de agar de Pseudomonas aislamiento suplementado con gentamicina. En segundo lugar, hemos examinado y aislaron las colonias mucoides para asignar el lugar de la inserción a través de PCR inversa usando cebadores de ADN que apuntan hacia el exterior desde el casete de gentamicina y la secuenciación del ADN. El uso de este protocolo, se han identificado dos nuevos reguladores de alginato, Muce (PA4033) y kinB (PA5484), en PAO1 cepa con una de tipo salvaje mucA codifica el factor anti-sigma MUCA para el maestro de alginato regulador AlgU (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénesis de alto rendimiento puede ser modificado para la identificación de otros genes relacionados con la virulencia que causa el cambio en Colomorfología ny.

Como se ilustra en la Figura 1, el vector de transposón mariner-Mini Himar1, PFA, contiene dos repeticiones invertidas de 27 pb con sitios de inserción de AT que flanquean el casete de resistencia a gentamicina aacC1, con su promotor σ 70-dependientes, y un sitio de clonación múltiple (MCS). Además, el vector de la Comisión PFA contiene genes que codifican la transposasa altamente activo Himar1, β-lactamasa (bla), y el operón de transferencia de TRA.</e...

Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.

Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Uso de Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; La mutagénesis mediada por transposón Mariner

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar nuevos genes asociados con la producción del exopolisacárido alginato en Pseudomonas aeruginosa mediante mutagénesis mediada por transposón mini-Himar1. Esto se logra primero cultivando dos cultivos separados durante la noche de la cepa donadora, E. coli Lambda pir que porta el plásmido PAC, y de las células receptoras Pseudomonas aeruginosa PAO1. A continuación, el plásmido PAC se conjuga mediante co-cultivo de E. coli Lambda pir con Pseudomonas aeruginosa.Los conjugados PAO uno y trans se seleccionan en agar de aislamiento de Pseudomonas, luego se identifican y aíslan las colonias moid en placas de PIA. Finalmente, se identifica la ubicación y orientación del transposón mini he mar uno en el sitio de inserción dentro del genoma de Pseudomonas aeruginosa PAO uno. En última instancia, el uso de la mutagénesis mediada por el transposón mini he R uno identifica y caracteriza aquellos genes asociados con la producción de alginato en Pseudomonas aeruginosa.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la microbiología y la genética bacteriana, como la identificación de loci genéticos implicados en la regulación de diferentes funciones celulares, demostrando que el procedimiento se realizará con el vector de transposón mini he R uno Mariner P fac. Un estudiante de posgrado de mi laboratorio. El vector P fac contiene repeticiones invertidas de 227 pares de bases con sitios de inserción TA que flanquean el casete de resistencia a gentamicina A CC uno, con su promotor dependiente de Sigma 70 ubicado aguas arriba de un sitio de clonación múltiple. El vector P fac también contiene genes que codifican la transposasa he R uno altamente activa, la beta-lactamasa y la operación de transferencia TRA.Los sitios de inserción TA permiten una integración eficiente en el genoma de cepas de pseudomonas aerogen. La precisión en la identificación y selección de mutantes OID es fundamental para el éxito general en la determinación de los loci génicos involucrados en la regulación de la alginato. Para preparar las cepas bacterianas, comience por inocular e coli SM 10 Lambda peer P fac en cinco mililitros de lb, suplementados con 15 microgramos por mililitro de Gentamicina, y coloque en un incubador con agitación durante la noche a 37 grados Celsius el mismo día.Inocule la cepa posa PO uno en cinco mililitros de LB y coloque en un incubador con agitación durante la noche a 42 grados Celsius el día siguiente. Mida la DO 600 de los cultivos nocturnos y mezcle cantidades iguales de PAO uno y E coli P fac, de modo que el volumen final esté entre un mililitro y 1,4 mililitros. Centrifugue la mezcla a 6.000 × g durante cinco minutos.Mientras tanto, seque las placas de LB para la conjugación dejándolas abiertas en una incubadora a 37 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Retire todo el sobrenadante excepto 50 microlitros de la mezcla celular. Luego resuspenda.Suspenda el pellet celular en los 50 microlitros restantes del sobrenadante y aspire con pipeta hacia una placa LB seca. Coloque cuidadosamente la placa en una gota compacta dentro de una campana extractora para que se seque. No permita que las células se extiendan por la placa.Esto disminuirá significativamente la eficiencia de la conjugación. Una vez que la gota esté seca, invierta la placa de LB e incube a 37 grados Celsius durante cuatro a seis horas mientras la mezcla celular está incubando. Prepare placas grandes de agar de aislamiento de pseudomonas o placas PIA con 300 microgramos por mililitro de gentamicina.Después de la incubación, utilice un asa de inoculación estéril para recoger esta única gota de células en un tubo de microcentrífuga que contenga un mililitro de lb, y vortexee o pipetee para mezclar completamente antes de distribuir las células uniformemente sobre las placas grandes de PIA. Incube las placas durante la noche a 37 grados Celsius. Retire las placas del incubador y examine las colonias OID.Aislar una colonia moid individual y realizar un aislamiento por estría en placas pequeñas con PIA y 300 microgramos por mililitro de gentamicina. Al día siguiente, aislar una colonia moid individual y repetir la estría. Repetir el aislamiento de colonia individual otras dos veces más para determinar la estabilidad del aislado moid después del aislamiento inicial.Paso: inocular 4,5 mililitros de LB con una sola colonia OID e incubar en agitador durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, etiquetar tres tubos de microcentrífuga para cada mutante OID. Preparar dos alícuotas de 1,25 mililitros de cultivo nocturno para la extracción de ADN genómico y la identificación del sitio de inserción del transposón.Además, archive cada mutante OID pipeteando un mililitro de cultivo nocturno en un vial criogénico debidamente etiquetado que contenga un volumen igual de leche descremada al 10 %. Almacene a -86 °C. Después de extraer el ADN genómico del mutante MOID.Utilizando cualquier método preferido y determinando su concentración, digiera un total de dos microgramos con un microlitro de la endonucleasa de restricción S uno en un volumen total de 50 microlitros durante la noche a 37 grados Celsius. Una vez que el ADN digerido se haya purificado mediante cualquier método preferido hasta un volumen total de 25 microlitros, prepare una reacción de ligación utilizando aproximadamente 11 microlitros de ADN e incube la mezcla durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, inactívelo a 70 grados Celsius durante 15 minutos y realice la PCR inversa (IPCR) sobre el producto de ligación utilizando los siguientes cebadores directo y reverso y las condiciones de termociclado indicadas.Luego verifique la amplificación en un gel AROS antes de utilizar finalmente los cebadores GM tres out y GM cinco out para secuenciar la reacción. En esta figura se muestran ejemplos de aislamientos MOID y no MOID. Basado en el protocolo demostrado en este video, cada conjugación debería producir un banco de aproximadamente 20 000 mutantes en 15 a 20 placas grandes debido a la sobreproducción de alginato.La colonia moid debe ser de color claro o blanco y tener una apariencia cremosa o viscosa. Si la mutagénesis y la amplificación del ADN tienen éxito, debe haber un único amplicón del tamaño adecuado, como se ilustra en esta figura. No hay presencia de amplicón de IPCR en PAO uno.Sin embargo, detectamos un único amplicón de aproximadamente 1.400 pares de bases y aproximadamente 1000 pares de bases en PA, O uno VE dos, y PA O uno VE 13, respectivamente. El tamaño de estos amplicones corresponde a la inserción del transposón HE R uno mariner en la región promotora de PA 4 0 3 3 en PA oh uno VE dos, y en una región interna de PA 5 4 84 en PA oh uno VE 13 PA oh uno ADN genómico. El ADN que ha sido sometido a restricción, digestión y ligación puede utilizarse como control negativo.Así, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro días si se lleva a cabo adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar incubar las cepas bacterianas a la temperatura adecuada antes de la conjugación bioparental.

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