Captura Glicopéptido Proteómica Superficie Celular

El objetivo general de este procedimiento es enriquecer las proteínas de la membrana de la superficie celular de baja abundancia. Esto se logra primero desnaturalizando y digiriendo las proteínas de membrana. El segundo paso es oxidar los glicanos y capturar los péptidos glicosilados en una superficie de resina.

A continuación, los no glicopéptidos se lavan de la resina. El paso final es la liberación de los glicopéptidos ligados a N de la resina para el análisis de lc MS. En última instancia, la secuencia peptídica identificada se puede mapear a las proteínas con fines de identificación y cuantificación.

Hoy te voy a demostrar cómo funciona el ral de captura de péptidos de Geico. La principal ventaja de esta técnica de sobredosis, ya existentes, como la captura de glicoproteínas, es que primero se digiere la proteína de membrana y la captura del glicopéptido se puede realizar en un solo recipiente. La aplicación de esta técnica puede extenderse hasta el descubrimiento del biomarcador de la enfermedad.

Dado que la proteína de cocodrilo se puede diseminar en la sangre y otros fluidos corporales y la glicoproteína circulante en la sangre, que son específicos del proceso patológico, se pueden utilizar como biomarcadores de pronóstico y diagnóstico. Primero, prepare cuatro mililitros de tampón hipotónico con un cóctel de inhibidores de proteasa de uno a 100. Agregue un mililitro de tampón hipotónico en una celda que contenga aproximadamente de 10 a la octava celda, e incube la mezcla durante 15 a 30 minutos. En hielo, transfiera las células a un vial de dos mililitros y corte las células pasando la muestra de cinco a 10 veces a través de una aguja de jeringa.

A continuación, utilice un hemocitómetro y una tinción con azul triano. Para comprobar la eficacia de la lisis, combine el lisado de un mililitro con tres mililitros de tampón hipotónico sobrante. Gire el tubo a 3000 veces G a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Transfiera el supernadante a un tubo de ultracentrífuga y almacene el pellet en un congelador a 80 grados centígrados negativos. Haga girar el tubo de ultracentrífuga a 100.000 veces G a cuatro grados centígrados durante dos horas. A continuación, disuelva la fracción microsomal en 200 microlitros de tampón de desnaturalización y luego hierva la solución a 100 grados centígrados durante 10 minutos.

Después de enfriar la solución calentada a temperatura ambiente, agregue polvo de urea de ultra alta pureza para obtener una concentración final de ocho molares e incube la muestra a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, agregue 500 milimolares. Oto Solución madre de acetamida a la muestra para dar una concentración final de 15 milimolares.

A continuación, incubar la solución en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente para alquilar los tioles libres de la muestra. A continuación, añada una solución madre molar de DTT a la muestra para obtener una concentración final de 10 milimolares e incube la solución durante otros 10 minutos a temperatura ambiente. Para apagar el exceso de I oto acetamida, diluya la solución obtenida 10 veces con tampón tris de 40 milimolares a pH 8 y, posteriormente, agregue tripsina a la muestra en una proporción de uno a 20 de tripsina con respecto a la cantidad total de proteína.

Obtener la cantidad de proteína total mediante el ensayo de Bradford. Mantenga la reacción de digestión en un horno a 37 grados centígrados durante la noche para asegurarse de que la reacción se complete. Cuando termine, termine la digestión acidificando la solución de la muestra a pH uno con ácido clorhídrico 10 milimolar, una condición que también se degrada más rápidamente.

A continuación, el detergente se degrada más rápidamente a 37 grados centígrados durante una hora en una incubadora. Después de la incubación, elimine la precipitación desarrollada por centrifugación después de la centrifugación. Limpie la natina SUP que contiene los péptidos de la muestra mediante un cartucho de extracción en fase sólida C 18 y seque la muestra obtenida con una aspiradora rápida.

Realice un análisis de la página SDS de las muestras antes y después de los viajes y la digestión para confirmar la eficiencia de la digestión. En este punto, disuelva los péptidos limpios en 200 microlitros de tampón de acoplamiento. Después de agregar puriado de sodio a la solución peptídica para dar una concentración final de 10 milimolares.

Incubar la muestra durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente Una vez finalizada la incubación, enfriar el exceso de sulfito de sodio hasta obtener una concentración final de 20 milimolares y un pH de cinco después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, introducir 200 microlitros de solución de resina derivada de hidrocitos, pree equilibrada y tampón de acoplamiento en la solución peptídica. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante uno o dos días con rotación de extremo a extremo para un acoplamiento completo. Cuando termine, retire los péptidos sueltos lavando la resina dos veces con un mililitro de agua desionizada, un mililitro de cloruro de sodio 1,5 molar, un mililitro de metanol y un mililitro de nitrilo aceto al 80%.

A continuación, recoja el sobrenadante y los lavados para el análisis de los péptidos no unidos. Almacene las muestras en un congelador a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. A continuación, lavar la resina tres veces con un mililitro de bicarbonato de amonio de 100 milimolares a pH ocho.

Finalmente, agregue 300 microlitros de bicarbonato de amonio en el vial de muestra. Para liberar los glicopéptidos N de la resina. Agregue PNG ACE F e incube la muestra a 37 grados centígrados con una rotación de extremo a extremo.

A continuación, recoja los péptidos liberados por centrifugación, luego lave la resina con un mililitro de nitrilo acetil al 80%. Combina el lavado con el recogido previamente. Finalmente secar la solución obtenida en la velocidad VAC para el análisis lc MS.

El espectro de glicopéptidos atípicos tomado después del método de enriquecimiento se muestra aquí en el glicopéptido obtenido. Se eliminó el glicano n y el glicano unido se convirtió en ácido espártico por P-N-G-A-F. Por lo tanto, el espectro puede ser fácilmente buscado por cualquier motor de búsqueda proteómica en bases de datos comunes de secuencias de proteínas.

Esclerosis múltiple lc atípica. Aquí se muestra el resultado de los n glicopéptidos capturados, en los que se pueden identificar más de 100 glicoproteínas a partir de una sola corrida de MS de una fracción microsomal celular. La selectividad de enriquecimiento tanto para glicoproteínas como para glicopéptidos es generalmente superior al 90%Un análisis exitoso puede tener una selectividad de enriquecimiento del 95% utilizando una columna SCX y un gradiente escalonado para fraccionar aún más. Las muestras antes del análisis de LCMS generalmente duplicarán el número de identificaciones de glicoproteínas.

A veces, cuando la cantidad de los glicopéptidos obtenidos es baja, se puede observar la impureza acumulada de los viales en la muestra final. Estos contaminantes se pueden eliminar mediante una columna MCX. Entonces, después de ver este video, espero que tenga una buena comprensión de cómo usar nuestros métodos de captura de glicopéptidos para estudiar la proteína de membrana de autoservicio.

Mientras intenta este protocolo, también es importante reservar muestras para cada paso para solucionar problemas. El volumen del reactivo también se puede optimizar para su estudio específico.