Inducida por láser Breakdown Spectroscopy: un nuevo enfoque para el mapeo y cuantificación de nanopartículas en tejidos de órganos

El objetivo general de este procedimiento es ofrecer un método sencillo y robusto para mapear y cuantificar elementos orgánicos e inorgánicos en tejidos biológicos mediante instrumentación de mesa completamente compatible con la microscopía óptica convencional. Esto se logra enfocando un pulso láser sobre la muestra de interés para iniciar la descomposición y la chispa del material. El plasma emite radiación que posteriormente se analiza mediante un espectrómetro.

El segundo paso consiste en seleccionar e identificar las líneas espectrales correspondientes a los elementos de interés y escanear la superficie de la muestra. A continuación, realice mediciones de calibración para poder determinar las concentraciones elementales. El paso final es construir el mapa elemental del tejido de la muestra a partir de todos los espectros registrados, utilizando una escala de intensidad relativa o de concentración.

En última instancia, la espectroscopía de descomposición inducida por láser se utiliza para mostrar la distribución tisular de diversos elementos sin necesidad de etiquetado, en comparación con otros métodos existentes como la fluorescencia micro-X, o técnicas basadas en espectroscopía de masas. La espectroscopía de descomposición inducida por láser, o LIPS, es sencilla de implementar, opera a presión atmosférica y es compatible con la mayoría de los sistemas de microscopía óptica.

Además, permite alcanzar niveles de sensibilidad en partes por millón (PPM) con una resolución en el orden de micrones. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en nanotecnología aplicada a estudios biológicos, como la distribución dentro de una muestra de tejido de nanopartículas que contienen elementos metálicos, sin necesidad de etiquetar las nanopartículas. La técnica puede extenderse a la patología debido a su bajo límite de detección para identificar elementos metálicos anormales, tales como cobre, hierro y aluminio, que pueden existir en diferentes órganos del cuerpo, especialmente en el cerebro. A través de este método se pueden obtener información y caracterización en la detección de nanopartículas.

También puede aplicarse a otros sistemas, como la detección de elementos inorgánicos en la UCT o la distribución heterogénea de elementos. Los científicos que deban realizar tales experimentos tendrán que esforzarse con los ajustes de adquisición para obtener la mayor señal posible sin dañar demasiado las muestras. Comience el experimento preparando portaobjetos con muestras que serán estudiadas para este protocolo.

Obtenga órganos de ratones con tumores, inyectados con una solución de nanopartículas de gadolinio para preparar láminas. Coloque rebanadas de 100 micrómetros de grosor de los órganos sobre una lámina de cuarzo o una placa de Petri. Almacene siempre las láminas a menos 80 grados Celsius.

A continuación, prepare las muestras para la calibración. Etiquete varios viales con concentraciones que vayan desde cero nanomolar hasta cinco milimolar. Para cada vial, prepare 100 microlitros de una mezcla de gadolinio en agua con la concentración adecuada.

Una vez hecho esto, prepare un portaobjetos. Mida cinco microlitros del primer vial y colóquelos sobre el portaobjetos de cuarzo o la placa de Petri. Asegúrese de identificar la gota para su uso posterior.

Desplácese tres milímetros a lo largo de la circunferencia y coloque cinco microlitros de la siguiente concentración sobre el portaobjetos. Haga lo mismo con cada una de las soluciones restantes. Seque el contenido del portaobjetos durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Esta configuración de LIP utiliza un láser de nanosegundos de itrio, aluminio y granate dopado con neodimio que produce un haz con una longitud de onda de 1064 nanómetros. Utilice una parte del haz para sincronizar el sistema espectrométrico. Dirija la otra parte a través de un atenuador controlado por computadora, utilizado para ajustar y estabilizar la energía del pulso láser durante todo el experimento.

A continuación, dirija el haz a la región de la muestra. Enfóquese en la etapa de traslación controlada por software. Eso mantendrá el soporte de la muestra y una cámara CCD para monitorear la superficie del soporte de la muestra.

Otro para monitorear el penacho de plasma. Analice la luz proveniente de la descomposición de la muestra en un espectrómetro de red giratoria con una cámara ICCD mantenida a menos 26 grados Celsius. Para la medición, comience estabilizando el láser y enfriando la cámara a menos 26 grados Celsius.

10 minutos antes del experimento. Cuando esté listo, utilice el atenuador para fijar la energía del pulso en cinco milijulios. A continuación, obtenga una portaobjetos de muestra para estudiarla y prepárese para montarla en la platina de muestra.

Sujete la muestra al soporte de muestras motorizado. Una vez hecho esto, regrese al ordenador. Para posicionar la muestra, mueva la platina de manera que una parte de la muestra quede en el haz del láser.

Ajuste el enfoque del láser a unos 100 micrómetros por debajo de la superficie de la muestra. Cuando se realiza esto, el láser forma cráteres de 50 micrómetros o menos. Utilice la computadora para establecer el valor de la rendija de entrada del espectrómetro en 40 micrómetros y los parámetros del ICCD para la medición de mapeo.

Ajuste la posición del soporte para apuntar a una región de la muestra. Tome una imagen panorámica de alta resolución de la muestra con una fuente de luz de espectro amplio. Luego, utilice el software y la imagen capturada para definir la región de escaneo de libs y la resolución.

Aquí la cuadrícula es de 100 por 100 con 100 micrómetros entre puntos. Inicie la adquisición automatizada de los datos en cada punto de la cuadrícula. Se mide un espectro y se registra en un archivo.

Una vez que las mediciones estén completadas en aproximadamente 30 minutos, tome una segunda imagen del corte de muestra y luego consolide todos los espectros en un solo archivo de datos para su uso posterior. A continuación, retire la portaobjetos de la muestra y prepárese para montar las muestras de calibración. Sujete la portaobjetos de cuarzo con las muestras de calibración en la platina de traslación junto al ordenador.

Coloque el centro de la primera muestra de calibración en la trayectoria del láser. Mantenga los parámetros del experimento y registre un espectro. Haga lo mismo con cada una de las muestras con diferentes concentraciones de gadolinio.

Estos son ejemplos de espectros de disparo único registrados desde diferentes regiones del tejido renal. El espectro azul se registró en la región central del riñón. El espectro rojo corresponde a la membrana del riñón y el espectro verde corresponde a la zona periférica.

Las nanopartículas inyectadas, basadas en gadolinio, están compuestas por una matriz de polis laano con iones de gadolinio quelados por un ligando doca en sus superficies. En el rango espectral de 286 nanómetros a 320 nanómetros utilizado, se pueden detectar gadolinio, calcio, hierro, silicio y aluminio. Observe cómo las intensidades varían en las diferentes regiones de la muestra, lo que sugiere una gran heterogeneidad en las concentraciones de estos elementos. La cartografía tisular de gadolinio, silicio y hierro en un corte de riñón de ratón se realizó utilizando los datos de libs con una resolución de aproximadamente 100 micrómetros.

La intensidad de la escala se expresa en una unidad arbitraria. Esta es una imagen de luz natural. Para comparación, se obtuvieron resultados similares con muestras de tumor.

Como en este mapa del tejido tumoral de gadolinio y SQ 20 B, se ha superpuesto una escala de colores falsos sobre la imagen natural de luz. En este experimento, se administraron nanopartículas directamente en el tumor. Después de una hora, el tumor fue extirpado y preparado para su análisis.

Tenga en cuenta que aproximadamente la mitad del volumen del tumor contiene algunas partículas en los masters. Esta técnica puede realizarse en menos de una hora para muestras de un centímetro cuadrado con una resolución de 100 micrómetros si se realiza adecuadamente. Al realizar los lips, es importante recordar que las mediciones se realizan a partir del plasma inducido por láser y es crucial controlar todos los parámetros durante todo el experimento siguiendo el procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como inmunohistoquímica en cortes adyacentes, para responder preguntas adicionales, como el tipo de célula implicada en el proceso de interés tras su desarrollo. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la nanotecnología aplicada a la biología y la medicina exploren la distribución de compuestos que contienen elementos metálicos en tejidos biológicos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo utilizar la técnica lips para mapear múltiples elementos en tejidos biológicos.