Name: Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprende a cultivar células precursoras miogénicas de teleósteos para estudiar miogénesis in vitro mediante disociación mecánica y enzimática de músculo epaxial. Este protocolo permite analizar la regulación génica y la diferenciación celular en vertebrados no mamíferos.

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Los autores quisieran expresar muchas gracias a los Dres. Josep Planas y Juan Castillo por su experiencia profesional en el desarrollo y aplicación de este protocolo de cultivo de pequeños peces y anfibios. Se agradece también a las innumerables personas que han colaborado incansablemente con la disección y la disociación del tejido muscular de muchos peces (tanto en las especies y número), entre ellos Mateo carga, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily y Sinibaldo Romero. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Alabama en el Departamento de Biología fondos iniciales Birmingham, Centro para la Investigación de la proteasa NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH NIAMS Grant # R03AR055350 y NDSU Avance ADELANTE NSF Grant # HRD-0811239 al PRB. El apoyo también fue proporcionado por el Centro de Investigación de la UAB Nutrición Obesidad premio # P30DK056336, NIH NIDDK. Sus contenidos son de exclusiva responsabilidad de sus autores y no necesariamenterepresentar los puntos de vista oficiales de la NIH.

Declaración de Ética: Todo experimentación con animales vertebrados se describen en el presente documento fue aprobado previamente por el Comité de la Universidad de Alabama en Birmingham Institucional Cuidado de Animales y el uso y está en consonancia con las directrices establecidas por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare, Institutos Nacionales de Salud de los EE.UU. Departamento de Salud y Servicios Humanos. 1. Preparación para la Cultura <ol><li> Preparar el medio de base de la siguiente manera: 9 mM de NaHCO3 (1,51 g por 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g por 2 L) en DMEM (13,48 g / L; 26,96 g por 2 L). <ol><li> Determinar el pH y ajustar a 7,40 con HCl o NaOH. </li><li> Determinar la osmolalidad y ajustar a ~ 300 mOsm con NaCl (si es necesario). </li><li> Filtro de esterilizar usando (2) sistemas de esterilización 1 L de vacío y se almacenan a 4 ° C protegido de la luz para un máximo de 2-3 meses. NOTA: Consulte las tablas 1 y 2 para el reactivo completa, herramientas, consumbles, y la información del equipo. </li></ol></li><li> Preparar poli-L-lisina-tratada placas por disolución de 5 mg de γ-irradiado poli-L-lisina (&gt; 300.000 MW) en 50 ml de agua ultrapura estéril. Mezclar suavemente por inversión durante 10 minutos a temperatura ambiente, asegurando la plena disolución de polímeros de lisina. </li><li> Pipetear la cantidad necesaria de solución de poli-L-lisina en cada pocillo, según el tipo de placa (Tabla 3). Permitir placas en reposo en campana de flujo laminar durante 5 minutos. </li><li> A continuación, eliminar la solución de poli-L-lisina y se lava dos veces con agua estéril. Permitir platos se sequen al aire en la campana de flujo laminar durante 20 minutos. </li><li> Obtener 1 mg de laminina (origen de Engelbreth-Holm-Swarm) y disolver en 50 ml de medio base a una concentración final de 20 mg / ml. Aplique una solución de laminina para placas de cultivo celular de poli-L-lisina tratados en 2 mg / cm 2. (Véase la Tabla 3 para diferentes tamaños de placa) </li><li> Remover con suavidad la solución para garantizar full y cobertura. Sellar las placas con cinta de laboratorio y colocar en la incubadora durante 24 horas. La incubadora debe ajustarse a la temperatura adecuada para las especies que se utilizan (véase el cuadro 7), y no hay gases adicionales deben agregarse a la incubadora. NOTA: La laminina se debe permitir que se adhieran a las placas durante 24 horas antes de la siembra de células. El no hacerlo resultará en malas o ninguna adherencia de las células. </li><li> Preparar los medios de comunicación como se describe en la Tabla 4. Medios de comunicación completa se prepara mejor el día de uso. </li><li> En preparación para el aislamiento de los tejidos, juntad a los siguientes artículos y autoclave: 300-500 vaso (s) ml; platos de Petri de vidrio; bisturí maneja; fórceps (fino y grueso); tijeras de disección; y varias hojas de papel autoclave de repelente de agua. NOTA: Por cada persona que ayuda con el proceso de disección, (2) los mangos de bisturí, (1) pinzas (tipo dependiendo de la preferencia personal), (1) tijeras de disección, y (5-10) hojas de papel autoclave repelente al agua sonsuficiente. </li><li> Además de los elementos tratados en autoclave anteriores, montar etanol al 70%, el equilibrio de peso, tubos cónicos de 50 ml estériles (el número depende del tamaño de la cultura), y el hielo. </li></ol> 2. Disección de tejido <ol><li> Antes de empezar, asegúrese de que una población suficiente de pescado disponible. NOTA: La edad de los peces que se utilizará es de importancia crítica. Mientras que los peces de dos especies diferentes pueden ser de un peso similar, un pez más joven de una especie poseerá más PSM que un pez mayor de otra especie. Como regla general, los peces más jóvenes, sobre todo cuando se trabaja con los salmónidos, son los mejores. Para danionins, peces tan viejos hasta un año se puede utilizar de manera óptima, mientras que los salmónidos de edad de 4-6 meses de edad o menos (hasta 15 g) son óptimos. </li><li> Para cada 5 g de tejido a ser disecado, alícuota de 25 ml de medio de aislamiento en un tubo cónico de 50 ml estéril. </li><li> Pesar, masa de grabación, y el número del tubo (s). Coloque los tubos en hielo. </li><li> La eutanasia a los peces 2-3a la vez por inmersión en&gt; 300 mg / L de bicarbonato de sodio tamponada con tricaína metanosulfonato. Permitir movimiento opercular cesar durante&gt; 5 minutos y luego sumergir los peces en etanol al 70% (contenido en los recipientes estériles) durante 30 segundos. </li><li> Retire el pescado de etanol al 70% y colocar sobre papel autoclave repelente al agua. Directamente detrás de los opérculos, utiliza un bisturí para hacer una incisión superficial y poco profundo. Quite las escamas y la piel sujetando la piel en la incisión antes mencionado y tirar hacia la cola de pescado. </li><li> Después de la eliminación de la piel, cortar el epaxial, rápido-glucolítica muscular &quot;blanca&quot; de los peces de ambas partes (evitando el músculo lento oxidativo &#39;roja&#39; se encuentra cerca de la línea lateral) y el lugar en medio de aislamiento. Desechar el resto de los peces como es requerido por la institución. Células Aunque es perfectamente posible PSM cultura procedentes de músculo rojo, casi cada publicación mediante teleósteos PSM ha utilizado aislados del m epaxial: NOTAyotome. </li><li> Repetir los pasos 2.4 a 2.6 hasta que se obtiene una cantidad suficiente de músculo. Durante la disección, asegurar que el tejido muscular agrupada permanece en hielo para mantener la viabilidad celular. </li></ol> 3. Disociación mecánica <ol><li> Vierta un tubo de 25 ml / 5 g de tejido muscular en una placa de Petri de vidrio. Usando dos bisturí maneja con adjuntos # 10 hojas de bisturí, tejido picada a una suspensión o puré de consistencia. Una moción &quot;ida y vuelta&quot; de tirar las hojas de bisturí más allá de uno que funciona mejor. NOTA: Si bien homogeneizadores de tejidos pueden parecer apropiado, el número de células viables se reduce dramáticamente, si no abolida. </li><li> Usando una pipeta serológica de 25 ml y pipeta serológica, eliminar el tejido se suspendió y reemplazar en el tubo cónico originales. </li><li> Repetir los pasos 3.1 a 3.2 hasta que todo el tejido en todos los tubos se ha disociado mecánicamente. </li><li> Tejido Centrifugar durante 5 minutos a 300 x g y 10 º C. </li><li> Folldebido centrifugación, desechar los 25 ml de sobrenadante de medios con una pipeta de 25 ml serológica, aspirador de vacío, o mediante una cuidadosa decantación. </li><li> Añadir 25 ml de medio de lavado a cada tejido de las trompas, resuspender y centrifugar como anteriormente. </li><li> Lavar dos veces con medio de lavado, eliminar el sobrenadante cada vez. </li></ol> 4. Disociación enzimática <ol><li> Durante el paso 3.4, preparar la solución de colagenasa combinando 0,22 g de colagenasa tipo IV y 44 ml de medio de base (o la cantidad suficiente a 0,11 g/0.22 ml). </li><li> Mezcle en un vaso de precipitados durante 10-15 minutos a 4 ° C. Filtro de esterilizar con una jeringa de 50 ml y un filtro de jeringa de 0,45 micras. NOTA: Es posible que se necesite más de un filtro de jeringa, dependiendo de la preparación de colagenasa. La colagenasa obtenidos de proveedores distintos de Worthington Biochemical plantea más dificultades durante la filtración. La colagenasa se utiliza para disociar los enlaces peptídicos en el colágeno que constituye el endomisio. Estedigestión eliminará la barrera protectora de las fibras musculares. </li><li> Por cada gramo de tejido muscular, tejido resuspender en una solución de colagenasa 0,2%. Para 5 g de tejido muscular, añadir 10 ml de solución de colagenasa y 15 ml de medio base. </li><li> Añadir 10 l de FDP por ml de solución del medio de colagenasa / base (por ejemplo 250 l a 25 ml). Asegúrese de que el tejido está bien suspendido, ya que esto puede afectar a la eficiencia de la digestión enzimática. </li><li> Incubar el tejido muscular en la colagenasa durante 60 minutos a 18 ° C con agitación suave. Dependiendo del grado de disociación y especies mecánica, digestión con colagenasa puede extenderse a 90 minutos, aunque esto puede afectar la viabilidad celular. </li><li> Después de tubos de digestión colagenasa, cónicas centrifugar a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender el tejido en 25 ml de medio de lavado. </li><li> Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 126; C. Repita con el medio de lavado por segunda vez. </li><li> Después de lavar dos veces el tejido, el tejido muscular se vuelve a suspender en 25 ml de medio de lavado y se tritura con una pipeta serológica de 10 ml hasta que el tejido / homogeneizado medio pasa dentro y fuera de la pipeta con relativa facilidad. 5-10 trituraciones suele ser suficiente. <ol><li> Repita con una pipeta serológica de 5 ml y luego una cánula de metal de calibre 16 unida a una jeringa. </li></ol></li><li> Tubos de centrífuga cónicos a 300 xg durante 5 minutos a 12 ° C. Decantar el sobrenadante. </li><li> Durante la centrifugación por encima de 5 minutos, preparar la solución de digestión con tripsina mediante la combinación de 0,25 g de tripsina con 5 ml de medio base. </li><li> Se agita a 4 ° C durante 10-15 minutos y esterilizar por filtración con una jeringa de 20 ml y 0,45 micras filtro de jeringa. </li><li> Recuperar tubos cónicos y añadir 100 ml de solución de tripsina y 4,9 ml de medio de disociación para cada 1 g de tejido muscular a cada tubo. Para example, añadir 500 l de solución de tripsina y 24,5 ml de medio de disociación a 5 g de tejido muscular. NOTA: La tripsina es una proteasa serina que separar células precursoras miogénicas de la lámina basal. </li><li> Resuspender el tejido en el tripsina / pocillo de medio de disociación. Incubar durante 20 minutos a 18 ° C. </li><li> Después de la primera incubación con tripsina, tubos cónicos de centrífuga a 300 xg durante 1 min a 12 ° C. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la combinación de los sobrenadantes con medio de aislamiento a una concentración de 1 volumen de sobrenadante a 4 volúmenes de medio de aislamiento. Almacenar a 4 ° C durante la segunda digestión con tripsina. </li><li> Para el sedimento restante de tejido, repita los pasos 4.12 a 4.15, combinando el sobrenadante después de la etapa de 4,15 con el medio sobrenadante / aislamiento de la primera digestión con tripsina. </li><li> Alternativa: Las digestiones de colagenasa y tripsina se pueden combinar para maximizar los rendimientos celulares. &lt;ol&gt; <li> Para hacer esto, tritura el colagenasa digerir usando una cánula de metal (6 en longitud y el calibre 16 que funciona mejor) unido a una jeringa de 20 ml hasta que el homogeneizado pasa fácilmente a través de la cánula. </li><li> Para el homogeneizado, añadir 500 l de solución de tripsina (preparado en el paso 4,10) y se incuba a 18 ° C durante 20 minutos. </li><li> Siguiendo los tubos de incubación, cónicas centrifugar a 300 xg durante 1 minuto a 12 ° C. </li><li> Neutralizar la tripsina mediante la combinación de los sobrenadantes con medio de aislamiento a una concentración de 1 volumen de sobrenadante a 4 volúmenes de medio de aislamiento. </li><li> Almacenar a 4 ° C durante la segunda digestión con tripsina. </li><li> Continúe con el punto 4.18 al igual que con el protocolo estándar. </li></ol></li><li> Vierta la mezcla de medio sobrenadante / aislamiento final en tubos de 50 ml cónicos y centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 12 ° C. </li><li> Retirar los sobrenadantes teniendo cuidado de no alterar la célulapellets. Pipetear 2 ml de medio completo en cada tubo, disolución cada sedimento celular. </li><li> Combinar las células en suspensión en medio completo en un tubo cónico de 50 ml. </li><li> Enjuague con cada tubo 1 ml de medio completo, con la combinación de la piscina de células resuspendidas previamente. </li><li> Se tritura con una cánula de metal y jeringa 5-10 veces. </li><li> Filtrar la suspensión celular a través de un filtro de 100 micras de células, aclarando con medio completo. </li><li> Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 40 micras. </li><li> Añadir medio completo suficiente para 50 ml y centrifugar a 300 xg durante 10 minutos a 15 ° C. </li></ol> 5. Contar, dilución y siembra de células <ol><li> Después de la centrifugación final en el paso 4,25, eliminar el sobrenadante por decantación o cuidado con una pipeta serológica. Resuspender el sedimento de células en 5 ml de medio completo. </li><li> Con las células se volvieron a suspender totalmente, retire 20 l; De la suspensión celular y colocar en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 5 l de colorante azul de tripano y espere 5 minutos. El uso de un hemocitómetro, determinar el número de células viables. </li><li> Tras la determinación, diluir las células a la concentración necesaria. Teleost PSM están mejor sembró a 150.000-200.000 células por cm 2. Para que una estrategia de seis pocillos chapado, diluyendo las células de 1,5 x 10 6 - 2,0 x 10 6 por ml apoya la proliferación y diferenciación suficiente. </li><li> Recuperar poli-L-lisina tratados, placas recubiertas con laminina y células de semillas. (Véase la Tabla 5 para las diluciones de placa específica y volúmenes de galvanoplastia.) NOTA: Tabla 6 representa el número promedio de células aisladas por gramo de tejido muscular aislado a partir de diversas especies de teleósteos. Trucha arco iris (O. mykiss) presentan un menor número de países socios mediterráneos por gramo de tejido muscular que hacer el pez cebra (D. rerio) y por lo tanto requieren más pescado para aislar a partir de la siembra adecuada. </li><li> Sellar las placas con cinta de laboratorio y colocar en la incubadora de enfriamiento a la temperatura adecuada. PSM de todas las especies incluidas aquí (salvo para los ratones) pueden incubar en condiciones atmosféricas normales, sin dióxido de carbono (CO 2) de la suplementación. (Véase el cuadro 7.) </li><li> ALTERNATIVA: Algunos laboratorios han adoptado un protocolo que pide permitiendo PSM a adherirse a los sustratos de cultivo durante 40 minutos. <ol><li> Luego enjuague placas con medio de lavado para eliminar las células poco adheridas y no adheridas. Advertencia: Este paso es muy importante para evitar la adhesión &quot;no específica&quot; de otras células (fibroblastos) de los sustratos de cultivo. </li><li> Añadir medio completo y las células de lugar en la incubadora y cuidar como se detalla a continuación. </li></ol></li></ol>

No hay nada que revelar.

El programa miogénica, en el que las especies examinadas, se puede estudiar más fácilmente a través de un sistema in vitro. De hecho, después del aislamiento, las células precursoras miogénicas (PSM) en el pescado o células myosatellite (MSC) en mamíferos entran fácilmente este proceso altamente regulado que implica la proliferación, la retirada del ciclo celular, y la diferenciación terminal de los mioblastos y la fusión de los mioblastos en miotubos nacientes. La falta general de cepas transgénicas gen report...

Entendimiento considerable de miogénesis mamíferos se ha obtenido a través de la recapitulación de este proceso en los dos cultivos de mioblastos de ratón primario (Mus musculus) y la línea celular derivada de ratón bien descrito, C2C12 5. A partir de la década de 1950 6, estas culturas han dado lugar a mucho progreso en la comprensión del programa murinemyogenic y, por extensión, la miogénesis en otros vertebrados. Además, una sola célula de las técnicas de miofibras de explantes han aumentado a cabo comprensión de las interacciones entre las células satélite y miofibras que rodean 7-9. Los cultivos celulares son particularmente atractivos para las investigaciones de la miogénesis debido al corto tiempo de precursor de célula diferenciada 10, relativa facilidad de la transfección para ARNi 11-14, transgénico 15,16 y sobreexpresión estudios 14,17,18, la expansión in vitro seguida de trasplante in vivo 18-20, e incluso un borradorarison de células precursoras miogénicas y sus agentes reguladores de todo taxa 21,22. Mientras que las diferencias debido a la ambiente artificial del sistema de cultivo han sido descritos 5,23, estos sistemas in vitro han demostrado ser indispensable para nuestra disección del programa intrincada que rige la formación de multinucleadas, myofibersfrom diferenciación terminal mononucleadas células progenitoras proliferativas conocidas como myosatellite células (MSC) entre los mamíferos. Fuera de la clase de los mamíferos, sin embargo, la conservación y / o divergencia de los mecanismos que controlan la miogénesis, son poco conocidos, en gran parte debido a la dificultad en el cultivo de células precursoras miogénicas (PSM) y mioblastos de varios taxones. De hecho, cultivos de mioblastos primarios sólo se han descrito en tres aves 24-26, un reptil 27, un par de anfibios 28-30, y algunos peces 1,3,4,31-33. Continuas líneas de células miogénicas de VErtebrates distintas de roedores 34-36 son aún más raros, con la única línea que no sean mamíferos miogénica de células que se deriva de la codorniz japonesa (Cortunix japonica), QM7 37. A pesar de muchos intentos de inmortalización, una línea celular miogénica teleósteos sigue siendo difícil de alcanzar y un protocolo para la transfección eficiente de estas células sólo se publicó este año 15. Por lo tanto, los protocolos claros y bien optimizados para el cultivo de los PSM primarias y mioblastos a partir de una variedad de vertebrados son muy necesarias, no sólo para ampliar aún más nuestro conocimiento de la evolución del programa miogénico, pero para emplear el poder de la fisiología comparada a hacer avances en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético y trastornos humanos. Mientras que la literatura contiene muchos informes de aislamiento MPC / mioblastos 38-49, es común que los autores describen los protocolos para estos aislamientos en breves, a menudo incompletos, formatos. Además, los protocolos más instructivas reportorted se han desarrollado para los ratones 50-53, y algunos de ellos dependen de la selección de anticuerpos 54,55 o 56,57 transgenes de fluorescencia, por lo que estos protocolos inutilizable o especie no roedora más íntimos poco prácticos utilizados por los biólogos musculares. Con poco conocido sobre piscine, anfibios y reptiles miogénesis, un protocolo detallado y minucioso, que se describe con la guía audiovisual y con una eficacia demostrada en especies alejadas, sería más útil para el campo. Descrita por primera vez por Powell y sus colegas en 1989 58, el siguiente protocolo fue desarrollado inicialmente para aislar PSM y mioblastos de salmónidos (a saber, la trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, y el salmón del Atlántico, Salmo salar) y algunos ciprínidos grandes (es decir, peces de colores, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau y Paboeuf optimizan una cultura de mioblastos primarios para la trucha arco iris 59 y minoroptimizations made ese protocolo utilizable en varios pececillos pequeños del clado Danioninae (pez cebra, Danio rerio, y danio gigante, Devario aequipinnatus) 32 debido a las muchas herramientas genéticas disponibles para el trabajo de pez cebra y por lo tanto sus familiares cercanos. Peces teleósteos son organismos atractivos para el estudio debido a su estrategia de crecimiento divergente (al menos en la mayoría de las especies). Las grandes salmónidos, como la mayoría de los peces, crecen indeterminadamente, con potencial de crecimiento sin restricciones de una asíntota en la madurez, incluso en edad 60-62 años. A diferencia de pez cebra, grandes danionins como el danio gigante 63 y potenciales de crecimiento display danio bigotudos típicas de los peces teleósteos, por lo que su yuxtaposición directa en una plataforma ideal para la comprensión de si la elección del destino celular MPC juega un papel en la hiperplasia del músculo esquelético en comparación con la hipertrofia. Asimismo, hemos demostrado que este protocolo se puede utilizar con ratones y ajolotes, con rendimiento relativamente alto de células y VIABíndices LIDAD. Salamandras urodele, como el ajolote mexicano (Ambystomamexicanum), poseen la notable capacidad de regenerar los tejidos, incluyendo las extremidades y la cola 64-66 enteras. Esta característica hace que estos anfibios interesantes modelos de pérdida de músculo esquelético y el envejecimiento. Utilizando el protocolo descrito a continuación, un enfoque similar puede llevarse a cabo como se ha hecho en muchas especies de peces, proporcionando un contexto comparativo aún más amplia para tales estudios. Como muchos biólogos verdaderamente aprecian comparativos, los avances más significativos en la biología básica y la biomedicina traslacional se pueden hacer cuando se analizan los datos dentro del más amplio espectro (en este caso, todo el linaje de vertebrados).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabla 1. Información detallada sobre reactivos</td></tr><tr>Compañía de<td>reactivos</td><td>(preferida vs. alternativa)</td><td>Número de catálogo (preferida vs. alternativa)</td><td>Cantidad por cultivo</td></tr><tr><td>&gamma;-poli-L-lisina irradiada</td><td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td><td>P5899 (ICN19454405)</td><td>5 mg</td></tr><tr><td>DMEM (glucosa alta)</td><td>Sigma-Aldrich (celular)</td><td>MT-50-003-PB (D7777)</td><td>2 L</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>BD Biosciences ( Sigma-Aldrich)</td><td>CB-40232 (L2020)</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP328-500 (S5761)</td><td>1,51 g</td></tr><tr><td>HEPES (C8H18N2O4S)</td><td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>BP310-1 (H6147)</td><td>9,53 g</td></tr><tr><td>Antibiótico/Antimicótico</td><td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SV3007901 (A5955)</td><td>17-20 mL</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td><td>BW17-519Z (G1397)</td><td>2-3 mL</td></tr><tr><td>Donante Equino</td><td>Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007403 (H1270)</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>Fetal Bovino</td><td>Sera Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td><td>SH3007103 (F2442)</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Colagenasa (Tipo IV)</td><td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td><td>LS004189 (C9891)</td><td>0.44 g</td></tr><tr><td>Tripsina (del páncreas)</td><td>MP Biomédica (Sigma-Aldrich)</td><td>ICN15357125 (T5266)</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 2. Consumibles, herramientas y equipos</td></tr><tr><td>Equipo de</td><td>herramientas</td><td></td><td></td>consumibles</tr><tr><td>Placas de cultivo celular</td><td>Pinzas (gruesas)</td><td>Pipeta</td><td></td>serológica</tr><tr><td>estéril 50 mL Tubos cónicos Pinzas</td><td>(finas)</td><td>Medidor</td><td></td>de pH</tr><tr><td>Cinta de laboratorio Mangos</td><td>de bisturí Incubadora</td><td>de enfriamiento (Echotherm)</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Sistemas de esterilización al vacío</td><td>Hojas de bisturí (#10, #11)</td><td>Campana de flujo laminar Autoclave</td><td></td></tr><tr><td>repelente al agua</td><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Colector</td><td></td>de vacío</tr><tr><td>Pipetas serológicas Pipetas</td> de <td>vidrio Placas de Petri de vidrio</td><td>Medidor de microosmolalidad Cánulas</td><td></td></tr><tr><td></td><td>de 12-16 g con cerraduras</td><td></td><td></td> Luer</tr><tr><td colspan="4">Tabla 3. Volúmenes optimizados para el recubrimiento de placas de cultivo celular Tamaño de la</td></tr><tr><td>placa</td><td>cm^2 por pocillo</td><td>Poli-L-lisina*</td><td>*Laminina**</td></tr><tr><td>6 pocillos</td><td>: 9,5</td><td>1,6 mL</td><td>1</td></tr><tr><td>24 pocillos</td>: <td>1,9</td><td>0,32</td><td>0,2</td></tr><tr><td>48 pocillos</td>: <td>0,95</td><td>0,16</td><td>0,1</td></tr><tr><td>96 pocillos</td>: <td>0,32</td><td>0,06</td><td>0,03</td></tr><tr><td>*0,1 mg/mL Concentración</td><td>** 0,020 mg/mL Concentración</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 4. Medios para aislamiento, disociación y cultivo</td></tr><tr><td>Reactivo</td><td>de aislamiento</td><td>Lavado</td> Base <td>de disociación</td></tr><tr><td>Medio</td><td>419.25 mL</td><td>395.40 mL</td><td>297.00 mL</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina**</td><td>0.75 mL</td><td>0.60</td> <td>mL-Suero</td></tr> <tr><td>equino donante</td><td>75.00 mL</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino***</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>* PSF: cóctel de penicilina/estreptomicina/fungizona (100x); ** Concentración de 50 mg/mL; Caracterizado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 5. Diluciones recomendadas y volúmenes de recubrimiento Tamaño de la</td></tr><tr><td>placa</td><td>cm^2 por pocillo</td><td>Dilución</td><td>Volumen de recubrimiento</td></tr><tr><td>6 pocillos</td><td>9.5</td><td>1.5-2.0x10^6 células/mL</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>24 pocillos</td><td>1.9</td><td>1.5-2.0x10^6 células/mL</td><td>250 &mu; L</td></tr><tr><td>48 pozo</td><td>0,95</td><td>1,5-2,0x10^6 células/mL</td><td>150 &mu; L</td></tr><tr><td>96 pocillo</td><td>0,32</td><td>1,5-2,0x10^6 células/mL</td><td>50-100 &mu; L</td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 6. Promedio de células por g de tejido</td></tr><tr><td>Especie</td><td>Promedio # células/g de tejido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio</td><td>6.400.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danio dangila</td><td>1.783.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Devario aequipinnatus</td><td>1.797.000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>66.800</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 7. Temperaturas de incubación recomendadas</td></tr><tr><td>Temperatura</td><td></td><td></td>de<td>la especie</td></tr><tr><td>Danio/ Devario spp.</td><td>26 - 28 &deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oncorhynchus/Salmo spp.</td><td>10* - 18 &deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambystoma mexicanum</td><td>18&deg; C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>* Las temperaturas más bajas favorecen tasas de proliferación más bajas.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de primaria myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales vertebrados linajes

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Debido a la dificultad y el tiempo inherente implicado con estudiar el programa miogénico in vivo, los sistemas de cultivo primarios derivados de las células madre adultas residentes de músculo esquelético, las células precursoras miogénicas (PSM), han demostrado ser indispensable para nuestra comprensión del desarrollo del músculo esquelético de mamíferos y crecimiento. Particularmente entre los taxones basal de vertebrados, sin embargo, los datos son limitados describir los mecanismos moleculares que controlan la auto-renovación, la proliferación y diferenciación de los PSM. De particular interés son los posibles mecanismos que subyacen a la capacidad de los vertebrados basales a someterse considerable postlarvas miofibra hiperplasia esquelético (es decir, peces teleósteos) y la regeneración completa tras la pérdida apéndice (es decir urodelos anfibios). Además, el uso de mioblastos cultivados podría ayudar en la comprensión de la regeneración y la recapitulación del programa miogénico y las diferencias entre ellos. Aello, se describe en detalle un protocolo robusto y eficiente (y sus variaciones) para aislar y mantener PSM y su progenie, mioblastos y miotubos inmaduros, en cultivo celular como una plataforma para la comprensión de la evolución del programa miogénico, comenzando por el más vertebrados basales. Aprovechando la situación organismo modelo del pez cebra (Danio rerio), informe sobre la aplicación de este protocolo para pequeños peces del clado ciprínidos Danioninae. A la par, este protocolo puede utilizarse para realizar un enfoque comparativo más amplio mediante el aislamiento de los PSM del ajolote mexicano (Ambystomamexicanum) e incluso roedores de laboratorio. Este protocolo se utiliza ampliamente en el estudio de la miogénesis en varias especies de peces, como la trucha arco iris, el salmón, el besugo y 1-4.

Veinticuatro horas después de la siembra, las células precursoras miogénicas (PSM) deben ser visibles adjunto al sustrato de laminina (véanse las figuras 1a y 1d). Después de la siembra, las células (PSM) adoptan una forma de tipo huso, indicativo de este tipo de células (Figura 1) y son MyoD1 + (Figura 2). En las especies Danio, PSM parecen ser más compacto con procesos bipolares más pequeños que hacen PSM de especie Oncorhynchus y <e...

El cultivo in vitro sistemas han demostrado ser indispensables para nuestra comprensión de la miogénesis de vertebrados. Sin embargo, queda mucho por aprender sobre el desarrollo del músculo esquelético no mamífero y el crecimiento, en particular en los taxones basal. Un protocolo eficiente y robusto para el aislamiento de las células madre adultas de este tejido, las células precursoras miogénicas (PSM), y el mantenimiento de su auto-renovación, la proliferación y la diferenciación en un entorno de cultivo primario permite la identificación de los mecanismos de regulación conservados y divergentes a lo largo los linajes de vertebrados.

Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

El objetivo general de este procedimiento es cultivar células precursoras miogénicas de teleósteos para que realicen miogénesis in vitro. Esto se logra primero mediante la disección del músculo epaxial del organismo. El segundo paso consiste en disociar mecánicamente el tejido aislado.A continuación, el tejido se disocia enzimáticamente para dispersar las células deseadas. El paso final consiste en sembrar las células precursoras miogénicas aisladas sobre un sustrato de Laminina. En última instancia, in vitro.La miogénesis se utiliza para mostrar los efectos de diversos tratamientos sobre los cambios en la regulación y expresión génica, la expresión de proteínas y las alteraciones del fenotipo celular. Este video demostrará cómo establecer un sistema de cultivo primario a partir de células precursoras miogénicas de teleósteos. La demostración visual de esta técnica es fundamental, ya que algunos de los pasos de disociación pueden ser difíciles de aprender.La disociación adecuada y correcta es fundamental para aislar un pellet celular suficiente para el cultivo posterior. Para comenzar, prepare todos los medios y soluciones necesarios para el procedimiento. A continuación, reúna los elementos adicionales necesarios para el aislamiento del tejido.Esterilización previa en autoclave cuando sea necesario. Asegúrese de preparar materiales adicionales para cada persona que colabore en el proceso de disección. Otros artículos que deben tenerse a mano incluyen etanol al 70 %, una balanza estéril, tubos cónicos de 50 mililitros y hielo por cada cinco gramos de tejido que se vaya a disecar.Aliquotar 25 mililitros de medio de aislamiento en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Después de pesar y registrar el número de masa, coloque los tubos sobre hielo. Cuando esté listo, obtenga un pez para usar en la disección del tejido y sumérjalo en etanol al 70 % durante 30 segundos antes de colocarlo sobre papel autoclave repelente al agua directamente detrás de la erla; use un bisturí para hacer una incisión superficial y poco profunda, agarre la piel en la incisión y tire hacia la cola para retirar las escamas y la piel.A continuación, extirpe el músculo blanco rápido glucolítico del pez de ambos lados, evitando el músculo rojo oxidativo lento ubicado cerca de la línea lateral. Coloque el músculo en el medio de aislamiento y deseche el resto del pez.Continúe recolectando tejido hasta obtener una cantidad suficiente de músculo durante la disección; asegúrese de mantener el tejido muscular recolectado en hielo para preservar la viabilidad celular. Para comenzar, vierta un tubo de tejido muscular en una placa de Petri de vidrio. Utilice dos escalpelos con un movimiento de vaivén para picar el tejido hasta que la suspensión de tejido pueda retirarse fácilmente.Con una pipeta de 25 mililitros, coloque la suspensión de tejido nuevamente en su tubo original. Repita estos pasos hasta que todo el tejido se haya disociado mecánicamente. Una vez que todo el tejido haya sido procesado, centrifugue durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y lave el tejido con medio fresco antes de una nueva ronda de centrifugación.Una vez lavado completamente, resuspenda el tejido e incúbelo con la solución de colagenasa durante 60 minutos a 18 grados Celsius con agitación suave. Al final de la incubación, centrifugue los tubos para obtener el sedimento celular. Después de lavar dos veces, resuspenda el tejido en medio de lavado.A continuación, triture el homogenato de tejido hasta que pase con relativa facilidad hacia dentro y hacia fuera de una pipeta de 10 mililitros. Repita este proceso con una pipeta de cinco mililitros y luego nuevamente con una cánula metálica de calibre 16 acoplada a una jeringa. Una vez homogenizado completamente, forme un pellet del tejido y deseche el sobrenadante.Re-suspender el tejido por triplicado en medio de disociación e incubar durante 20 minutos a 18 grados Celsius. Posteriormente, colocar los tubos en la centrífuga para una breve centrifugación. Decantar el sobrenadante en cuatro volúmenes iguales de aislamiento.Medio que se almacenará a cuatro grados Celsius al pellet restante. Repita los pasos de centrifugación y disociación recién demostrados y combine el sobrenadante resultante con el recolectado previamente.Dispensar la mezcla final en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugar. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perturbar la célula. Con una pipeta, agregar dos mililitros de medio completo en cada tubo.Para disolver, combine las células resuspendidas en un tubo cónico de 50 mililitros. Enjuague cada tubo con un mililitro de medio completo. Añada el enjuague al grupo de células resuspendidas.Triture el tejido con una cánula metálica y una jeringa de cinco a 10 veces. Después de filtrar la suspensión celular, agregue una cantidad suficiente de medio completo para completar 50 mililitros y centrifugue. Recupere las células, elimine el sobrenadante y agregue cinco mililitros de medio completo.Una vez resuspendido, retire una pequeña muestra para determinar el número de células viables. Utilizando un hemocitómetro, retire la solución de laminina de las placas tratadas con poli-L-lisina.Después de diluir las células a la concentración necesaria, siémbrelas en las placas preparadas y séllelas. Coloque las placas selladas en un incubador refrigerado ajustado a la temperatura adecuada. Veinticuatro horas después de la siembra, las células precursoras miogénicas o MPC deben estar visiblemente adheridas al sustrato de laminina, mientras que originalmente aparecían más compactas.Las MCP de pez cebra adoptan morfologías similares a las de la trucha arcoíris. Durante cuatro días de cultivo, se deben formar túbulos miógenos entre los seis y nueve días de cultivo. En cultivo, se ha demostrado que las MCP y los mioblastos expresan myo D uno.A medida que los mioblastos se diferencian en tubos miotubulares, comenzarán a expresar miosina. Estos datos muestran la proliferación celular durante el cultivo mediante la incorporación de BRDU. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y cultivar.Células precursoras miogénicas de diversas especies de peces tras su desarrollo inicial en células Monets. Esta técnica allanó el camino para que investigadores en biología muscular exploraran nuevas vías en biología muscular y en otros organismos telóstomos como los danios, así como en otros anfibios como Axel.Lots.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Tejido muscular Engineered tiene un gran potencial en medicina regenerativa, como modelo de la enfermedad y también como una fuente alternativa para la carne. Aquí se describe la ingeniería de una construcción de músculo, en este caso a partir de células progenitoras de mioblastos de ratón y la estimulación por impulsos eléctricos.

Los tejidos de ingeniería músculo esquelético de células mioblastos murinos progenitoras y aplicación de estimulación eléctrica

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Este protocolo describe técnicas para el aislamiento de células vivas y el cultivo primario de líneas celulares miogénicas y fibroblastas a partir de tejido muscular o cutáneo.  También se describe una técnica para la inmortalización de estas líneas celulares.  En conjunto, estos protocolos proporcionan una herramienta fiable para generar y preservar células derivadas de pacientes para aplicaciones posteriores.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

Aquí, describimos los ajustes para monitorear en paralelo la bioluminiscencia circadiana y la actividad secretora de las células de los islotes humanos y los miotubos primarios. Para ello, empleamos la administración de genes lentivirales de un indicador de reloj central de luciferasa, seguido de sincronización in vitro y recolección del medio de salida por perifusión celular continua.

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Este protocolo describe un método robusto, reproducible y simple de aislamiento y cultivo de células de mioblastos progenitoras del músculo esquelético de adultos y personas de edad avanzada. Los músculos que se usan aquí incluyen los músculos del pie y de la pierna. Este enfoque permite el aislamiento de una población enriquecida de mioblastos primarios para los estudios funcionales.

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

Diferenciación del músculo esquelético es un proceso altamente dinámico, que particularmente se basa en posición nuclear. Aquí, describimos un método para seguir los movimientos de los núcleos de proyección de imagen de vivo de la célula durante la diferenciación y myotube formación de mioblastos y se realiza una caracterización cuantitativa de la dinámica de los núcleos de extracción de información de seguimiento automático.

Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.

Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón

El músculo esquelético comprende múltiples tipos de células, incluidas las células madre residentes, cada una con una contribución especial a la homeostasis y regeneración muscular. Aquí, se describe el cultivo 2D de células madre musculares y el nicho de células musculares en un entorno ex vivo que conserva muchas de las características fisiológicas, in vivo y ambientales.

Cultivo masivo no fraccionado de músculo esquelético de ratón para recapitular la quiescencia de nicho y de células madre

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Aprende a cultivar células precursoras miogénicas de teleósteos para estudiar miogénesis in vitro mediante disociación mecánica y enzimática de músculo epaxial. Este protocolo permite analizar la regulación génica y la diferenciación celular en vertebrados no mamíferos.

Preparación de Primaria Myogenic precursor de célula / cultivos de mioblastos de basales Vertebrados Linajes

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