Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

El objetivo general de este procedimiento es estudiar el perfil metabólico en células cultivadas. Esto se logra extrayendo primero los metabolitos polares de las células. El segundo paso es reconstituir los extractos celulares en agua y transferir las muestras a viales de lc.

A continuación, las muestras se inyectan en el instrumento lc QE MS, que ha sido calibrado y los datos brutos se registran en el ordenador en el paso final. Los picos de metabolitos se extraen de los datos brutos utilizando software comercial, y los picos desconocidos se buscan en una base de datos masiva de alta resolución. Aunque este máster puede proporcionar información sobre los niveles relativos de metabolitos en el sars, también se puede aplicar a otros sistemas como el suero o los tejidos.

Primero, prepare 500 mililitros de fase A móvil, que es acetato de amonio de 20 milimolares e hidróxido de amonio de 15 milimolares en aceto, nitrilo y agua al 3%. Después de tapar sin apretar la botella, sonique la solución en un baño de agua durante 10 minutos sin calentar. Después de esto, disuelva cinco miligramos de fluoroacetato de sodio y ácido en cinco mililitros de agua para hacer una concentración final de un miligramo por mililitro.

Luego disuelva el diazinón en metanol para hacer una concentración final de 10 microgramos por mililitro. Para preparar un mililitro de solución negativa de calibración de baja masa, mezcle 960 microlitros de solución de calibración termonegativa con 20 microlitros de solución de acetato de fluoro de sodio y ácido homovanílico. Para hacer un mililitro de solución positiva de calibración de baja masa, mezcle 990 microlitros de solución de calibración termopositiva y 10 microlitros de solución de diazinón.

Después de realizar una calibración de masa estándar en modo positivo, ajuste el rango de escaneo a una relación masa-carga de 60 a 900 en el panel de control del instrumento y aplique una disociación inducida por colisión de fuentes de 25 electronvoltios. Ingrese iones de calibración personalizados y, una vez que la fuente de iones esté estable, inicie la calibración personalizada en la página de sintonización. Cambie la polaridad al modo negativo después de realizar una calibración de masa estándar en modo negativo, ajuste el rango de escaneo a una relación masa-carga de 60 a 900 en el panel de control del instrumento y aplique una disociación inducida por colisión de fuente de 35 electronvoltios.

Ingrese iones de calibración personalizados y, una vez que la fuente de iones esté estable, inicie la calibración personalizada. En la página de afinación, equipe el instrumento QE MS con la sonda de ionización por electropulverización calentada o HESI fijándola en el nivel C y luego conectándola a las entradas de gas nitrógeno, el cable del vaporizador y los cables de voltaje. En la página de ajuste del equipo, establezca los parámetros de ajuste relevantes para la sonda.

Ajuste la temperatura capilar a 320 grados centígrados y la lente S a 55. A continuación, en el programa de métodos, cree un método de análisis completo utilizando los siguientes valores. Establezca el método de cromatografía ingresando la información del gradiente lineal.

Emplee una columna intermedia para la separación de compuestos a temperatura ambiente. En este punto, prepare un solvente de extracción mezclando manualmente 40 mililitros de metanol y 10 mililitros de agua en un tanque de 50 mililitros. Dos. Cuando se cultiva previamente el cáncer de colon H CT, ocho células alcanzan el 80% de confluencia.

Aspire rápidamente el medio y coloque la placa de seis pocillos encima del hielo seco. Luego, agregue inmediatamente un mililitro de solvente de extracción a cada pocillo y transfiera la placa a un congelador negativo de 80 grados centígrados. Después de sacar la placa del congelador, 15 minutos después, colóquela sobre hielo seco y raspe las células en el solvente.

Transfiera la solución de cada pocillo a tres tubos de einor de 1,7 mililitros y centrifugue las muestras a una velocidad de 20.000 veces G a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a dos nuevos tubos de einor. A continuación, seque las muestras en un vacío rápido.

Una vez que las muestras estén secas, guárdelas en el congelador a 80 grados centígrados negativos. Después de sacar las muestras del congelador para su análisis, deje que alcancen la temperatura del hielo. Luego agregue 20 microlitros de agua helada y agite las muestras para disolver los metabolitos.

A continuación, centrifugar las muestras a 20.000 veces G a cuatro grados centígrados. Durante dos minutos, transfiera el SUPERNAT a viales lc e inyecte cinco microlitros de las muestras en el instrumento lc QES para su análisis. Una vez realizada correctamente la calibración en el instrumento QE MS, equilibrar la columna de lc durante cinco minutos con el 85% de la fase B móvil a un caudal de 0,15 mililitros por minuto.

A continuación, configure la secuencia de muestras en un orden aleatorio para distribuir las fluctuaciones introducidas por el LCMS a cada muestra y garantizar una comparación más precisa entre las diferentes muestras. Después de cada seis muestras, agregue una tirada de lavado, seguida de una muestra en blanco para evaluar el fondo del sistema y los niveles de arrastre. Guarde la secuencia e inicie la ejecución de la secuencia.

Una vez que la columna lc muestra una presión estable cercana a 400 PSI, después de que se hayan ejecutado las dos primeras muestras de la secuencia, verifique los picos en estos cromatogramas en busca de metabolitos desconocidos para asegurarse de que la secuencia de muestras funcione sin problemas. Una vez finalizadas todas las muestras de la secuencia, realice el análisis de datos en un equipo independiente. Elija el método de alineación de picos y extracción de marcos para moléculas pequeñas en el software disponible comercialmente.

A continuación, cargue los datos brutos de lc ms y agrúpelos en función de los tipos de muestra. Elija muestras en el medio de la secuencia de ejecución como muestra de referencia de cromatografía para la alineación de picos y elija un grupo como grupo de relación o el cálculo de cambio completo. A continuación, cargue una semilla de fotograma, incluidos los metabolitos conocidos para el análisis de metabolitos objetivo con los datos recopilados y la semilla de fotograma correspondiente.

A continuación, elija el escaneo de espectros completos en modo positivo o negativo y guarde este archivo de procesamiento de datos en la misma carpeta que los datos sin procesar. Desactive la función de búsqueda en la base de datos y ejecute el flujo de trabajo. A continuación, exporte los datos del proceso como una hoja de Excel que contenga el área de picos de cada fotograma.

Para un análisis de metabolitos no dirigido, elija el método de extracción de componentes. Cargue los datos sin procesar de muestra y tres muestras en blanco para la sustracción en segundo plano. Siguiendo este grupo, los datos brutos y establecer las muestras de referencia como se describió anteriormente.

Establezca el umbral del componente en 10 hasta el quinto. Utilice una base de datos de metabolomas humanos para la identificación de compuestos desconocidos. Después de guardar este archivo de procesamiento, desactive la función de búsqueda en la base de datos e inicie el flujo de trabajo.

Una vez finalizado el procesamiento de datos, utilice coeficientes de variación o filtros CV para eliminar los componentes con CV grande dentro de las muestras replicadas y los filtros de intensidad. Para eliminar los componentes detectados a nivel de ruido, revise manualmente cada componente y elija aquellos con un pico bien definido o una diferencia relativamente grande en diferentes tipos de muestras para la búsqueda en la base de datos. Por último, exporte los datos con hits en la base de datos.

La precisión de los datos metabolómicos depende en gran medida del rendimiento del instrumento lc QEMS para evaluar si el instrumento está funcionando en buenas condiciones y si el método aplicado es el adecuado. Varios picos de metabolitos lc conocidos se extraen de la cromatografía iónica total, como se muestra aquí. Los metabolitos polares, incluidos los aminoácidos, la glucólisis, los intermedios, el TCA, los nucleótidos intermedios, las vitaminas A, TP y NADP, tienen una buena retención en la columna y buenas formas de pico en las condiciones actuales de lc.

Mientras tanto, se realiza una prueba de error de masa dentro de las 24 horas posteriores a la calibración de baja masa, como se ilustra. Aquí, el error de masa se evalúa comparando la relación masa-carga detectada con la relación teórica masa-carga de los metabolitos objetivo. En este caso, los metabolitos objetivo tienen una relación masa-carga que oscila entre 74 y 744.

El eje Y aquí representa el porcentaje acumulativo de metabolitos dentro de un cierto rango de error de masa. La curva azul muestra el resultado de cero a 12 horas, mientras que la curva de color rojo muestra los datos recopilados de 12 a 24 horas después de la calibración. Más del 90% de los metabolitos tienen un error de masa de cinco partes por millón, lo que significa que el método de calibración de rango de masa bajo desarrollado aquí es suficiente para mantener un error de masa de cinco partes por millón para la detección de rango de masa bajo.

Otra cuestión que debe abordarse es la sensibilidad del instrumento con el método actual y la configuración del instrumento. Se realizó cinco veces una dilución en serie de muestras de triplicado de una placa de Petri de 10 centímetros con un factor de dilución de seis, lo que dio como resultado seis concentraciones diferentes de muestras. Se utiliza una lista específica para evaluar el número de metabolitos detectados a diferentes concentraciones de muestra.

Los resultados mostrados aquí indican que el número óptimo de metabolitos diana detectados está entre 2,78 veces 10 a la quinta y 1,67 veces 10 a las seis células, mientras que una vez 10 a las siete células da un menor número de metabolitos detectados, lo que se debe a los efectos de supresión de iones. Este resultado indica que la cantidad óptima de células a extraer para este análisis es aproximadamente la de un pocillo en una placa de seis pocillos. Para el análisis de metabolitos no dirigidos, se utiliza un punto de corte CV del 20% y un valor de intensidad promedio de 10 a la séptima para filtrar la tabla de componentes.

Los valores de corte CV se pueden aumentar, mientras que los valores de intensidad promedio deben disminuirse para incluir más picos. Después de verificar manualmente los picos, los componentes con buenas formas se seleccionan y buscan en la base de datos del metaboloma humano. Los resultados de los datos recopilados en modo positivo se enumeran aquí, mientras que los resultados del modo negativo se enumeran aquí. Algunos de los metabolitos identificados aquí se superponen con los metabolitos de la lista objetivo, como el glutatión y la prolina.

También se exploran metabolitos adicionales ausentes de la lista objetivo, como el metilglioxal, que puede derivarse de la glucólisis y un pto, dos ELE SN glicerol, tres fosfocolinas, que se detecta en modo positivo con un tiempo de retención de 3,2 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer polimetabolitos de sars cultivados y luego usar RC QES para medir los niveles metabolizados relativos en diferentes muestras. Gracias por mirar.