El uso de un enlace del sitio Tag α-Bungarotoxina para el Estudio de GABA A receptor de membrana localización y el Tráfico

El objetivo general de este procedimiento es medir la localización de la superficie del receptor gabaa y la endocitosis en las neuronas del hipocampo. Esto se logra seccionando primero las neuronas del hipocampo con la subunidad del receptor gabaa marcada y permitiendo que las neuronas cultivadas se desarrollen en la incubadora. El segundo paso es etiquetar los receptores gabaa de superficie con la matriz fluorescente Alexa acoplada a alfa bungalow toin.

A continuación, las neuronas se incuban en varios puntos de tiempo para permitir que los receptores marcados sean endocitos. El paso final es fijar las muestras en los puntos de tiempo apropiados y realizar una tinción inmunológica utilizando anti GFP para observar el grupo total de receptores marcados. En última instancia, la microscopía confocal se utiliza para mostrar cambios en la localización de la superficie y la endocitosis de los receptores gabaa marcados mediante enfoques de imagen fijos o en vivo.

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo del tráfico de receptores, como qué efecto puede tener la unión de ligandos en la endocitosis del receptor y las tasas de inserción, y si diferentes ligandos y moduladores pueden afectar el reciclaje y la degradación del receptor. Aunque este método se ha utilizado para estudiar los canales iónicos ligados y los receptores acoplados a proteínas G principalmente en el contexto del sistema nervioso, también se puede aplicar para estudiar la localización dinámica y el tráfico de otras proteínas de membrana en cultivos celulares y células primarias de diversos tejidos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades por dos razones.

En primer lugar, para crear constructos funcionales y, en segundo lugar, para procesar la práctica y las experiencias necesarias para procesar varios puntos de tiempo simultáneamente. Para comenzar, prepare cuatro o cinco cubreobjetos redondos de vidrio recubierto de polilisina dentro de cada placa de cultivo de tejidos de 3,5 centímetros como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfecte las neuronas recién disociadas el día del cultivo con uno a cuatro microgramos de una placa de ADN de construcción maxi preparada.

Las neuronas transfectadas en la cubierta recubierta de poli de licina se deslizan a una densidad final de aproximadamente 200.000 neuronas por plato de 3,5 centímetros. Reemplace el medio de cuatro a 24 horas después de la preparación de los cultivos neuronales. Luego permita que las neuronas se desarrollen en la incubadora hasta 14 a 17 días in vitro o la etapa deseada para realizar el ensayo de endocitosis.

Primero configure un dispositivo de calefacción de enfriamiento de sobremesa a 16 grados centígrados. Enfríe montones extracelulares, solución salina tamponada o HBS a 16 grados centígrados en un baño de agua. Transfiera las placas de neuronas a la placa de aluminio a 16 grados centígrados y enfríe durante cinco minutos.

Retire el medio y reemplácelo con un mililitro de HBS de 16 grados centígrados más 150 Micromolares dos Bo Rine durante dos minutos. A continuación, retira el medio y colócalo en un contenedor de residuos etiquetado y sustitúyelo por un mililitro de HBS de 16 grados centígrados más dos de toxina bo kerine más alpha bungalow. Alexa 5 9 4 incubando a 16 grados centígrados durante 15 minutos.

Después de la incubación, transfiera el medio a un contenedor de residuos etiquetado y lave los platos tres veces con dos mililitros de HBS de 16 grados Celsius para experimentos de series temporales de imágenes en vivo después de la endocitosis del receptor utilizando una placa de cultivo de 3,5 centímetros con fondo de vidrio. Transfiera el plato a una etapa calentada en el microscopio y comience a obtener imágenes con un microscopio confocal o de césped. Configurado para cubreobjetos fijos.

La transferencia T es igual a cero puntos de tiempo y la tapa se desliza en un plato de temperatura ambiente 4% para formaldehído, 4% sacarosa durante 20 minutos para otros puntos de tiempo. Reemplace el HBS con un medio acondicionado equilibrado a 37 grados Celsius y regrese a la incubadora para la endocitosis a 37 grados Celsius en los puntos de tiempo necesarios. Tome los platos de la incubadora y lávelos rápidamente dos veces con dos mililitros de temperatura ambiente, fosfato delcos, solución salina tamponada o DPBS.

A continuación, fije la muestra en aldehído paraformado al 4%, sacarosa al 4% durante 20 minutos. Después de una fijación de 20 minutos, retire el 4% de aldehído paraformado, el 4% de sacarosa al contenedor de residuos y lave los platos dos veces con dos mililitros de DPBS a temperatura ambiente. A continuación, incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Una solución de bloqueo de inmunofluorescencia que contiene 0,2%Triton X 100 para permear las neuronas y permitir la tinción inmunológica anti GFP del grupo de receptores intracelulares y/o el marcaje de otras proteínas de interés. A continuación, retire la solución de bloque permeable e incube los cubreobjetos en una solución de bloque de inmunofluorescencia sin Triton X 100 durante 20 a 30 minutos. Realizar incubaciones primarias de anticuerpos de cubreobjetos en bloque durante varias horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados después de la incubación.

Lave los cubreobjetos sumergiéndolos en DPBS durante cinco minutos para un total de tres lavados. A continuación, incubar los cubreobjetos con anticuerpos secundarios en solución en bloque durante una hora a temperatura ambiente después de una hora. Lave los cubreobjetos tres veces con DPBS como antes.

A continuación, monte cada cubreobjetos eliminando el exceso de líquido de la parte posterior del cubreobjetos con papel de laboratorio y, a continuación, invirtiendo el cubreobjetos en cuatro microlitros de medio de montaje en un portaobjetos de vidrio. Realice la adquisición de imágenes con microscopía confocal ciega a condición experimental utilizando una apertura numérica de aceite de 60x. 1.49 Objetivo de inmersión.

Utilizando la misma configuración de adquisición de imágenes, adquiera imágenes de una sola sección Z con el cuerpo de la célula neuronal y varios procesos dendríticos enfocados para cuantificar la toxina alfa bungalow, la señal fluorescente de Alexa y la inmunotinción GFP a lo largo de 20 micras de tres a cuatro dendritas proximales por neurona utilizando el mismo umbral para el análisis de todos los datos de endocitosis. Analice datos de 10 a 12 neuronas para cada punto de tiempo. Repitiendo el experimento con varios cultivos neuronales independientes.

Los axones GABAérgicos hacen contactos inhibidores con las dendritas de las neuronas piramidales. Las terminales inhibitorias presinápticas se identifican mediante el transportador de aminoácidos inhibidor vesicular que carga GABA y glicina en las vesículas sinápticas. Los receptores GABA a son muy opuestos a los sitios de liberación de neurotransmisores atados por el andamio inhibitorio postsináptico La proteína geína que se muestra aquí es alfa dos phg F-P-B-B-S que expresan neuronas con receptores gabaa de superficie marcados con la toxina Alexa 5 9 4 bungalow seguida de inmunotinción para la población total de receptores con anticuerpo anti GFP que se muestra en verde, y la proteína de andamio inhibitorio postsináptico geína o el transportador de aminoácidos inhibidor vesicular.

Aquí se muestra la endocitosis de alfa dos que contienen el receptor GABA A y las neuronas del hipocampo a los 15 días in vitro con alfa bungalow. Fluorescencia: Las mediciones de los procesos dendríticos individuales, como se muestra en los paneles, se normalizan al nivel de expresión de constructo a través de los anticuerpos GFP. La tinción de la comparación final de los puntos de tiempo se realiza mediante la normalización a la medición T igual a cero.

La cuantificación de la internalización de los receptores durante un período de 60 minutos a partir de los cambios en la señal fluorescente a lo largo del tiempo se describió mejor mediante un único exponencial. Un enfoque alternativo es seguir la endocitosis del receptor en una sola neurona mediante microscopía confocal de lapso de tiempo de imágenes en vivo. La fluorescencia punteada y superpuesta del receptor GABA A marcado con P-H-G-F-P y los receptores marcados con toxina alfa bungalow de superficie es visible al comienzo del experimento a lo largo del tiempo: la señal del receptor de toxina alfa bungalow marcada con GABA A disminuye a medida que los receptores se endocitosan.

Mientras que la señal P-H-G-F-P permanece alta debido a la inserción de un nuevo receptor, la disminución mínima de la señal P-H-G-F-P se debe a los cambios en la distribución del receptor de la superficie celular y al fotoblanqueo después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de inserción de toxinas en bungalows, para responder a preguntas adicionales, como las tasas de inserción de receptores con diferentes tratamientos. Esta técnica permite evaluar cómo la actividad celular, dominios proteicos específicos, agonistas y otros moduladores pueden modificar el recambio de receptores en neuronas vivas, otras células y tejidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar los tintes Alexa acoplados a la toxina alfa bungalow en combinación con técnicas inmunofluorescentes estándar para cuantificar la localización del receptor de superficie en las neuronas del hipocampo.