El uso de un enlace del sitio Tag α-Bungarotoxina para el Estudio de GABA A receptor de membrana localización y el Tráfico

El objetivo general de este procedimiento es medir la localización en la superficie y la endocitosis del receptor GABAA en neuronas del hipocampo. Esto se logra primero transfectando neuronas del hipocampo con la subunidad del receptor GABAA marcada y permitiendo que las neuronas en cultivo se desarrollen en el incubador. El segundo paso consiste en etiquetar los receptores GABAA de la superficie con alfa-bungarotoxina conjugada con el colorante fluorescente Alexa dye.

A continuación, se incuban las neuronas durante diversos intervalos de tiempo para permitir la endocitosis de los receptores marcados. El paso final consiste en fijar las muestras en los puntos de tiempo adecuados y realizar una tinción inmunológica utilizando anticuerpos anti-GFP para observar el conjunto total de receptores marcados. En última instancia, se utiliza microscopía confocal para mostrar los cambios en la localización en la superficie y en la endocitosis de los receptores gabaa marcados, mediante enfoques de imagen fija o en vivo.

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo del tráfico de receptores, como qué efecto puede tener la unión del ligando sobre las tasas de endocitosis e inserción del receptor, y si diferentes ligandos y moduladores pueden afectar la reciclaje y degradación del receptor. Aunque este método se ha utilizado principalmente para estudiar canales iónicos ligados y receptores acoplados a proteínas G en el contexto del sistema nervioso, también puede aplicarse para investigar la localización dinámica y el tráfico de otras proteínas de membrana en cultivos celulares y células primarias de diversos tejidos. En general, las personas nuevas en este método enfrentarán dificultades por dos razones.

Primero, para crear construcciones funcionales y segundo, practicar y adquirir la experiencia necesaria para procesar varios puntos temporales simultáneamente. Para comenzar, prepare cuatro o cinco laminillas circulares de vidrio recubiertas con poli-L-lisina dentro de cada placa de cultivo de tejidos de 3,5 centímetros, como se describe en el protocolo escrito. Luego, transfecte neuronas recién disociadas el día del cultivo con uno a cuatro microgramos de ADN del constructo preparado en plásmido maxi.

Las neuronas transfectadas sobre laminillas recubiertas con polilisina a una densidad final de aproximadamente 200.000 neuronas por placa de 3,5 centímetros. Reemplace el medio entre cuatro y 24 horas después de la preparación de los cultivos neuronales. Luego, permita que las neuronas se desarrollen en la incubadora hasta los 14-17 días in vitro o hasta la etapa deseada para realizar el ensayo de endocitosis.

Primero, configure un dispositivo de calentamiento y enfriamiento de banco a 16 grados Celsius. Enfríe los montones extracelulares, solución salina tamponada o HBS a 16 grados Celsius en un baño de agua. Transfiera las placas de neuronas a la placa de aluminio a 16 grados Celsius y enfríe durante cinco minutos.

Retire el medio y sustitúyalo con un mililitro de HBS a 16 grados Celsius más 150 micromolares de dos Bo Rina durante dos minutos. A continuación, retire el medio a un recipiente de desecho etiquetado y sustitúyalo con un mililitro de HBS a 16 grados Celsius más dos Bo Kerina más toxina alfa Bungalow. Incube con Alexa 5 9 4 a 16 grados Celsius durante 15 minutos.

Tras la incubación, transfiera el medio a un recipiente de desecho etiquetado y lave los recipientes tres veces con dos mililitros de HBS a 16 grados Celsius para experimentos de series temporales de imágenes en vivo siguiendo la endocitosis de receptores utilizando un recipiente de cultivo de 3,5 centímetros con fondo de vidrio. Transfiera el recipiente a una platina calentada en el microscopio e inicie la adquisición de imágenes con un microscopio confocal o turf. Prepare para laminillas fijadas.

Transfiera los portaobjetos del punto de tiempo cero a un recipiente con paraformaldehído al 4%, sacarosa al 4% a temperatura ambiente durante 20 minutos para los demás puntos de tiempo. Reemplace el HBS con medio condicionado equilibrado a 37 grados Celsius y devuelva al incubador para la endocitosis a 37 grados Celsius durante los puntos de tiempo necesarios. Saque los recipientes del incubador y lave rápidamente dos veces con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato desionizada (DPBS) a temperatura ambiente.

Luego, fije la muestra en paraformaldehído al 4%, sacarosa al 4% durante 20 minutos. Tras una fijación de 20 minutos, retire el paraformaldehído al 4%, sacarosa al 4% y deseche en el recipiente de desechos, y lave los pocillos dos veces con dos mililitros de DPBS a temperatura ambiente. A continuación, incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Una solución bloqueadora de inmunofluorescencia que contiene 0,2 % de Triton X-100 para permeabilizar las neuronas y permitir la inmunotinción anti-GFP del grupo intracelular de receptores y/o la marcación de otras proteínas de interés. A continuación, elimine la solución bloqueadora permeabilizante y incube las laminillas en solución bloqueadora de inmunofluorescencia sin Triton X-100 durante 20 a 30 minutos. Realice la incubación con el anticuerpo primario de las laminillas en la solución bloqueadora durante varias horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius tras la incubación previa.

Lave los cubreobjetos sumergiéndolos en DPBS durante cinco minutos, para un total de tres lavados. A continuación, incube los cubreobjetos con anticuerpos secundarios en solución bloqueadora durante una hora a temperatura ambiente después de una hora. Lave los cubreobjetos tres veces con DPBS como antes.

A continuación, monte cada cubreobjetos eliminando el exceso de líquido de la parte posterior del cubreobjetos con papel absorbente de laboratorio y luego invirtiendo el cubreobjetos sobre cuatro microlitros de medio de montaje sobre un portaobjetos de vidrio. Realice la adquisición de imágenes mediante microscopía confocal, ciegas respecto a la condición experimental, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60 x y apertura numérica 1.49.

Utilizando los mismos ajustes de adquisición de imágenes, adquiera imágenes de una sola sección Z con el cuerpo celular neuronal y varios procesos dendríticos en foco para cuantificar la toxina alfa bungalow, la señal fluorescente Alexa y la inmunotinción de GFP a lo largo de 20 micrones de tres a cuatro dendritas proximales por neurona, empleando el mismo umbral para el análisis de todos los datos de endocitosis. Analice los datos de 10 a 12 neuronas para cada punto temporal. Repita el experimento con varias culturas neuronales independientes.

Las axonas GABAérgicas establecen contactos inhibitorios sobre las dendritas de las neuronas piramidales. Los terminales inhibitorios pre-sinápticos se identifican mediante el transportador vesicular de aminoácidos inhibitorios, que carga GABA y glicina en las vesículas sinápticas. Los receptores GABAₐ se encuentran estrechamente opuestos a los sitios de liberación del neurotransmisor, anclados por la proteína del andamiaje inhibitorio post-sináptico gein. Se muestran aquí neuronas que expresan alfa dos phg F-P-B-B-S con receptores GABAₐ en superficie marcados con toxina bungalow Alexa 594, seguido de inmunomarcado para la población total de receptores con un anticuerpo anti-GFP mostrado en verde, y bien la proteína del andamiaje inhibitorio post-sináptico gein o el transportador vesicular de aminoácidos inhibitorios.

Aquí se muestra la endocitosis del receptor GABA A que contiene alfa dos y las neuronas del hipocampo a los 15 días in vitro, alfa bungalow toxina. Las mediciones de fluorescencia de procesos dendríticos individuales, como se muestra en los paneles, se normalizan al nivel de expresión del constructo mediante los anticuerpos GFP. La comparación final de tinción entre puntos de tiempo se realiza normalizando respecto a la medición en T igual a cero.

La cuantificación de la internalización de receptores durante un período de 60 minutos a partir de los cambios en la señal fluorescente a lo largo del tiempo se describió mejor mediante un solo modelo exponencial. Un enfoque alternativo consiste en seguir la endocitosis de receptores en una sola neurona mediante microscopía confocal de contraste de fase con registro temporal en vivo. La fluorescencia puntiforme y solapada del receptor GABA A marcado con P-H-G-F-P y los receptores marcados con toxina alfa bungalow se observa al inicio del experimento; a lo largo del tiempo, la señal de los receptores GABA A marcados con toxina alfa bungalow disminuye a medida que los receptores son endocitados.

Aunque la señal P-H-G-F-P permanece alta debido a la inserción de nuevos receptores, la disminución mínima en la señal P-H-G-F-P se debe a cambios en la distribución de los receptores en la superficie celular y al fotoblanqueamiento tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos de inserción de toxina búngalo, para responder preguntas adicionales, como las tasas de inserción de receptores con diferentes tratamientos. Esta técnica permite evaluar cómo la actividad celular, dominios proteicos específicos, agonistas y otros moduladores pueden modificar la renovación de receptores en neuronas vivas, otras células y tejidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar las toxinas alfa de bungalow acopladas a colorantes Alexa en combinación con técnicas inmunofluorescentes estándar para cuantificar la localización de receptores en la superficie de neuronas del hipocampo.