Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución
January 2nd, 2014
La unión de viriones a una superficie es un requisito para la obtención de imágenes de viriones individuales mediante imágenes de fluorescencia de súper resolución o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aquí se demuestra un método de preparación de la muestra para la adhesión controlada de viriones a las superficies de vidrio adecuado para su uso en AFM y super-resolución de imágenes de fluorescencia.
Este procedimiento prepara cubreobjetos de vidrio con virus para su uso en microscopía de fuerza atómica y microscopía de súper resolución, como la microscopía fluorescente de localización fotoactivada. Primero, limpie el sustrato de vidrio y cubra el vidrio con una película delgada de polietilenglicol parcialmente biotinilado injertado en lisina poli L. A continuación, trate la superficie con avadon para aumentar la afinidad de unión de la película biotinilada.
Ahora trate la superficie con anticuerpos biotinilados específicos para el virus de interés. A continuación, trate la superficie preparada con anticuerpos con el virus de interés. A diferencia del recubrimiento por rotación, esta técnica tiene la ventaja de distribuir las variantes a lo largo de la superficie de manera homogénea.
Con el fin de optimizar la microscopía, coloque los cubreobjetos verticalmente en un estante de cubreobjetos de teflón de tamaño adecuado y sumérjalos en un vaso de precipitados lleno de sonicate de alcohol etílico filtrado durante 30 minutos. A continuación, enjuague abundantemente los cubreobjetos con agua ultrapura. A continuación, coloque los cubreobjetos en una rejilla de teflón limpia y separada y un vaso de precipitados lleno de un molar de hidróxido de sodio sonicato durante 30 minutos y enjuague abundantemente con agua ultrapura.
Ahora seque los deslizamientos de la cubierta enjuagados bajo un chorro de nitrógeno y transfiéralos a una rejilla de teflón limpia y seca. Verifique que cada cubreobjetos esté limpio de cualquier película o partícula visible. Inmediatamente después del secado en la corriente de nitrógeno horizontalmente, coloque un cubreobjetos en una placa de Petri estéril en el centro de la pipeta de cubreobjetos con la cantidad adecuada de polietilenglicol biotinilado injertado en PBS.
Coloque otro cubreobjetos limpio sobre el líquido en un método de sándwich. Asegúrese de que el volumen entre las caras activas de los dos cubreobjetos esté completamente lleno de líquido. Cubra la placa de Petri e incube a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos.
A continuación, recoge el sándwich con unas pinzas sin pellizcar el exceso de líquido. Ahora, con el pulgar y el índice, pellizque el sándwich ligera y horizontalmente. Deslice los deslizadores de la cubierta en direcciones opuestas y sepárelos sin tocar las caras activas.
Enjuague ambos rostros activos con 25 mililitros de agua ultrapura. Ahora seque los cubreobjetos con un chorro de nitrógeno y observe qué caras de cubreobjetos están activas en una placa de Petri estéril. Coloque un cubreobjetos tratado con la pipeta activa boca arriba una cantidad adecuada de solución de evidencia descongelada en el centro de la cara activa.
Coloque otro cubreobjetos con la cara activa hacia abajo para intercalar el líquido, luego incube a temperatura ambiente durante 25 a 30 minutos. A continuación, separe los dos cubreobjetos como se muestra anteriormente. Asegurándose de no tocar las caras activas.
Ahora enjuague ambas caras activas con 25 mililitros de agua ultrapura y luego seque los cubreobjetos con un chorro de nitrógeno. Es importante recordar qué caras de cubreobjetos están activas. Para referencia futura, coloque inmediatamente un cubreobjetos activo ávido y tratado boca arriba en una placa de Petri estéril, pipetee una cantidad adecuada de anticuerpo biotinilado descongelado en el centro de la cara activa.
Coloque otro cubreobjetos con la cara activa hacia abajo sobre el líquido en un método de sándwich. Luego incube a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos Después de separar los dos cubreobjetos, enjuague ambas caras activas con 25 mililitros de PBS. A continuación, coloque un cubreobjetos tratado con anticuerpos con la cara activa hacia arriba en una placa de Petri estéril y pipetee una cantidad adecuada de virus en el centro de la cara activa.
Ahora coloque un sándwich con una segunda tapa activa, deslice, cubra e incube. Ahora separe los dos cubreobjetos. Enjuague ambas caras activas con 25 mililitros de PBS y transfiéralas a una rejilla de teflón y un vaso de precipitados llenos de PBS.
Utilice inmediatamente las muestras preparadas o almacene a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres días. Aquí. La varión de tipo salvaje del virus de la estomatitis vesicular se ancló a la superficie del vidrio y se analizó mediante microscopía de fuerza atómica. El ancho y la longitud del virión son de 80 nanómetros por 180 nanómetros, lo que muestra distorsiones mínimas con respecto al tamaño original del virión.
En este experimento, se obtuvieron imágenes del virión único mediante microscopía fluorescente de localización por fotoactivación. Uso de Alexis 6 47 anticuerpos VSVG marcados. La isosuperficie azul muestra la superficie recuperada del virión utilizando microscopía FOM.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar cubreobjetos de vidrio con virus para usar con microscopía de fuerza atómica o microscopía de súper resolución. Es importante recordar en todo momento qué cara del cubreobjetos tiene la química activa.
Descripción general
Este artículo presenta un método para preparar portaobjetos de vidrio con virus para su uso en microscopía de fuerza atómica (AFM) y microscopía de fluorescencia de alta resolución. La técnica asegura la adhesión controlada de viriones, facilitando la obtención de imágenes de alta resolución de las estructuras virales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biofísica
- Técnicas de microscopía
Antecedentes
- La unión de viriones es esencial para técnicas de imagen como AFM y microscopía de alta resolución.
- La adhesión controlada mejora la calidad de los resultados de la imagen.
- Los métodos anteriores pueden no proporcionar una distribución uniforme de los viriones.
- Este estudio introduce un nuevo método de preparación de muestras.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable para la adhesión de viriones a superficies de vidrio.
- Mejorar la calidad de la imagen en AFM y microscopía de alta resolución.
- Demostrar la eficacia del método utilizando el virus de la estomatitis vesicular.
Métodos utilizados
- Limpiar y recubrir portaobjetos de vidrio con polietilenglicol biotinilado.
- Tratar las superficies con avidin y anticuerpos biotinilados específicos del virus.
- Sándwich de portaobjetos para facilitar la distribución uniforme de fluidos.
- Utilizar técnicas de sonicación y enjuague para asegurar la limpieza.
Resultados principales
- Los viriones fueron anclados con éxito a superficies de vidrio para su imagen.
- Se obtuvieron imágenes de viriones individuales con una distorsión mínima utilizando microscopía de fluorescencia.
- El método demostró una distribución eficaz de los viriones en la superficie.
- Los resultados confirmaron la viabilidad del método de preparación para la imagen de alta resolución.
Conclusiones
- El método desarrollado proporciona un enfoque confiable para la adhesión de viriones.
- Esta técnica mejora la calidad de la imagen en aplicaciones de microscopía.
- Los estudios futuros pueden basarse en este método para diversas aplicaciones de imagen de virus.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
