Name: Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Aprende a preparar muestras de viriones para microscopía de fuerza atómica e imágenes de fluorescencia de súper resolución. Este método garantiza la adhesión controlada de viriones de virus de estomatitis vesicular.

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Agradecemos al Dr. Till Böcking por el protocolo original de preparación de una sola molécula. 
Este trabajo fue apoyado por la subvención NSF 1121972(SS).

<ol><li>Pang, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4(2013).</li>
<li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+tip%E2%80%93sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li>
<li>Hernando-Pérez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Virology%3A+Direct+Measurement+of+Phage%5BTitle%5D)+AND+%22phi29+Stiffness+Provides+Evidence+of+Internal+Pressure+%28Small+15%2F2012%29.+Small%22%5BJournal%5D)">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li>
<li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Kinetics+of+%CE%BB+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li>
<li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+Spectrin%2C+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos en este trabajo.

La proyección de imagen del solo virión con AFM y proyección de imagen de alta resolución de la fluorescencia se puede utilizar como metodología alternativa a la tomografía de CryoEM. Cada una de estas metodologías tiene sus fortalezas específicas. Por ejemplo, AFM se puede hacer en viriones WT sin necesidad de etiquetar la muestra o las proteínas virales internas. La localización de las estructuras virales se desconvía de sus contribuciones a las propiedades elásticas del virión.
Las imágenes de super-resolución de virión único en combinación con los enfoques genéticos inversos virales recientemente desarrollados se convierten en una técnica poderosa para localizar proteínas virales de bajo número de copias20. Los virus recombinantes con el reemplazo de sus proteínas con las proteínas fundidas a las proteínas fluorescentes se pueden hacer y purificar usando estos acercamientos genéticos reversos. Aunque las imágenes de súper resolución tienen especificidad en parte debido al etiquetado genético, requiere el uso de los virus mutantes.
AFM y la proyección de imagen de la super-resolución son los métodos complementarios que utilizan preparaciones muy similares de la muestra. Los métodos descritos en este documento, que se adoptan forman ensayos anteriores de imágenes de molécula única, permiten el anclaje de viriones individuales con pocos efectos sobre la topología de los viriones.

Las interacciones inespecíficas basadas en la carga se utilizan rutinariamente para la adhesión de viriones en microscopía de fuerza atómica1,2. Estas técnicas funcionan especialmente bien cuando se utilizan en viriones no enredados con cápsides muy rígidas3-6. Aunque estas técnicas son muy eficaces en la inmovilización de la muestra, no evitan la unión inespecífica de proteínas a la superficie. La unión inespecífica puede crear un problema al intentar obtener imágenes de viriones con AFM y técnicas de fluorescencia de súper resolución que requieren incubaciones de la muestra con varios anticuerpos. Aquí se describe un método de preparación de la muestra para la inmovilización específica de viriones.
Poli(etilenglicol) (PEG) injertado a poli(L-lisina) (PLL) y adsorbido sobre una superficie de vidrio proporciona un bloque significativo para las interacciones electrostáticas de proteínas con vidrio7. Los ensayos de moléculas individuales que requieren inmovilización de moléculas individuales en superficies de vidrio han aprovechado esta propiedad y la han utilizado para crear una técnica específica de inmovilización de molécula única basada en PEG8-10. Esta preparación también se utilizó para inmovilizar jaulas de clatrina en la superficie de vidrio11, así como para crear un recubrimiento homogéneo de fibronectina para el control de la adhesión celular 12.
Hemos adoptado el método de la preparación de la muestra basado en la adsorción de PLL-g-PEG a las superficies de cristal de metodologías de la proyección de imagen de una sola molécula y lo hemos aplicado a los solos viriones de la proyección de imagen del virus vesicular de la estomatitis (VSV). Estos viriones individuales fueron fotomicadas usando la microscopia de la fuerza atómica (AFM). También se realizaron experimentos similares en perlas funcionalizadas como control. Los viriones también fueron foto fotomicadas por microscopía de fluorescencia de súper resolución si se utilizó un anticuerpo VSV-G etiquetado con Alexa 647 para crear una imagen de la envoltura de viriones individuales. Imágenes fluorescentes de alta resolución utiliza la localización de moléculas individuales para crear una imagen13-15. La imagen biplanar de fPALM permite la localización de moléculas individuales con 20 nm en plano y 50 nm de resolución a lo largo del eje óptico15,16. Esta técnica bi-planar fue utilizada para las imágenes fluorescentes de la super-resolución de la imagen presentes en este estudio. Una técnica alternativa que tiene resultados similares es STORM13,17,18.
Tanto AFM como imágenes fluorescentes de súper resolución de VSV ancladas al vidrio por los procedimientos descritos en este trabajo, mostraron una unión específica de viriones al vidrio con mínimas interacciones inespecíficas19. Aquí presentamos los protocolos de preparación de muestras para el AFM y experimentos de imágenes fluorescentes de súper resolución. En resumen: Las tapas de vidrio limpio se funcionalizan mediante la adsorber una mezcla de PLL-g-PEG y PLL-g-PEG-biotina. Es típico que esta película delgada esté diseñada para proporcionar entre un 15-25% de biotina funcionalizada en una superficie recubierta. Los cubrebocas se incuban además con avidina tetramérica. Un anticuerpo viral biotinilado entonces se utiliza para crear un sitio de unión único para los viriones. La unión del anticuerpo se puede hacer de dos maneras.
El primer método está optimizado para AFM, sin embargo, sigue siendo adecuado para imágenes de fluorescencia de súper resolución. En este método la superficie recubierta de avidina se trata con anticuerpos biotinilados antes de la adhesión viral. Los viriones inmovilizados se tratan con el anticuerpo etiquetado Alexa 647 para cubrir la envoltura y permitir imágenes de fluorescencia de súper resolución de los viriones.
El segundo método es atacar el virus en solución con el anticuerpo biotinilado y el anticuerpo etiquetado alexa 647 antes de adherir los virus a la superficie tratada con avidina; este método está optimizado para experimentos de imágenes de fluorescencia de súper resolución en los que la recuperación de la envoltura viral es importante. Este método tiene la ventaja de permitir un recubrimiento uniforme de anticuerpos en la superficie viral. El anticuerpo biotinilado se puede mezclar con anticuerpos virales etiquetados alexa 647 en proporciones que permiten suficiente adsorción del virus a la superficie tratada con avidina mientras se mantiene una alta concentración de etiqueta fluorescente en el exterior de la envoltura viral. Estos anticuerpos virales etiquetados con Alexa 647 no están biotinilados y su exceso puede enjuagarse para reducir el ruido de fondo.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de vidrio (fPALM)</td><td>Servicios de Microscopía Electrónica</td><td>72225-01</td><td>25 mm Cubertores</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotina (20%)&nbsp;</td><td>SuSoS-Stock</td><td></td><td>: 0,5 mg/ml en PBS</td></tr><tr><td>NeutrAvidin proteína de unión a biotina</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Stock: 0,25 mg/ml en PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 en 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% glicol, pH 7,2 tampón</td></tr><tr><td>&alpha;-VSV-G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 en 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glicol, tampón pH 7,2</td></tr><tr><td>Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Glucosa oxidasa tipo siete de Aspergillius&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C40-100mg</td><td>Catalasa de hígado bovino&nbsp;</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cisteamina (MEA</td></tr><tr><td>Stock Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10%</td></tr> glucosa <tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, mini unidad de diálisis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10,000 MW</td></tr><tr><td>Microscopio Cubreobjetos: 35 CÍRCULO #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 CÍRCULO #1</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

La inmovilización de viriones a superficies de vidrio es un paso crítico en la proyección de imagen de un solo virión. Aquí presentamos una técnica adoptada de ensayos de imágenes de una sola molécula que permite la adhesión de viriones individuales a superficies de vidrio con especificidad. Esta preparación se basa en injertar la superficie del vidrio con una mezcla de PLL-g-PEG y PLL-g-PEG-Biotina, añadir una capa de avidina, y finalmente crear anclajes de virión a través de la unión de anticuerpos específicos del virus biotinilado. Hemos aplicado esta técnica a través de una gama de experimentos incluyendo la microscopia de la fuerza atómica (AFM) y la proyección de imagen de la fluorescencia de la super-resolución. Este método de preparación de la muestra da como resultado una adhesión de control de los viriones a la superficie.

Imágenes de virión único usando AFM:
El protocolo de preparación de muestras descrito anteriormente se utilizó en el anclaje de viriones de tipo salvaje a la superficie de vidrio. Los viriones VSV tienen forma de bala de 180 nm de longitud y 80 nm de diámetro. Como hay una variedad de viriones para los que se puede aplicar esta técnica, el concepto también se demuestra aquí en perlas biotiniladas de 36 nm también. Los experimentos AFM resultantes se muestran en la Figura 1. Es importante tener en cuenta que los viriones VSV tienen un módulo de Young más bajo (100 MPa) en comparación con los virus no envopados (GPa). Las imágenes particulares de un solo virión VSV se obtuvieron en modo de tapping en condiciones ambientales con un voladizo rígido. El objetivo ha sido deformar el virus hasta el punto de que la densidad de proteínas adicionales dentro del virus se hace visible como una protuberancia dentro de la imagen AFM. Este método se utiliza para detectar la densidad extra de proteínas dentro de la cavidad del virus19.
Imágenes de super resolución de virión único:
Alexa 647 etiquetado VSV-G anticuerpos se utilizaron para recubrir la envoltura de viriones VSV individuales para experimentos de súper resolución utilizando el método 5A. Para demostrar la densidad de ataduras y la baja unión inespecífica, se muestra un escaneo grande de la muestra en la Figura 2A. La recuperación de la envoltura viral en un virión representativo se muestra en la Figura 2B (isosuperficie azul).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figura 1. Proyección de imagen de AFM de cuentas y de VSV en la superficie funcionalizada de PEGG. Exploración de AFM de los granos biotinylated de 36 nanómetro(A, B)y de un virion de VSV(c)anclado a la superficie con un anticuerpo biotinylated de VSVG. AFM se realizó en modo de exploración de topografía de aire ac. El radio de la punta es de <25 nm y las mediciones se llevaron a cabo bajo modulación de fuerza y golpecito de luz. La punta tenía una constante de fuerza de 3 N/m y una frecuencia resonante de 75 kHz con una incertidumbre de 15 kHz. Mientras que las perlas conservaron su altura durante la exploración AFM, el virión VSV tiene un módulo de jóvenes significativamente más pequeño y está significativamente deformado en altura. En esta imagen, el virión fue fotoficado específicamente con un voladizo rígido en modo tapping que produjo una pequeña convolución xy (utilizada para determinar la punta vs extremo romo del virus) y la diferencia de altura entre la punta y el extremo romo del virus se utiliza para detectar densidad de proteínas adicionales en el extremo romo del virus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figura 2. Fluorescencia basada en imágenes de viriones VSV en la superficie funcionalizada PEGG. A)viriones recombinantes de VSV inmovilizados en la superficie de PEGG utilizando un anticuerpo anti VSVG biotinilado fotoizado en fluorescencia de amplio campo. B)Reconstrucción de fluorescencia de alta resolución de la envoltura de VSV unida a la superficie de PEGG a través de un anticuerpo anti VSVG biotinilado y decorado con anticuerpos anti-VSVG etiquetados con Alexa 647 (se utilizó el Método 5A para la creación de estas imágenes). La superficie azul es una proyección isosuperficial 2D. La izquierda muestra un modelo del virus en forma de bala. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Tamaño de la la ficha de cubierta</td>
			<td style="width:93px;">fluido</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 milímetros</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 milímetros</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 milímetros</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 milímetros</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 milímetros</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Alícuotas fluidas según el tamaño del cubrecubos.

La unión de viriones a una superficie es un requisito para la obtención de imágenes de viriones individuales mediante imágenes de fluorescencia de súper resolución o microscopía de fuerza atómica (AFM). Aquí se demuestra un método de preparación de la muestra para la adhesión controlada de viriones a las superficies de vidrio adecuado para su uso en AFM y super-resolución de imágenes de fluorescencia.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Este procedimiento prepara cubreobjetos de vidrio con virus para su uso en microscopía de fuerza atómica y microscopía de superresolución, como la microscopía fluorescente de localización por activación fotónica. Primero, limpie el sustrato de vidrio y cubra el vidrio con una película delgada de polietilenglicol parcialmente biotinilado injertado a poli-L-lisina. A continuación, trate la superficie con avidina para aumentar la afinidad de unión de la película biotinilada.Ahora trate la superficie con anticuerpos biotinilados específicos para el virus de interés. Luego, trate la superficie preparada con anticuerpos con el virus de interés. A diferencia del recubrimiento por centrifugación, esta técnica tiene la ventaja de distribuir las variantes a lo largo de la superficie de manera homogénea.Para optimizar la microscopía, coloque los cubreobjetos verticalmente en una rejilla de Teflón de tamaño adecuado y sumérjalos en un vaso de precipitados lleno de alcohol etílico filtrado sometido a ultrasonido durante 30 minutos. Luego enjuague los cubreobjetos exhaustivamente con agua ultrapura. A continuación, coloque los cubreobjetos en una rejilla de Teflón limpia separada y en un vaso de precipitados lleno con una solución sonificada de hidróxido de sodio un molar durante 30 minutos, y enjuague abundantemente con agua ultrapura.Ahora seque las laminillas lavadas bajo una corriente de nitrógeno y transfiéralas a una rejilla seca y limpia de teflón. Verifique que cada laminilla esté limpia de cualquier película o partículas visibles. Inmediatamente después del secado en posición horizontal con la corriente de nitrógeno, coloque una laminilla en una placa de Petri estéril y, en el centro de la laminilla, agregue con pipeta la cantidad adecuada de polilisina biotinilada injertada en polietilenglicol en tampón PBS.Coloque otra cubreobjetos limpia encima del líquido mediante el método de sándwich. Asegúrese de que el volumen entre las caras activas de las dos cubreobjetos quede completamente lleno de líquido. Tape la placa de Petri e incube a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos.A continuación, tome el preparado con un par de pinzas sin aplastar el exceso de líquido. Ahora, utilizando el pulgar y el índice, pellizque suavemente y en forma horizontal el preparado. Deslice las cubreobjetos en direcciones opuestas y sepárelas sin tocar las caras activas.Lave ambas caras activas con 25 mililitros de agua ultrapura. Ahora seque las laminillas con una corriente de nitrógeno y anote qué caras de las laminillas están activas en un plato de Petri estéril. Coloque una laminilla tratada con la cara activa hacia arriba y agregue con pipeta una cantidad adecuada de solución de evidencia descongelada en el centro de la cara activa.Coloque otra cubreobjetos con la cara activa hacia abajo para encajonar el líquido, luego incube a temperatura ambiente durante 25 a 30 minutos. A continuación, separe las dos cubreobjetos como se mostró anteriormente, asegurándose de no tocar las caras activas.Ahora enjuague ambas caras activas con 25 mililitros de agua ultrapura y luego seque las laminillas con una corriente de nitrógeno. Es importante recordar qué caras de las laminillas están activas. Para futura referencia, coloque inmediatamente una laminilla tratada y activa con la cara activa hacia arriba en una placa de Petri estéril, y agregue con pipeta una cantidad adecuada de anticuerpo biotinilado descongelado en el centro de la cara activa.Coloque otra cubreobjetos con la cara activa hacia abajo sobre el líquido mediante el método de sándwich. Incube luego a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos. Después de separar las dos cubreobjetos, enjuague ambas caras activas con 25 mililitros de PBS. A continuación, coloque una cubreobjetos tratada con anticuerpo con la cara activa hacia arriba en una placa de Petri estéril y agregue con pipeta una cantidad adecuada de virus en el centro de la cara activa.Ahora ensamblar con una segunda cubreobjetos activa, colocar la cubreobjetos y incubar. A continuación, separar las dos cubreobjetos. Enjuagar ambas caras activas con 25 mililitros de PBS y transferirlas a una rejilla de teflón y un vaso de precipitados llenos de PBS.Utilice inmediatamente las muestras preparadas o almacénelas a cuatro grados Celsius durante un máximo de tres días. Aquí, la variante de tipo silvestre del virus de la estomatitis vesicular se ancló a la superficie de vidrio y se analizó mediante microscopía de fuerza atómica. El ancho y la longitud del virión son de 80 nanómetros por 180 nanómetros, mostrando distorsiones mínimas respecto al tamaño original del virión.En este experimento, se obtuvo una imagen del virión individual mediante microscopía de localización por activación fotónica fluorescente. Utilizando anticuerpos VSVG marcados con Alexis 647. La isosuperficie azul muestra la superficie recuperada del virión mediante microscopía FOM.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar laminillas de vidrio con virus para su uso en microscopía de fuerza atómica o microscopía de superresolución. Es importante recordar en todo momento qué cara de la laminilla tiene la química activa.

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Investigación

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Biología

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Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener resultados de localización subcelular de la proteína en la retina de pez cebra por microscopía de superresolución la correlación y análisis de imágenes de microscopia electrónica.

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

Aquí, describimos un método de microaspiración de una sola célula para la separación de las amebas infectadas. Con el fin de separar subpoblaciones virales en Vermamoeba vermiformis infectados por Faustovirus y virus gigantes desconocidos, desarrollamos el protocolo detallado a continuación y demostramos su capacidad para separar dos nuevos virus gigantes de baja abundancia.

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

Aquí, presentamos una línea para el fresado de haces de iones enfocados correlativos en 3D para guiar la preparación de muestras celulares para la tomografía crioelectrónica. La posición 3D de las proteínas de interés marcadas con fluorescencia se determina primero mediante criofluorescencia y luego se dirige a la molienda. El protocolo es adecuado para células de mamíferos, levaduras y bacterias.

Preparación de muestras mediante fresado por haz de iones focalizado correlativo en 3D para tomografía crioelectrónica de alta resolución

Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.

Avance de imágenes de alta resolución de ensamblajes de virus en líquido y hielo

Este protocolo de video ilustra cómo realizar una tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido de muestras virológicas. Para obtener resultados óptimos, las muestras se preparan mediante congelación a alta presión y posterior sustitución por congelación.

Tomografía de microscopía electrónica de transmisión de barrido en virología: imágenes 3D de muestras congeladas a alta presión y sustituidas por congelación

Este protocolo detalla las aplicaciones avanzadas de imagen y la gestión de recursos compartidos de un sistema de microscopio confocal de barrido láser integrado con un detector de matriz multiplexada para imágenes celulares y subcelulares de alta resolución. El flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multimodales desde confocal hasta superresolución (~120 nm) dentro de una sola plataforma, haciendo que la visualización a escala nanométrica sea más accesible.

Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Aprende a preparar muestras de viriones para microscopía de fuerza atómica e imágenes de fluorescencia de súper resolución. Este método garantiza la adhesión controlada de viriones de virus de estomatitis vesicular.

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

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