Name: Métodos para facilitar el crecimiento microbiano en los flujos de residuos de las fábricas de celulosa y caracterización del potencial de biodegradación de los microbios cultivados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Aprende métodos para cultivar microorganismos en licor negro de fábricas de celulosa y caracterizar su potencial de biodegradación mediante cromatografía de gases. Esta técnica permite evaluar la capacidad metabólica de aislamientos microbianos para la biorremediación.

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Nos gustaría agradecer a Jim McMurray por proporcionar el licor negro y al Dr. David Tilotta y August Meng por su ayuda con GC-MS. El apoyo para Stephanie L. Mathews fue proporcionado por una beca de Necesidades Nacionales del USDA (número de adjudicación 2010-38420-20399).

1. Recolección de licor negro y preparación de licor negro para cultivos en crecimiento
<ol>
	<li>Recoja una muestra de licor negro de la válvula de salida conectada al digestor kraft en una botella de vidrio estéril y deje que se enfríe a temperatura ambiente antes ><de continuar con los siguientes pasos.
	>neutralización</li>
	<li>Agregue 100 ml de muestra de licor negro a un vaso de precipitados de 500 ml equipado con una barra agitadora.</li>
	<li>Coloque el vaso de precipitados en una placa para remover y ajuste la velocidad a media.</li>
	<li>Agregue lentamente gotas de ácido fosfórico hasta que el licor negro se vuelva viscoso (viscosidad similar al glicerol).</li>
	<li>Alícuota toda la solución de licor negro vertiendo lentamente en tubos cónicos de 50 ml y centrifugando a 9.300 x g durante 30 min.</li>
	<li>Coloque el sobrenadante en el vaso de precipitados y mida el pH con cintas de prueba de pH. El pellet de lignina precipitada puede ser desechado y tratado como residuo sólido no peligroso.</li>
	<li>Continúe agregando ácido fosfórico y centrifugando la solución hasta que las tiras de pH indiquen un pH neutro del sobrenadante. 
	esterilización</li>
	<li>Pase la solución a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier bacteria contaminante y coloque la solución filtrada en un recipiente estéril para su almacenamiento. Almacene a temperatura ambiente.</li>
</ol>
2. Extracción de lignocelulosa
Separación de carbohidratos
<ol>
	<li>Coloque 5 g de pasto varilla, pino o bermuda (molido a 1 mm o un tamaño de partícula menor) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. A continuación, añada al matraz 200 ml de agua destilada o desionizada, 7,5 g deNaClO2, 2,5 ml de ácido acético glacial y una barra agitadora.</li>
	<li>Coloque el matraz en un baño de aceite colocado encima de una placa de agitación a 80 °C durante 1 hora. Ajuste la velocidad de la placa de agitación a media.</li>
	<li>Añadir 7,5 g adicionales deNaClO2 y 2,5 ml de ácido acético glacial al matraz. Continuar removiendo a 80 °C en el baño de aceite durante 30 min.</li>
	<li>Repita el paso anterior 2 veces (Nota: se añaden un total de 30 g deNaClO2 y 10 ml de ácido acético glacial al matraz que contiene la biomasa lignocelulósica). Enfríe la solución a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque una hoja de papel de filtro en un embudo Büchner. Coloque el embudo encima de un matraz de brazo lateral y conéctelo a una aspiradora.</li>
	<li>Vierta lentamente la solución en el embudo.</li>
	<li>Lave el material sólido 3 veces con 100 ml de agua destilada o desionizada. Deseche el filtrado después de lavar el material sólido.</li>
	<li>Reserve 1 g del material sólido y colóquelo sobre una hoja limpia de papel de filtro.</li>
	<li>Seque este material sólido durante la noche en un horno a 50 °C. Después de retirar la muestra del horno, colóquela en un vial de almacenamiento etiquetado como 'holocelulosa'.</li>
	<li>Añadir el material sólido restante a 250 ml de NaOH (v/v) al 10% en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Tape el matraz con un tapón.</li>
	<li>Coloque la solución en una incubadora a 70 °C durante 1 hora agitando a 250 rpm.</li>
	<li>Enfríe la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el material sólido con papel de filtro y embudo Büchner unido a un matraz de brazo lateral.</li>
	<li>Transfiera el material sólido en una hoja limpia de papel de filtro a un horno a 50 °C y deje que se seque durante la noche.</li>
	<li>Una vez que el residuo se haya secado, colóquelo en un vial de almacenamiento y etiquételo como "celulosa".</li>
	<li>Transfiera el filtrado del paso 2.13 a un matraz Erlenmeyer de 500 ml y agregue 30 ml de ácido acético y 250 ml de alcohol isopropílico. Tape el matraz y coloque la solución en la mesa de trabajo durante al menos 8 horas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera toda la solución a tubos cónicos de 50 ml y centrifugue la solución a 9.300 x g durante 30 min. Pipetee cuidadosamente la solución fuera del tubo cónico y deséchela.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 30 ml de agua destilada o desionizada por vórtice.</li>
	<li>Repita los pasos 2.17-2.18 15 veces para lavar a fondo el pellet.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y guarde el pellet para liofilizar. Una vez liofilizada, recoja la muestra y colóquela en un vial etiquetado como 'hemicelulosa'. 
	Separación de ligninas 
	Protocolo de separación de lignina basado en Karaaslan et al. 12</li>
	<li>Añadir 5 g de pasto varilla, pino o bermuda (molido hasta 1 mm o menor tamaño de partícula) a 500 ml de una solución de 0,25 M de NaOH y etanol al 30%. Coloque el purín en una incubadora a 75 °C agitando a 250 rpm durante 2 horas.</li>
	<li>Enfríe la solución a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque una hoja de papel de filtro en un embudo Büchner encima de un matraz de brazo lateral. Conéctalo a una aspiradora y vierta lentamente la solución en el embudo.</li>
	<li>Deseche el material sólido.</li>
	<li>Añada una barra de agitación al matraz que contiene el filtrado y coloque el matraz encima de una placa de agitación ajustada a velocidad media. Añadir ácido clorhídrico concentrado gota a gota a la solución hasta obtener un pH de 2,0 (aproximadamente 20 ml).</li>
	<li>Deje reposar la solución acidificada durante la noche a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar la solución a 9.300 x g durante 30 min en tubos cónicos. Pipetee con cuidado la solución del tubo cónico y deséchela.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 30 ml de agua destilada o desionizada por vórtice.</li>
	<li>Repita los pasos 2.27-2.28 15 veces para lavar a fondo el pellet.</li>
	<li>Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y guarde el pellet para liofilizar. Una vez liofilizada, coloque la muestra en un vial etiquetado como 'lignina'.</li>
</ol>
3. Preparación de cultivos de crecimiento microbiano
Placas de agar
<ol>
	<li>Agregue 0.2% (p/v) de productos de extracción de lignocelulosa estériles al agar M9 minimal media13 antes de verter las placas.</li>
	<li>Placas solidificadas con aproximadamente 200 ul de un cultivo bacteriano cultivado en un medio mínimo M9 con un diámetro exterior de aproximadamente 2.0.</li>
	<li>Incubar las placas a 37 °C y controlar el crecimiento. 
	Cultivos líquidos</li>
	<li>Añadir 50 ml de medio estéril Luria-Bertani (LB)13 o M9 medio mínimo13 a un matraz estéril de 125 ml. Añadir licor negro al 10% (v/v) o al 0,2% (p/v) de los productos de extracción de lignocelulosa.</li>
	<li>Inocular el medio con 0,1% (v/v) de un cultivo bacteriano a un diámetro exterior de aproximadamente 2,0.</li>
	<li>Incubar los cultivos a 37 °C con agitación a 200 rpm.</li>
	<li>Evalúe el crecimiento cada 6 horas durante el período de cultivo midiendo la densidad óptica (λ = 600 nm). Coloque una alícuota de 1 ml del cultivo en una cubeta. Determinar la densidad óptica del cultivo en blanco frente a medios no inoculados.</li>
	<li>Transfiera las bacterias a un frasco de suero anaeróbico en la fase media de logaritmo.
	<ol>
		<li>Para preparar el frasco de suero anaeróbico: selle el frasco de suero con un tapón de caucho butílico y una tapa de engarce de aluminio en condiciones aeróbicas y autoclave. No modifique el espacio libre dentro del frasco de suero después de la esterilización.</li>
		<li>Transfiera todo el cultivo de 50 ml del matraz de 125 ml al frasco de suero estéril sellado con una jeringa.</li>
		<li>Incubar a 37 °C con agitación a 200 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Preparación de muestras para GC-MS
Prepare muestras de acuerdo con Raj, Reddy y Chandra14. El control negativo utilizado para la comparación consiste en medios mínimos M9 con 10% de licor negro y también se conoce como muestra no inoculada.
<ol>
	<li>Centrifugar cultivos bacterianos inoculados y no inoculados (50 ml) a 9.300 x g durante 30 min después de 450 horas de incubación.</li>
	<li>Transfiera 10 ml del sobrenadante a un tubo de ensayo de vidrio. (Nota: El plástico es incompatible con los productos químicos en los siguientes pasos).</li>
	<li>Acidificar el sobrenadante con HCl concentrado a pH 1-2.</li>
	<li>Añadir 3 volúmenes de acetato de etilo (30 ml), tapar el tubo y mezclar invirtiendo 4-6x.</li>
	<li>Coloque una pequeña cantidad de Na2SO4 anhidro (1-2 g) en un tubo de ensayo de vidrio limpio.</li>
	<li>Recoja cuidadosamente la capa orgánica (parte superior) de la solución de acetato de etilo pipeteando con una pipeta Pasteur de vidrio desechable.</li>
	<li>Coloque la capa orgánica en el tubo de ensayo con Na2anhidro SO4.</li>
	<li>Deshidratar la capa orgánica sobre el Na2SO4 anhidro golpeando suavemente el tubo de ensayo para mezclar. Agregue gradualmente pequeñas cantidades de Na2SO4anhidro y mezcle hasta que no queden grumos grandes.</li>
	<li>Coloque una hoja de papel de filtro en un embudo Büchner encima de un matraz de brazo lateral conectado a una aspiradora.</li>
	<li>Vierte la solución en el embudo. Deseche el material sólido.</li>
	<li>Transfiera la solución a un matraz evaporador y evapore el filtrado utilizando un evaporador rotativo.</li>
	<li>Coloque 3 mg de residuo de extracción de acetato de etilo en un vial de cromatografía ámbar de 2 ml.</li>
	<li>Disolver el residuo con la adición de 100 μl de 1,4-dioxano y 10 μl de piridina.</li>
	<li>Añadir 50 μl de N,O-Bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano 99:1% (BSTFA). Luego colóquelo en una incubadora a 60 °C agitando durante 15 min.</li>
	<li>Almacene las muestras a 4 °C hasta su uso.</li>
</ol>
5. GC-MS
Equipe el cromatógrafo de gases (GC) interconectado con un espectrómetro de masas (MS) con una columna capilar no polar y helio como gas portador con un caudal de 1 ml/min.
<ol>
	<li>Una vez estabilizada la temperatura del horno a 50 °C, inyectar 1 μl de la muestra en una proporción de división de 1/50.</li>
	<li>Mantenga la columna a 50 °C durante 5 min y aumente a 280 °C a 5 °C/min. Mantenga la temperatura final de 280 °C durante 20 min.</li>
	<li>Mantenga la línea de transferencia entre el cromatógrafo de gases y el espectrómetro de masas a 300 °C.</li>
	<li>Seleccione un retardo del disolvente de 15 min.</li>
	<li>Registre espectros de masas de ionización de electrones entre el rango de 10-500 (m/z) a una energía de electrones de 70 eV.</li>
	<li>Derivatizar y cromatógrafo estándar como el anterior. Identifique los compuestos comparando los tiempos de retención de los estándares comprados o los datos en la base de datos espectral de masas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo describe una combinación de técnicas que tiene como objetivo identificar microorganismos que pueden degradar los desechos de pulpa, las fuentes de carbono utilizadas durante el crecimiento en los desechos de pulpa y los productos metabólicos microbianos producidos cuando se cultivan en los desechos de pulpa. Hemos demostrado el éxito de este protocolo con el aislado ambiental microbiano: un anaerobio facultativo que puede crecer con un 10% de licor negro y utilizar los componentes de extracción de lignocel...

La fabricación de pasta de madera es un proceso químicamente intensivo que se ha optimizado durante muchos años para crear un sistema con un desperdicio mínimo. Sin embargo, algunos resultados de este proceso podrían utilizarse para producir productos de mayor valor. El licor negro es un ejemplo de ello. Se genera a partir del proceso kraft, que es el método de fabricación de pasta química dominante, representando el 85% de la producción mundial de lignina1. El proceso kraft (Figura 1) utiliza la temperatura (160-200 °C), la presión (120 psig) y los productos químicos contenidos en el licor blanco (hidróxido de sodio y sulfuro de sodio) para disolver la lignina de las fibras de madera2,3. El licor negro contiene lignina, ácidos orgánicos y subproductos de degradación de polisacáridos4. Se incinera para producir vapor y recuperar productos químicos en la caldera de recuperación que proporciona energía térmica para los procesos posteriores de fabricación de papel y pulpa. El volumen de licor negro generado por la fabricación de pulpa puede exceder la cantidad que la caldera de recuperación puede procesar de manera efectiva. Desechar el licor negro como efluente afecta negativamente a la flora y fauna acuática y, por lo tanto, no es una opción. La aplicación de organismos microbianos que podrían utilizar el licor negro para el crecimiento sería beneficiosa en términos de aumentar la recuperación química y la generación de productos de valor agregado que mejorarían el análisis del ciclo de vida general del sistema de fabricación de pulpa. La conversión química y biológica de monómeros derivados de la lignina ha producido con éxito vainillina y ácido cinámico para su uso como edulcorantes alimentarios y aditivos de fragancias, fenol utilizado para plásticos y resinas, y ciclohexano, que podría usarse como combustible5.
El trabajo previo sobre la biodegradación de este residuo de pulpa se ha centrado en la despolimerización de la lignina. El Instituto Internacional de Lignina (ILI) informa que cada año se producen entre 40 y 50 millones de toneladas de lignina (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Solo el 1,5% de esa lignina se utiliza para procesos industriales comerciales6. Se ha estudiado en profundidad la despolimerización de la lignina por las enzimas lacasa y peroxidasa producidas por hongos de pudrición blanca de los géneros Phanerochaete y Trametes7. También se ha demostrado que las bacterias del suelo que se sabe que degradan compuestos aromáticos como Nocardia y Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 y Streptomyces viridosporus T7A10 son capaces de degradar la lignina. La degradación bacteriana de los residuos de pulpa es prometedora porque algunas bacterias pueden prosperar en las condiciones salinas y alcalinas (pH 10-14) que caracterizan los efluentes de los residuos de pulpa11. Si bien la lignina es el componente principal del licor negro, los microorganismos también pueden degradar los otros componentes que componen el licor negro. Estas técnicas no identifican exclusivamente los microorganismos que degradan la lignina, sino que sirven para identificar microorganismos que se pueden aplicar directamente al licor negro de residuos de pulpa en lugar de a sus componentes procesados posteriormente.
Se recolectó y modificó el licor negro para el crecimiento microbiano a través de la neutralización y la esterilización por filtro. Los requisitos de crecimiento microbiano se identificaron para un aislado microbiano ambiental mediante experimentos de crecimiento mínimo en componentes lignocelulósicos producidos por un nuevo protocolo de extracción de lignocelulosa. Los medios de crecimiento se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) para determinar los productos metabólicos del aislado microbiano ambiental cuando se cultiva en licor negro como única fuente de carbono. La combinación de estas técnicas proporciona una herramienta de evaluación para determinar la capacidad metabólica de un microorganismo cuando se cultiva en desechos de fábricas de celulosa, como el licor negro. El uso de estas técnicas también ofrece información sobre el valor de la aplicación de microorganismos específicos a los residuos de las fábricas de celulosa para la generación de subproductos.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxano (certificado ACS)</td><td>Fisher</td><td>D111</td><td>Químico inflamable y preoxidable</td></tr><tr><td>Licor negro</td><td>Departamento de Biomateriales Forestales de la Universidad Estatal de Carolina del Norte</td><td>N/A</td><td>pH 12,72, 13,67% sólidos</td></tr><tr><td>Etanol (grado de microbiología)</td><td>Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo (grado de reactivo ACS)</td><td>EMD</td><td>EX0240-9</td><td>Inflamable</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (Certificado ACS)</td><td>EMD</td><td>AX0073</td><td>Guaiacol corrosivo</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1136</td><td>Nocivo por ingestión, corrosivo</td></tr><tr><td>Columna capilar HP-5</td><td>Agilent</td><td>19091J-577</td><td>60 m x 0,18 mm diámetro interno, 0,18 &mu; m espesor</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (certificado ACS)</td><td>EMD</td><td>HX0603P</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano 99:1% (BSTFA)</td><td>Fluka</td><td>15238</td><td>Inflamable, causa quemaduras en la piel y daños oculares por contacto con</td></tr><tr><td>Na2SO4 (grado FCC)</td><td>VWR</td><td>BDH8026</td><td></td></tr><tr><td>NaClO2 (80%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244155</td><td>Inflamable, tóxico&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH (certificado ACS)</td><td>EMD</td><td>1.06498.1000</td><td>Cintas</td></tr><tr><td>de prueba de pH de alcácidos</td> corrosivos <td>Fisher</td><td>A979</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico (certificado ACS)</td><td>Espectrómetro</td> de masas Fisher <td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Polaris Q&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piridina (99%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12005</td><td>Inflamable, tóxico en contacto con la piel</td></tr><tr><td>Switchgrass</td><td>Cherry Research Farm Goldsboro, NC</td><td>N/A</td><td>Cosechado en agosto de 2011</td></tr><tr><td>Cromatógrafo de gases traza Thermo Finnigan</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman n.º 1 papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos para facilitar el crecimiento microbiano en los flujos de residuos de las fábricas de celulosa y caracterización del potencial de biodegradación de los microbios cultivados

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

El proceso kraft se aplica a las astillas de madera para separar la lignina de los polisacáridos dentro de la lignocelulosa para la pulpa que producirá un papel de alta calidad. El licor negro es un residuo de pulpa generado por el proceso kraft que tiene potencial para la bioconversión posterior. Sin embargo, la naturaleza recalcitrante de los recursos de lignocelulosa, sus derivados químicos que constituyen la mayoría del carbono orgánico disponible dentro del licor negro y su pH básico presentan desafíos para la biodegradación microbiana de este material de desecho. Los métodos para la recolección y modificación del licor negro para el crecimiento microbiano tienen como objetivo la utilización de este residuo de pulpa para convertir la lignina, los ácidos orgánicos y los subproductos de la degradación de polisacáridos en productos químicos valiosos. Las técnicas de extracción de lignocelulosa presentadas proporcionan un método reproducible para la preparación de sustratos de crecimiento de lignocelulosa para comprender las capacidades metabólicas de los microorganismos cultivados. El uso de cromatografía de gases-espectrometría de masas permite la identificación y cuantificación de los productos de fermentación resultantes del crecimiento de microorganismos en los residuos de pulpa. Estos métodos, cuando se utilizan en conjunto, pueden facilitar la determinación de la actividad metabólica de los microorganismos con potencial para producir productos de fermentación que proporcionarían un mayor valor al sistema de fabricación de pasta y reducirían los residuos de efluentes, aumentando así las ganancias potenciales de la molienda de papel y ofreciendo usos adicionales para el licor negro.

La recolección y modificación del licor negro generado en el proceso de pulpa kraft (Figura 1) permitirá utilizar este residuo del proceso de pulpa para determinar la capacidad de biodegradación de un aislado bacteriano individual o de un cultivo mixto. Figura 2 muestra el crecimiento aeróbico medido por densidad óptica del aislado microbiano ambiental cultivado en medio LB solo y en medio LB suplementado con 10% de licor negro neutralizado. Estos resultados indican que esta bacteria cre...

Los desechos industriales se pueden recolectar y modificar para analizar el crecimiento microbiano. Las técnicas de extracción de lignocelulosa proporcionan componentes para analizar la capacidad específica de biodegradación. La cromatografía de gases-espectrometría de masas identifica los productos de fermentación de los microorganismos cultivados en los residuos de la fabricación de pulpa. Estos métodos determinan la capacidad metabólica de los microorganismos para degradar los residuos de pulpa.

Métodos para facilitar el crecimiento microbiano en los flujos de residuos de las fábricas de celulosa y caracterización del potencial de biodegradación de los microbios cultivados

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la capacidad de un microorganismo o consorcio de microorganismos para utilizar el residuo de la pulpa denominado licor negro como medio para el crecimiento, identificar los componentes del licor negro que se utilizan para dicho crecimiento y caracterizar los productos generados por el metabolismo microbiano de este residuo de la pulpa. Esto se logra recolectando el residuo de la pulpa, el licor negro, y preparándolo para su uso como componente de un medio de cultivo. Como segundo paso, se extraen los componentes lignocelulósicos, los cuales se utilizan para determinar los requerimientos de fuentes de carbono de los microorganismos.A continuación, se preparan, inoculan y analizan medios para evaluar el crecimiento microbiano con el fin de determinar la capacidad de los microorganismos para crecer en licor negro y sus componentes. Los resultados muestran la utilización del licor negro como única fuente de carbono para el crecimiento y la síntesis de productos metabólicos por parte del aislado microbiano ambiental, basado en su crecimiento visualizado en placas de agar con medio mínimo y mediante GC-MS. Tuvimos la idea inicial de este método cuando discutíamos la posibilidad de que los microbios pudieran crecer en residuos de la pulpa y que podríamos ser capaces de aislar estos microorganismos directamente de una fábrica de pulpa.La principal ventaja de la técnica de extracción de celulosa zignal frente a los métodos existentes hoy en día, como el blanqueo con hidróxido de sodio, es que el blanqueo con cloruro de sodio ofrece una pureza alta y aumentada. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación de la celulosa Theo y de la muestra para GCMS son difíciles de aprender debido al número de etapas requeridas y a la necesidad de una determinación visual para verificar la finalización del proceso.Este método no solo puede proporcionar información sobre la degradación microbiana del licor negro, sino que también puede aplicarse a efluentes industriales que contienen materiales de celulosa Magno, como residuos agrícolas, residuos forestales y residuos sólidos municipales. Para comenzar este procedimiento, recolecte la muestra de licor negro a través de la válvula de salida conectada al digestor artesanal y colóquela en un frasco de vidrio estéril, dejándola enfriar a temperatura ambiente antes de pasar al siguiente paso. A continuación, agregue 100 mililitros de la muestra de licor negro a un vaso de precipitados de 500 mililitros equipado con una barra de agitación y agite la muestra a velocidad media.Neutralice la licor negro añadiendo ácido fosfórico gota a gota hasta que se vuelva viscoso. A continuación, transfiera todo el licor negro a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue las muestras a 9.300 G durante 30 minutos. Para separar los carbohidratos, coloque cinco gramos de pasto switch molido de un milímetro o menos y una barra de agitación en un matraz de 500 mililitros.Luego agregue 200 mililitros de agua destilada, 7,5 gramos de clorito de sodio y 2,5 mililitros de ácido acético glacial. Coloque el matraz en un baño de aceite situado encima de una placa agitadora a 80 grados Celsius durante una hora. A continuación, agregue 7,5 gramos adicionales de cloruro de sodio y 2,5 mililitros de ácido acético glacial al matraz.Continúe agitando a 80 grados Celsius durante 30 minutos después de repetir el paso anterior dos veces. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Luego, filtre a través de un embudo Buchner bajo vacío para aislar el material sólido.Lave el material sólido tres veces con 100 mililitros de agua destilada. A continuación, recoja un gramo del material sólido y colóquelo sobre una hoja limpia de papel de filtro. Deje el sólido a 50 grados Celsius para que seque durante la noche.Después de retirar la muestra del horno al día siguiente, transfiérala a un vial de almacenamiento etiquetado como celda hueca. Añada el material sólido restante a un matraz de 500 mililitros que contenga 250 mililitros de hidróxido de sodio al 10%, y tape el matraz con el tapón. Coloque la solución en un incubador a 70 grados Celsius durante una hora con agitación a 250 RPM.A continuación, deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, aísle el material sólido mediante filtración al vacío utilizando un embudo de Buchner. Una vez que el residuo sólido se haya secado durante toda la noche en una estufa a 50 grados Celsius, colóquelo en un frasco de almacenamiento etiquetado como celulosa. Transfiera el filtrado a un matraz de 500 mililitros y agregue 30 mililitros de ácido acético y 250 mililitros de alcohol isopropílico; tape y coloque la solución resultante sobre la mesa de trabajo durante al menos ocho horas a temperatura ambiente.Una vez finalizado, transfiera toda la solución a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue la muestra a 9.300 G durante 30 minutos. Tras la centrifugación, retire cuidadosamente la solución de los tubos cónicos con una pipeta y deséchela. A continuación, lave los sedimentos con 30 mililitros de agua destilada mediante vortex y centrifugue a 9.300 G durante 30 minutos.Repita este paso 15 veces para lavar completamente el precipitado. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante para aislar el precipitado y liofilizarlo. Una vez que la muestra haya sido liofilizada, colóquela en un vial etiquetado como hemicelulosa.Para la separación de lignina, agregue cinco gramos de pasto switch molido de un milímetro o menos a una solución de 500 mililitros de hidróxido de sodio 0,25 molar y etanol al 30%. Coloque la suspensión en un incubador a 75 grados Celsius con agitación a 250 RPM durante dos horas. Después de filtrar la solución enfriada, agregue una barra de agitación al matraz y colóquelo sobre una placa de agitación ajustada a velocidad media.Añada ácido clorhídrico concentrado gota a gota al filtrado hasta obtener un pH de dos. Deje la solución reposar durante la noche a temperatura ambiente. Una vez que la solución se haya transferido a tubos cónicos de 50 mililitros, centrifugue las muestras a 9.300 ×g durante 30 minutos.Una vez finalizado, pipetee cuidadosamente la solución fuera del tubo cónico y desecharla. Lave el precipitado con 30 mililitros de agua destilada mediante vortex y centrifugue a 9.300 G durante 30 minutos. Repita este paso 15 veces para lavar completamente el precipitado.Después de la centrifugación, retire el sobrenadante para aislar el precipitado y liofilizarlo. Una vez liofilizado, coloque la muestra en un vial etiquetado como lignina. Añada 50 mililitros de medio mínimo M nueve estéril a un matraz estéril de 125 mililitros.Luego, agregue 10% en volumen del licor negro al medio. Para la inoculación, agregue 0,1% en volumen de un cultivo bacteriano de crecimiento nocturno a la mezcla e incube los cultivos a 37 grados Celsius en un incubador con agitación a 200 rpm. En la fase logarítmica media, transfiera las bacterias a un frasco sérico estéril sellado anaeróbico utilizando una jeringa tras la centrifugación de los cultivos bacterianos no inoculados e inoculados.Después de 450 horas de crecimiento, agregue 10 mililitros de cada sobrenadante en tubos de ensayo de vidrio separados. Acidifique cada sobrenadante con ácido clorhídrico concentrado añadido gota a gota hasta pH de uno a dos. Para cada muestra, agregue 30 mililitros de acetato de etilo al sobrenadante.Después de tapar el tubo de ensayo, mezcle la solución invirtiendo el tubo de cuatro a seis veces. Luego coloque de uno a dos gramos de sulfato de sodio anhidro en un tubo de ensayo de vidrio limpio. Recolecte cuidadosamente la capa orgánica superior pipeteando con la pipeta Pasteur de vidrio desechable.Coloque la capa orgánica en el tubo de ensayo que contiene sulfato de sodio anhidro. Deshidrate la capa orgánica sobre sulfato de sodio anhidro golpeando suavemente el tubo de ensayo para mezclar gradualmente. Añada pequeñas cantidades de sulfato de sodio anhidro y mezcle hasta que no haya grumos grandes.A continuación, filtre la solución a través de un embudo Buchner bajo vacío, luego transfiera la solución a un matraz evaporador y evapore el filtrado utilizando un evaporador rotatorio. Al finalizar, coloque tres miligramos de los residuos de la extracción con acetato de etilo en un vial de cromatografía ámbar de dos mililitros. Disuelva el residuo con 100 microlitros de dioxano 1,4 y 10 microlitros de piridina.Luego, agregue 50 microlitros de una solución de B-S-T-F-A con 1% de cloruro de trimetilo al vial. Coloque la solución en un incubador a 60 grados Celsius con agitación durante 15 minutos. Analice la muestra mediante GCMS.La recolección y modificación del licor negro generado en el proceso artesanal de pulpa permite, en primer lugar, utilizar este residuo del pulpeado para determinar la capacidad de biodegradación de un aislado bacteriano individual o de una cultura mixta. Aquí se muestra el crecimiento aeróbico medido mediante la densidad óptica de una cepa ambiental cultivada en medio LB y en medio LB suplementado con 10% de licor negro neutralizado. Estos resultados indican que esta bacteria crece en presencia de licor negro.El crecimiento del aislado ambiental en medio LB es más rápido que cuando se cultiva en presencia de licor negro, pero la densidad óptica comienza a disminuir después de 62 horas. Mientras que el crecimiento del aislado microbiano ambiental en presencia de licor negro continúa aumentando en densidad óptica hasta después de 230 horas de cultivo. La curva de crecimiento del aislado microbiano ambiental en presencia de licor negro también muestra un crecimiento bifásico, lo que sugiere que el licor negro contiene más de una fuente de carbono que puede ser utilizada por el aislado microbiano ambiental, y que existe una preferencia en la utilización de nutrientes exhibida por la bacteria.Se necesitan experimentos adicionales para determinar su capacidad de utilizar licor negro para satisfacer sus requerimientos de crecimiento. También se puede determinar el crecimiento de una bacteria en licor negro no neutralizado o evaluar el efecto de concentraciones crecientes de licor negro sobre el crecimiento. Tras demostrar el crecimiento en licor negro, se puede determinar la utilización de fuentes de carbono mediante experimentos de crecimiento en medios mínimos.Los sustratos comerciales que componen la lignocelulosa pueden utilizarse como fuentes de carbono en medios mínimos. El protocolo de extracción de LIGNOCELLULOSE presentado aquí proporciona un modelo para determinar los requisitos de crecimiento de la bacteria mostrada. Aquí se observa el crecimiento del aislado microbiano ambiental en agar M nueve, un medio mínimo suplementado con cada componente de la extracción de lignocelulosa.La presencia de colonias en las placas de agar con medio mínimo indica la capacidad del aislado ambiental para degradar holocelulosa, celulosa, hemicelulosa y lignina, colonias presentes en M nueve. El medio mínimo podría sugerir la capacidad del aislado ambiental para degradar agar en lugar de las placas. Las curvas de crecimiento en medio mínimo para cultivos líquidos también podrían utilizarse para determinar la tasa específica de crecimiento sobre cada fracción de lignocelulosa, de modo que no sería necesario añadir agar, que podría ser una fuente de carbono potencial.El análisis mediante GC-MS de extractos y derivados de ojos, y cultivos bacterianos revela los productos metabólicos producidos. Aquí se muestra el espectro GC-MS de los derivados de TMS presentes en la muestra no inoculada, y el espectro de los derivados de TMS producidos por el aislado microbiano ambiental cuando se cultiva de forma anaeróbica en medio mínimo M9, con 10% de licor negro no neutralizado, que se presenta aquí. La comparación de los dos espectros revela diferencias en los componentes presentes en el medio, lo que sugiere la presencia de productos de fermentación y la degradación de componentes del licor negro.Un pico con un tiempo de retención de 39,34 minutos apareció en la muestra inoculada. Un pico con un tiempo de retención de 21,84 minutos aumentó en la muestra inoculada. Un pico con un tiempo de retención de 25,79 disminuyó en la muestra inoculada.El espectro mostrado aquí corresponde al patrón de aguacate, que se utilizó para identificar el pico con un tiempo de retención de 25,79 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar si un microorganismo o un consorcio de microorganismos puede degradar el licor negro. Además, siguiendo este protocolo, puede utilizar otros métodos, como las curvas de crecimiento, para responder preguntas adicionales sobre la tasa de crecimiento de un microorganismo o microorganismos en diversas concentraciones de componentes del extracto de licor negro o de lignocelulosa.

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