Métodos para facilitar el crecimiento microbiano en los flujos de residuos de las fábricas de celulosa y caracterización del potencial de biodegradación de los microbios cultivados

El objetivo general del siguiente experimento es determinar la capacidad de un microorganismo o consorcios de microorganismos para utilizar el residuo de pulpa de licor negro para el crecimiento, los componentes del licor negro que se utilizan para el crecimiento y los productos producidos por el metabolismo microbiano de este residuo de pulpa. Esto se logra recolectando los residuos de pulpa de licor negro y preparándolos para su uso como componente del medio de cultivo. Como segundo paso, se extraen los componentes de lignocelulosa, que se utilizan para determinar los requisitos de fuente de carbono de los microorganismos.

Los siguientes medios se preparan, inoculan y analizan para el crecimiento microbiano con el fin de determinar la capacidad de los microorganismos para crecer en el licor negro y sus componentes. Los resultados muestran la utilización del licor negro como única fuente de carbono para el crecimiento y la síntesis de productos metabólicos por el aislado ambiental microbiano basado en su crecimiento visualizado en placas de agar de medios mínimos, y por GCMS. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando estábamos discutiendo la posibilidad de que los microbios pudieran crecer en los productos de desecho de la pulpa y que podríamos aislar estos microbios directamente de una fábrica de celulosa.

La principal ventaja de la técnica de extracción de celosa zignal sobre el método existente en la actualidad, como el blanqueo con hidróxido de sodio, es que el blanqueo con cloruro de sodio ofrece una pureza alta y aumentada. La demostración visual de este método es fundamental. Como Theo, los pasos de preparación de muestras de celulosa y GCMS son difíciles de aprender, y esto se debe a la cantidad de pasos necesarios y a la determinación visual necesaria para verificar la finalización del proceso.

Este método no solo puede proporcionar información sobre la degradación microbiana del licor negro, sino que también se puede aplicar a flujos de desechos industriales que contienen materiales de celulosa Magno, como residuos de cultivos, residuos forestales y desechos sólidos municipales. Para comenzar este procedimiento, recoja la muestra de licor negro de la válvula de salida conectada al digestor artesanal y una botella de vidrio estéril, y deje que se enfríe a temperatura ambiente antes de continuar con el siguiente paso. A continuación, añada 100 mililitros de la muestra de licor negro a un vaso de precipitados de 500 mililitros equipado con una barra de agitación y agite la muestra a velocidad media.

Neutralizar el licor negro añadiendo ácido fosfórico gota a gota hasta que se vuelva viscoso. Después de esta alícuota, toda la solución de licor negro en tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugar las muestras a 9.300 Gs durante 30 minutos. Para separar los carbohidratos, coloque cinco gramos de pasto varilla molido de un milímetro o menos y una barra para revolver en un matraz de 500 mililitros.

Luego agregue 200 mililitros de agua destilada, 7,5 gramos de clorito de sodio y 2,5 mililitros de ácido acético glacial. Coloque el matraz en un baño de aceite colocado encima de una placa de agitación a 80 grados centígrados durante una hora. A continuación, añada 7,5 gramos adicionales de cloruro de sodio y 2,5 mililitros de ácido acético glacial al matraz.

Continúe revolviendo a 80 grados centígrados durante 30 minutos después de repetir el paso anterior dos veces. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Luego fíltralo a través de un embudo buchner al vacío para aislar el material sólido.

Lave el material sólido tres veces con 100 mililitros de agua destilada. A continuación, recoja un gramo del material sólido y colóquelo sobre una hoja limpia de papel de filtro. Coloque el sólido a 50 grados centígrados para que se seque durante la noche.

Después de retirar la muestra del horno al día siguiente, transfiérala a un vial de almacenamiento etiquetado como de celda hueca. Agregue el material sólido restante a un matraz de 500 mililitros que contenga 250 mililitros de hidróxido de sodio al 10% y tape el matraz con el tapón. Coloque la solución en una incubadora a 70 grados centígrados durante una hora agitando a 250 RPM.

Después de esto, deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente Después de 30 minutos, aísle el material sólido mediante filtración al vacío con un embudo buchner. Una vez que el residuo sólido se haya secado durante la noche en un horno a 50 grados centígrados, colóquelo en un frasco de almacenamiento etiquetado como celulosa. Transfiera el filtrado a un matraz de 500 mililitros y agregue 30 mililitros de ácido acético y 250 mililitros de tapón de alcohol isopropílico y coloque la solución resultante en la mesa de trabajo durante al menos ocho horas a temperatura ambiente.

Cuando termine, transfiera toda la solución a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugue la muestra a 9.300 Gs durante 30 minutos. Después de la centrifugación, pipetee cuidadosamente la solución fuera de los tubos cónicos y deséchela. A continuación, lavar los pellets con 30 mililitros de agua destilada por vórtice y centrifugar a 9.300 Gs durante 30 minutos.

Repita este paso 15 veces para lavar a fondo el pellet. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante para aislar el pellet y liofilizarlo. Una vez que la muestra se haya liofilizado, colóquela en un vial etiquetado como hemicelulosa.

Para la separación de lignina, agregue cinco gramos de pasto varilla molido de un milímetro o más pequeño a una solución de 500 mililitros de hidróxido de sodio molar punto 25 y etanol al 30%. Coloque la lechada en una incubadora a 75 grados centígrados agitando a 250 RPM durante dos horas. Después de filtrar la solución fría, agregue una barra de agitación al matraz y colóquela encima de una placa de agitación ajustada a velocidad media.

Agregue ácido clorhídrico concentrado gota a gota al filtrado hasta obtener un pH de dos. Deje reposar la solución toda la noche a temperatura ambiente. Una vez que la solución se haya transferido a tubos cónicos de 50 mililitros, centrifugar las muestras a 9.300 GS durante 30 minutos.

Cuando termine, pipetee con cuidado la solución del tubo cónico y deséchela. Lavar el pellet con 30 mililitros de agua destilada por vórtice y centrifugar a 9, 300 Gs durante 30 minutos. Repita este paso 15 veces para lavar a fondo el pellet.

Después de la centrifugación, retire el natante supino para aislar el pellet y liofilizarlo. Una vez liofilizada, coloque la muestra en un vial etiquetado con lignina. Añada 50 mililitros de medio estéril M nine minimal a un matraz estéril de 125 mililitros.

Luego agregue el 10% por volumen del licor negro al medio. Para la inoculación, agregue 0.1% en volumen de un cultivo bacteriano nocturno a la mezcla, incube los cultivos a 37 grados Celsius en una incubadora con agitación a 200 RPM. En la fase media de registro, transfiera las bacterias a un frasco de suero anaeróbico estéril sellado utilizando una jeringa después de la centrifugación de los cultivos bacterianos inoculados e inoculados por las Naciones Unidas.

Después de 450 horas de crecimiento, agregue 10 mililitros de cada sobrenadante en tubos de ensayo de vidrio separados. Acidifique cada sobrenadante con ácido clorhídrico concentrado agregado gota a gota al pH uno a dos. Para cada muestra, agregue 30 mililitros de acetato de etilo al supra nadante.

Después de tapar el tubo de ensayo, mezcle la solución invirtiendo el tubo de cuatro a seis veces. Luego coloque uno o dos gramos de sulfato de sodio anhidro en un tubo de ensayo de vidrio limpio. Recoja con cuidado la capa orgánica superior pipeteando con la pipeta de vidrio desechable para pastos.

Coloque la capa orgánica en el tubo de ensayo que contiene el sulfato de sodio anhidro. Deshidrague la capa orgánica sobre el sulfato de sodio anhidro golpeando suavemente el tubo de ensayo para mezclar gradualmente. Agregue pequeñas cantidades de sulfato de sodio anhidro y mezcle hasta que no queden grumos grandes.

Después de esto, filtre la solución a través de un embudo buchner al vacío, luego transfiera la solución a un matraz de evaporación y evapore el filtrado usando un evaporador rotativo. Cuando termine, coloque tres miligramos de los residuos de extracción de acetato de etilo en un vial de cromatografía ámbar de dos mililitros. Disolver el residuo con 100 microlitros de un cuatro dioxano y 10 microlitros de piridina.

A continuación, añada 50 microlitros de una solución de B-S-T-F-A con 1% de cloro trimetilo al vial. Coloque la solución en una incubadora a 60 grados centígrados agitando durante 15 minutos. Analice la muestra mediante GCMS.

La recolección y modificación del licor negro generado en el proceso de fabricación artesanal de pasta permitirá utilizar este residuo de pulpa para determinar la capacidad de biodegradación de un solo aislado bacteriano o cultivo mixto. Aquí se muestra el crecimiento aeróbico medido por la densidad óptica de una cepa ambiental cultivada en medios LB y medios LB suplementados con licor negro neutralizado al 10%. Estos resultados indican que esta bacteria crece en presencia de licor negro.

El crecimiento del aislado ambiental en medios LB es más rápido que cuando se cultiva en presencia de licor negro, pero la densidad óptica comienza a disminuir después de 62 horas. Mientras que el crecimiento del aislado ambiental microbiano en presencia de licor negro continúa aumentando en densidad óptica hasta después de 230 horas de crecimiento. La curva de crecimiento del aislado ambiental microbiano en presencia de licor negro también representa un crecimiento bifásico, lo que sugiere que el licor negro contiene más de una fuente de carbono que puede ser utilizada por el aislado ambiental microbiano, y que existe una preferencia por la utilización de nutrientes exhibida por la bacteria.

Se necesitan más experimentos para determinar su capacidad para utilizar el licor negro para los requisitos de crecimiento. También se puede determinar el crecimiento de una bacteria en el licor negro no neutralizado o determinar el efecto del aumento de las concentraciones de licor negro en el crecimiento. Después de demostrar el crecimiento en el licor negro, se puede determinar la utilización de la fuente de carbono utilizando experimentos de crecimiento mínimo del medio.

Los sustratos comerciales que componen los componentes de la lignocelulosa se pueden utilizar como fuentes de carbono en los medios mínimos. El protocolo de extracción de LIGNOCELULOSA presentado aquí proporciona un modelo para determinar los requisitos de crecimiento de la bacteria que se muestra en la imagen. Agar medio mínimo suplementado con cada componente de la extracción de lignocelulosa.

La presencia de colonias en las placas de agar de medios mínimos indica la capacidad del aislado ambiental para degradar las colonias de holocelulosa, celulosa, hemicelulosa y lignina presentes en M nine. Los medios mínimos pueden sugerir la capacidad del aislado ambiental para degradar el agar en lugar de las placas. También se podrían utilizar curvas mínimas de crecimiento de los medios para cultivos líquidos para determinar la tasa específica de crecimiento en cada fracción de lignocelulosa, de modo que no fuera necesario añadir agar, que podría ser una fuente potencial de carbono.

El análisis de los ojos extraídos y derivados, cultivos bacterianos por GCMS revela los productos metabólicos producidos. Aquí se muestra el espectro GCMS de derivados de TMS presentes en la muestra no inoculada, el espectro de derivados de TMS producidos por el aislado microbiano ambiental cuando se cultiva anaeróbicamente y M nueve, medios mínimos con 10% de licor negro no neutralizado se muestra aquí. La comparación de los dos espectros revela diferencias en los componentes presentes en los medios, lo que sugiere la presencia de productos de fermentación y la degradación de los componentes del licor negro.

En la muestra inoculada apareció un pico con un tiempo de retención de 39,34 minutos. Un pico con un tiempo de retención de 21 punto 84 minutos aumentó en la muestra inoculada. Un pico con un tiempo de retención de 25,79 disminuyó en la muestra inoculada.

El espectro que se muestra aquí es el del patrón guacamole, que se utilizó para identificar el pico con un tiempo de retención de 25,79 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar si un microorganismo o un consorcio de microorganismos puede degradar el licor negro. Además, siguiendo este protocolo, puede utilizar otros métodos, como las curvas de crecimiento, para responder preguntas adicionales sobre la tasa de crecimiento de un microorganismo o microorganismos en varias concentraciones de licor negro o componentes de extracto de celulosa de ligón.