Name: La tinción histoquímica de Arabidopsis thaliana Celda Secundaria Elements Pared (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende técnicas de tinción histoquímica para visualizar elementos de la pared celular secundaria en Arabidopsis thaliana. Este método permite analizar la composición de tejidos lignificados en tallos de plantas modelo.

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Estamos agradecidos a Sabin Russell para asistencia en la edición. Este trabajo formó parte de la Joint BioEnergy Institute DOE (http://www.jbei.org) apoyado por el Departamento de Energía de los EE.UU., Oficina de Ciencia, Oficina de Investigación Biológica y Ambiental, a través del contrato DE-AC02-05CH11231 entre Lawrence Berkeley Laboratorio Nacional y el Departamento de Energía de EE.UU..

<ol><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li>
<li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewriting+the+lignin+roadmap%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li>
<li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+chemistry%E2%80%94past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Lignin chemistry—past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li>
<li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li>
<li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li>
<li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li>
<li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li>
<li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+technology%22%5BJournal%5D)">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li>
<li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence%3A+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloroglucinol+Stain+for+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li>
<li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakano%2C+J+%22The+Detection+of+Lignin+Methods+in+Lignin+Chemistry%22">The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).</li>
<li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+19th+Workshop%2FConference+of+the+Association+for+Biology+Laboratory+Education+%28ABLE%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li>
<li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li>
<li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+M%C3%A4ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li>
<li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li>
<li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos financieros que revelar.

Secciones de tallo de A. thaliana se utilizan ampliamente para estudiar la organización de las células en la pared celular secundaria y para examinar cualitativamente las diferencias entre el tipo salvaje y las plantas transgénicas. Las técnicas utilizadas para el corte de las muestras son de corte directo de las manos; o cuando las muestras están incrustados en agarosa o fijador, seccionamiento se puede hacer con un vibratome o microtomo. En contraste con el corte manual, los dos últimos permiten reducir el ri...

La pared celular vegetal tiene una gran cantidad de información dentro de sus diversos componentes: lignina, celulosa, hemicelulosa (xilano, glucuronoxilano, xiloglucano, arabinoxilano, vinculación mixta de glucano, o glucomanano), y pectina. Técnicas histológicas proporcionan importantes pistas visuales en el estudio de las diferencias dentro de las paredes celulares secundarias en los niveles de organización y celulares. Diversas técnicas histológicas fueron desarrollados y se pueden encontrar en la literatura, pero estas técnicas puede ser difícil y requiere mucho tiempo para los principiantes debido a protocolos muy detalladas con instrucciones visuales simples son rara vez disponible. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para las técnicas de tinción histológica para obtener imágenes de alta calidad. Seccionar el tejido del tallo es el primer paso en la visualización de las paredes celulares y formas celulares. Aunque las secciones cortadas a mano son baratos y requieren menos tiempo para prepararse, el uso de un vibratome ofrece consistencia yproduce imágenes de alta calidad. El uso de un vibratomo permite producir mejor calidad de los datos mediante la generación de incluso secciones con el mismo espesor, lo que ayuda a producir imágenes nítidas y reduce significativamente el riesgo de producir diferencias inexactas entre las muestras que se causada simplemente por una mala preparación de la muestra. El uso de resinas para fijar especímenes frescos puede ser un desafío para los principiantes y todavía puede llevar mucho tiempo, incluso para los expertos en el análisis que debe hacerse rápidamente. Además, se hace imposible para medir cualquier actividad biológica con la muestra cuando se ha incorporado en una resina. Una técnica simple que emplea agarosa y un molde casero es útil para la incrustación de tejidos del tallo, y también se puede utilizar en otras aplicaciones que requieren la disección de los tejidos blandos. En comparación con la incrustación de especímenes en la resina, este método tiene la ventaja de mantener los tejidos vivos y la reducción de la manipulación de la muestra. Seccionamiento tejidos a través de un vibratomo es altamente preciso y genera homogensecciones unidades organizativas, que, dependiendo del objetivo del estudio, a continuación, se pueden utilizar con varias técnicas de tinción diferentes. Los métodos más sencillos para visualizar la lignina y otros compuestos aromáticos emplean radiación ultravioleta (UV). La excitación de las moléculas de base de compuestos aromáticos por la luz UV es una técnica antigua, pero sigue siendo uno de los métodos más rápidos para la visualización de la lignina. Sin embargo, la visualización UV en realidad no es ideal para la detección de la lignina, porque la luz UV excitará otros compuestos aromáticos. La lignina se compone principalmente de tres componentes básicos, los monolignoles (alcoholes hidroxicinamil: alcohol coniferil, alcohol sinapílico y alcohol p-cumaril) 1-3. Mancha Phloroglucinol puede proporcionar pistas sobre la magnitud de cinnamaldehydes presentes en el xilema, fibras y tejidos traqueales 4. Floroglucinol es un buen indicador de cinnamaldehydes generales y puede diferenciar entre cinnamaldehydes y otros compuestos aromáticos. Los monómeros de alcohol sinapílico se pueden detectary diferenciados por el uso de Maule mancha. Azul de toluidina O es un colorante policromático y por lo tanto tiene la capacidad de manchar diferentes elementos de la pared celular en diferentes colores 5,6. El principal uso de azul de toluidina O es detectar pectina y 5,6 lignina. La ventaja de la utilización de azul de toluidina O es que muchos elementos de la pared celular pueden ser visualizados en un solo paso. Tanto calcoflúor blanco y rojo congo son fáciles de trabajar con y se pueden utilizar para visualizar celulosa. Calcofluor manchas blancas de celulosa, callosa, y otros β-glucanos, no sustituidos o sustituidos débilmente 6-9, mientras que el congo manchas rojas directamente a β-glucanos (1 → 4) y, en particular y celulosa 10,11. El objetivo de este estudio es proporcionar pautas sencillas para el uso de las técnicas de tinción antes mencionados para obtener imágenes de alta calidad a partir de A. thaliana tallos.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>Número CAS: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihidroxibenceno [Número CAS: 108-73-6]</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>Número CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>Número CAS: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Azul Toulidine O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Cloruro de bluteno, cloruro de tolonio [número CAS 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Permanganato de potasio</td><td>Sigma 223468</td><td></td><td>número CAS 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol 190 prueba</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>Número CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>3,3'-[[1,1'-bifenil]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaftaleno 1-sulfonato) [Número CAS 573-58-0]</td></tr><tr><td>Abrillantador fluorescente 28/ Calcofluor White Stain</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>Ácido 4,4'-bis[[4-[bis(2-hidroxietil)amino]-6-anilino-1,3,5-triazina-2-il]amino]estilbeno-2,2'-disulfónico [Número CAS 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td></td><td>Leica Leica Microtomo de cuchilla vibratoria VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr> <tr><td>Razor</td><td>American Safety empresa de maquinillas de afeitar</td><td>Artículo # 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Hoja de doble filo de acero inoxidable (Personna Super)</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (0,6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Mitt</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Protector de manos caliente Mitt</td></tr><tr><td>Adhesivo para tejidos</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Tienda en 4 &deg; C o 20 &deg; C para 3 meses o más de almacenamiento</td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Adhesivo instantáneo para tejidos&nbsp;</td></tr><tr><td>Cámara con chip CCD sin obturador mecánico&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Cámara a color de alta velocidad&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Software de cámara&nbsp;</td><td>&nbsp; Molecular Devices</td><td>MetaMorph versión 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaginando análisis&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cubreobjetos, Cuadrado, N.º 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Los cubreobjetos son resistentes a la corrosión y uniformemente gruesos y planos. El espesor n.º 1 es de 0,13 a 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Microportaobjetos esmerilados, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan embalaje</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 Cubo de filtro TX2 Filtro</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>utilizado para el análisis de rojo Congo con un paso de banda de 560/40.</td></tr></tbody></table>

la tinción histoquímica de<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; celda secundaria elements pared

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana es un organismo modelo comúnmente utilizado para comprender y manipular diversos procesos celulares en las plantas, y se ha utilizado ampliamente en el estudio de la formación de la pared celular secundaria. La deposición de la pared celular secundaria ocurre después de que se establece la pared celular primaria, un proceso llevado a cabo exclusivamente por células especializadas, como las que forman tejidos de vasos y fibras. La mayoría de las paredes celulares secundarias están compuestas de celulosa (40-50%), hemicelulosa (25-30%) y lignina (20-30%). Se han aislado varias mutaciones que afectan a la biosíntesis de la pared celular secundaria, y los mutantes correspondientes pueden o no presentar cambios obvios en la composición bioquímica o fenotipos visuales, ya que estas mutaciones podrían estar enmascaradas por respuestas compensatorias. Los procedimientos de tinción se han utilizado históricamente para mostrar diferencias sobre una base celular. Estos métodos son exclusivamente medios de análisis visuales; Sin embargo, su papel en el análisis rápido y crítico es de gran importancia. El rojo Congo y el blanco de calcofluor son tinciones que se usan para detectar polisacáridos, mientras que Mäule y floroglucinol se usan comúnmente para determinar diferencias en la lignina, y el azul de toluidina O se usa para teñir diferencialmente polisacáridos y lignina. Las técnicas aparentemente simples de seccionamiento, tinción e imágenes pueden ser un desafío para los principiantes. Comenzando con la preparación de muestras utilizando el modelo de A. thaliana, este estudio detalla los protocolos de una variedad de metodologías de tinción que se pueden implementar fácilmente para la observación de la organización de células y tejidos en las paredes celulares secundarias de las plantas.

Stem inclusión y corte: El uso del molde de plástico hecha en casa para incrustar los tallos en 7% de agarosa demostrado ser rápido y fácil (Figura 1). Las dos partes (A y B; Figura 1) del sistema vial incrustado hacen que sea sencillo para liberar fácilmente el vástago incrustado en agarosa, tal como la agarosa no se pegue a las partes de los viales que son inertes, mantener el sistema limpio. Los viales se pueden reutilizar varias veces por año. La conveniencia de almacenar el ...

La composición de la pared celular de la planta varía según el tipo de tejido y puede incluir lignina, celulosa, hemicelulosas y pectina. Se han desarrollado varias técnicas de tinción para visualizar las diferencias a nivel de tipo de célula. Este artículo es una recopilación de las técnicas de tinción de pared celular más utilizadas.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

El objetivo general de este procedimiento es mostrar la tinción histoquímica de los elementos de la pared celular secundaria ANA de Arabidopsis. Esto se logra primero incrustando el tallo de la planta en aros. Luego, el tallo incrustado en aros se desmolda y se transfiere a discos de muestra, que posteriormente se seccionan en cortes transversales de STEM utilizando un vibrátomo.A continuación, las secciones se someten a diversos procedimientos de tinción histoquímica. Finalmente, se utiliza microscopía para mostrar los cambios diferenciales en los elementos de la pared celular secundaria obtenidos mediante la tinción histoquímica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la pared celular, como los cambios en los tejidos maculares de los tallos de las plantas.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque pasos sencillos pero críticos mencionados en los protocolos aquí presentados no han sido documentados exhaustivamente ni presentados de manera sencilla anteriormente. Para comenzar, prepare un molde casero para incrustar los tallos utilizando viales de plástico. Primero, use una cuchilla de afeitar para cortar la base cónica de un tubo microcentrífugo de dos mililitros con tapón roscado.Este componente se denomina parte A con una perforación de aguja de jeringa, y un orificio en la tapa del tubo ligeramente mayor que el diámetro del vástago que se insertará. A continuación, corte medio centímetro del fondo de un tubo microcentrífugo de 0,6 mililitros. Este componente se denominará parte B. Introduzca la porción cortada de medio centímetro del tubo microcentrífugo de 0,6 mililitros en el tubo microcentrífugo de dos mililitros previamente cortado.Selle las dos partes utilizando paraformo. Con una cuchilla de afeitar, corte una sección del tallo de la zona de interés, derrita una solución de aros al 7 % en el microondas a baja intensidad. Una vez que el aros derretido se enfríe a aproximadamente 50 grados Celsius, pipetee lentamente cinco mililitros del agros dentro del molde plástico previamente preparado para llenar el vial.Después de que el aeros se enfríe durante 30 a 60 segundos y se vuelva semisólido, coloque el vástago en el vial lleno de aeros. Luego, coloque la tapa perforada de manera que la punta del vástago quede sujeta por la tapa. Deje el vial a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius durante 10 a 30 minutos hasta que se solidifique.Retire el molde deslizándolo suavemente fuera del tubo. Abra la película de parafina y empuje suavemente con el pulgar la parte inferior de la sección B del molde para liberar los aros solidificados de la sección A sobre un portaobjetos de vidrio. Corte deslizante.Introduzca el tallo en el aros y córtelo en tres trozos aproximadamente iguales de 1,2 centímetros de longitud. Retire la parte del tallo que no estaba en el aros y deséchela. Asegúrese de que el disco de la muestra esté limpio y completamente seco.Utilice toallitas de papel suaves para eliminar cualquier humedad del bloque de aros que contiene las muestras. Coloque una pequeña gota de adhesivo tisular sobre el disco de la muestra. Coloque rápidamente el bloque de aros de manera que las muestras queden perpendiculares a la placa para secciones transversales o paralelas a la placa.Para secciones transversales longitudinales, deje que el adhesivo fije la muestra al disco de especimen a temperatura ambiente o a cuatro grados Celsius durante 10 a 30 minutos. Fije el disco de especimen en su lugar sobre la bandeja tampón o cubeta de modo que el bloque de aros con las secciones quede paralelo a la cuchilla de afeitar. Llene la bandeja tampón con agua destilada a temperatura ambiente hasta que las muestras queden completamente sumergidas.Corte una cuchilla de afeitar por la mitad y luego recorte los extremos con tijeras resistentes para que la cuchilla permanezca completamente plana. Fije la mitad de la cuchilla previamente cortada al porta-cuchilla. Ajuste el ángulo del porta-cuchilla a 84 grados, la velocidad a 0.90 milímetros por segundo y la frecuencia a 50 hercios.Corte las secciones a un grosor de 100 micrones utilizando el modo continuo. Recolecte las secciones usando una pipeta plástica desechable durante el corte en la bandeja de tampón. Transfiera algunas secciones a tubos microcentrífugos de dos mililitros para la tinción con fluorol.Transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga. Añada un mililitro de la solución de fluorol al tubo y tápelo inmediatamente. Dado que el ácido clorhídrico en la tinción de fluoro gluc anol es altamente corrosivo, mueva suavemente el tubo para asegurar que todas las secciones queden teñidas.Pipetee suavemente las secciones hacia una punta de pipeta cortada y sobre un portaobjetos de microscopio. Cubra las secciones con un cubreobjetos. Observe las secciones bajo iluminación de campo brillante.La solución se seca en cinco a 10 minutos, lo que provoca un deterioro de los especímenes. Por lo tanto, la obtención de imágenes debe completarse dentro de ese período de tiempo. Para la tinción con mal, transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga.Añada un mililitro de la solución de permanganato de potasio al 0,5 % al tubo que contiene las secciones. Pipetee la solución de permanganato de potasio al 0,5 % suavemente hacia arriba y hacia abajo, preferiblemente sin perturbar las secciones. Después de una incubación de dos minutos y una repetición del pipeteo, deje reposar el tubo de microcentrífuga hasta que todas las secciones se sedimenten por completo.Utilizando una pipeta de un mililitro, extraiga 700 microlitros de solución de permanganato de potasio al 0,5 %, agregue 700 microlitros de agua destilada para enjuagar el permanganato de potasio. Repita tres o cuatro veces o hasta que la solución acuosa permanezca clara. Después de desechar rápidamente el agua, agregue un mililitro de ácido clorhídrico al 3 % hasta que el color marrón intenso desaparezca de las secciones.Esto puede ocurrir dentro de los tres a cinco minutos o puede requerir dos lavados de cinco minutos. Aspire con pipeta toda la solución de ácido clorhídrico al 3% y agregue inmediatamente un mililitro de solución concentrada de hidróxido de amonio. Antes de la imagenología con iluminación de campo claro para la tinción con rojo Congo, transfiera las secciones del tallo a un tubo microcentrífugo y agregue un mililitro de la solución de rojo Congo al 0,5%.Pipetee suavemente la solución de rojo de congo al 0,5 % hacia arriba y hacia abajo sin perturbar las secciones. Antes de incubar y lavar las secciones según se describe en el protocolo del texto, pipetee suavemente los especímenes a una punta de pipeta cortada y colóquelos sobre un portaobjetos. Luego, cúbralos con un cubreobjetos.Observe las muestras al microscopio. Deslice bajo excitación con luz azul utilizando un filtro de emisión de 560 nanómetros para la tinción con calcior blanco. Transfiera las secciones del tallo a un tubo de microcentrífuga y agregue un mililitro de la solución de calcior blanco al 0,02 %.Pipetee suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo. Proceda a incubar y lavar las secciones según se detalla en el protocolo escrito antes de observar las secciones bajo luz ultravioleta. Para la tinción con azul de toluidina O, transfiera las secciones del tallo a un tubo microcentrífugo.Luego, agregue un mililitro de la solución de azul de toluidina O al 0,02 % al tubo e impulse suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo con una pipeta. A continuación, incube y lave las secciones según se describe en el protocolo escrito antes de observarlas bajo iluminación de campo claro. Consulte el protocolo escrito para obtener detalles sobre la configuración del microscopio y de la cámara para la obtención de imágenes, así como para el procedimiento de imagen ultravioleta y de campo claro.Los compuestos aromáticos, incluyendo la lignina en las células, pueden visualizarse mediante su autofluorescencia bajo luz ultravioleta. Los vasos xilemáticos y las fibras interfásicas mostraron autofluorescencia bajo iluminación UV, pero no en la médula, el córtex ni la epidermis, porque la lignina y el polímero aromático se depositan durante la formación de la pared celular secundaria, mientras que la tinción con fluorol reacciona con los grupos aldehído terminales de la lignina para producir un color rosa o fucsia, como se observa bajo iluminación UV. Se observa una coloración fucsia en los vasos xilemáticos y las fibras interfásicas, pero está ausente en la médula, el córtex y la epidermis.Por lo general, la intensidad del color se correlaciona de manera cualitativa con el grado de lignificación. La tinción MALS es específica para detectar las unidades de lignina ingal en el xilema y las fibras interfasciculares. La coloración roja indica la presencia de unidades de lignina ingal en los elementos lignificados.Sin embargo, se observa una coloración roja más intensa en las fibras en comparación con los tejidos del xilema, lo que sugiere que las fibras contienen un mayor nivel de lignina ingal, mientras que el xilema está más enriquecido en unidades de lignina guai. Se observaron secciones del tallo teñidas con blanco de calcio bajo luz ultravioleta y se reveló que la epidermis, el córtex y la médula fueron teñidos porque todos estos tejidos contienen celulosa como polímero de polisacárido principal en sus paredes celulares. Las secciones teñidas con rojo Congo se observaron bajo excitación con luz azul y también tiñeron la epidermis, el córtex y la médula.En contraste con el calcior, el rojo Congo tiñe mejor los polisacáridos en el xilema y las fibras interfasciculares y parece menos afectado por la presencia de lignina y yodo. El azul O se clasifica como un colorante policromático porque produce un espécimen multicolor. El yodo azul O es un colorante iónico que se une a grupos con carga negativa y genera diferentes colores.Cuando el colorante se une a diferentes grupos iónicos en la célula, la tinción con azul de astra en secciones transversales de tallo reveló que el xilema y las fibras interfasciculares están lignificadas, ya que presentan una coloración verde azulada o azul, lo cual concuerda con los resultados de UV y con la fluoro glucana. En contraste, los tejidos de médula, corteza y epidermis muestran una coloración verde azulada o azul porque, aunque no están lignificados, contienen algunos polímeros de pectina en sus paredes celulares. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo seccionar tallos vegetales y teñir diferencialmente los diversos tejidos de la pared celular vegetal con diferentes coloraciones histoquímicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, describimos la técnica de tinción de Wiesner para teñir la lignina presente en células vegetales especializadas. Esta técnica de tinción ayuda a visualizar las paredes celulares lignificadas en los tallos de Arabidopsis thaliana y ayuda a cuantificar la lignificación en las paredes celulares de diferentes tipos de células.

Tinción de Wiesner para la visualización de lignina: una técnica para teñir los depósitos de lignina presentes en los tallos de Arabidopsis thaliana

En este video, describimos la técnica de tinción de Maule para teñir la sirigina lignina presente en las células vegetales especializadas. Esta técnica de tinción ayuda a caracterizar la distribución de lignina en el xilema y las fibras interfasciculares.

Tinción de Maule para lignina: una técnica para caracterizar la distribución de lignina en secciones de tallo de Arabidopsis thaliana

En este video, demostramos el método de tinción de rojo Congo para visualizar los depósitos de celulosa en las secciones del tallo de Arabidopsis thaliana.

Tinción de rojo Congo: una técnica para visualizar depósitos de celulosa en secciones de tallo de plantas

En este video, describimos un procedimiento de tinción para visualizar la deposición de celulosa dentro de las paredes celulares de Arabidopsis thaliana, una planta dicotiledónea, utilizando blanco de calcofluor, que se une específicamente a los glucanos ligados a β, exhibiendo fluorescencia bajo luz UV.

Tinción con blanco de calcoflúor: un método simple para la visualización de fluorescencia inducida por UV de depósitos de celulosa en las paredes celulares de secciones de tallo de plantas dicotiledóneas

Este video muestra una técnica de inmunotinción para localizar proteínas arabinogalactanos (AGPs) y pectinas en tejidos vegetales. Las secciones de tejido vegetal fijas e incrustadas en resina se tiñen con anticuerpos primarios y secundarios fluorescentes específicos de AGP y pectina y un colorante fluorescente que se une a la celulosa para revelar su colocalización específica del tejido en la pared celular.

Inmunolocalización de proteínas arabinogalactanos y pectinas en tejido vegetal

Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo cargar el CFDA en diferentes sitios de las partes inferiores de Arabidopsis. A continuación, presentamos el patrón de distribución resultante de CF en los brotes.

Movimiento de shootward de CFDA Tracer cargado en los tejidos de sumidero inferior de Arabidopsis

Este protocolo describe en detalle cómo se fija el material vegetal para la inmunolocalización de proteínas y pectinas arabinogalactanas, incrustado en una resina acrílica hidrófila, seccionado y montado en toboganes de vidrio. Mostramos que los epítopos relacionados con la pared celular se detectarán con anticuerpos específicos.

Inmunolocalización fluorescente de proteínas arabinogalactanas y pectinas en la pared celular de los tejidos vegetales

Aquí se introducen varios métodos de uso común para estudiar los eventos de tráfico de membrana de una quinasa receptora de membrana plasmática. Este manuscrito describe protocolos detallados que incluyen la preparación del material vegetal, el tratamiento farmacológico y la configuración de imágenes confocales.

Métodos basados en imágenes para estudiar los eventos de tráfico de membrana en células de linaje estomática

Este protocolo describe la preparación de muestras intactas de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis thaliana . El método solo requiere equipo de laboratorio común, como una aguja de inyección y pinzas de precisión, y permite obtener imágenes fluorescentes de células vivas de alta resolución de células endospermas tanto en semillas en desarrollo como maduras.

Preparación de tejido intacto para el análisis microscópico de la capa de células endospermas en semillas de Arabidopsis en desarrollo y maduras

Aprende técnicas de tinción histoquímica para visualizar elementos de la pared celular secundaria en Arabidopsis thaliana. Este método permite analizar la composición de tejidos lignificados en tallos de plantas modelo.

La tinción histoquímica de

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