Nucleósidos Trifosfatos - De la síntesis a la Caracterización bioquímica

El objetivo general de este video es demostrar el procedimiento desde la síntesis de los fosfatos nucleósidos modificados hasta su caracterización bioquímica completa. Esto se logra convirtiendo primero el precursor de nucleósido adecuadamente protegido en el trifosfato correspondiente mediante la aplicación de un procedimiento de cuatro pasos, una olla. El segundo paso es purificar el trifosfato resultante, primero por precipitación y luego por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa.

A continuación, el análogo de trifosfato se caracteriza por resonancia magnética nuclear y láser asistido por matriz, DESORCIÓN, ionización, tiempo de vuelo o RMN y maloff para garantizar una alta pureza. El paso final son las reacciones de extensión del cebador y las reacciones de polimerización de la desoxinucleótido transferasa terminal o TDT. En última instancia, los productos de reacción y, por lo tanto, la aceptación del sustrato del trifosfato se analizan mediante electroforesis en gel.

La ventaja de este método en comparación con otras estrategias sintéticas como el enfoque Borge, es que se forman menos productos secundarios y, por lo tanto, la purificación es más fácil. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades, ya que es un procedimiento bastante largo e intrincado que requiere conocimientos en múltiples campos. La primera vez que tuvimos la idea de filmar este método fue cuando sintetizamos fosfatos modificados y nos resultó bastante difícil encontrar un procedimiento detallado.

Otra ventaja de este método es que se puede utilizar para abordar otras cuestiones en el campo de los ácidos nucleicos modificados. De hecho, se puede utilizar para seleccionar enzimas de ADN que catalizan una amplia gama de reacciones. Además, este método se puede utilizar para el marcaje funcional de ácidos nucleicos.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de síntesis y purificación son difíciles de aprender porque los trifosfatos son derivados polares y activados que deben manejarse con cuidado. Para empezar, evapore el nucleósido protegido con hidroxilo de tres primos adecuadamente dos veces con dos mililitros de purina anhidra antes de secar al vacío durante la noche. Al mismo tiempo, el pirofosfato de amonio seco del tribunal al vacío durante la noche del día siguiente disolvió el nucleósido en un mínimo de 200 microlitros de piridina seca.

A continuación, añada 400 microlitros de dioxano seco como disolvente de COS. Por último, añade el derivado cíclico del fósforo tres y déjalo reaccionar a temperatura ambiente durante 45 minutos. A continuación, prepare una solución de pirofosfato de butilo amonio seco en 170 microlitros de dimetilformamida seca y 58 microlitros de tri butil amina recién destilada.

Agregue la solución resultante a la mezcla de reacción y déjela reaccionar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Luego prepare una solución de yodo de 160 micromolares en 980 microlitros de purina y 20 microlitros de agua. Agregue la solución a la mezcla de reacción.

Con el fin de oxidar el centro alfa de fósforo. Deje que la solución oscura resultante revuelva a temperatura ambiente durante 30 minutos. Utilice una solución acuosa al 10% de tiosulfato de sodio para apagar el exceso de yodo.

Retire el disolvente al vacío. A continuación, añade cinco mililitros de agua y deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos para hidrolizar el trifosfato cíclico. En esta etapa, generalmente se eliminan los grupos protectores.

En consecuencia, agregue un 30% de hidróxido de imodio a la muestra cruda. Revuelva durante 1,5 horas a temperatura ambiente antes de retirar el disolvente al vacío. A continuación, añade dos mililitros de agua y divide la mezcla en tubos tubulares.

Agregue 12 mililitros de una solución al 2% de clorato de sodio en acetona y centrifugue durante 30 minutos antes de repetir el procedimiento. Una vez más. Los reactivos utilizados en la síntesis a partir del trifosfato precipitarán formando un residuo aceitoso y permitiendo la separación de los disolventes, lo que simplificará sustancialmente la purificación por HPLC en fase inversa posterior al secado al aire del residuo aceitoso.

Registre un espectro de RMN P 31 de la muestra cruda de acuerdo con los procedimientos estándar. Después de la RMN, se disolvió el residuo aceitoso en cuatro mililitros de agua destilada. Comience la purificación por HPLC con la preparación de bicarbonato trietilo amonial 50 milimolar en agua ultrapura como EENT A y en nitrilo acetil al 50% como eent B como se detalla en el protocolo de texto, desgasifique ambos EENT al vacío y agitando durante 20 minutos.

Preparar una muestra analítica disolviendo 10 microlitros del trifosfato crudo en 300 microlitros de agua destilada. A continuación, utilizando un gradiente que va de 0%B a 100%B en 40 minutos. Inyecte la muestra en un sistema de HPLC equipado con una columna semipreparativa de fase inversa C 18.

Ajuste el programa de HPLC de acuerdo con el tiempo de retención del trifosfato y el difosfato. Purificar la mezcla cruda utilizando estas condiciones y eliminando las fracciones tempranas que puedan contener algo de difosfato, combinar todas las fracciones que contienen el producto y liofilizar. A continuación, se evapora varias veces con agua ultrapura.

Evaluar la pureza del trifosfato por RMN y maloff mediante la aplicación de protocolos estándar. Los rendimientos típicos obtenidos mediante la aplicación de este protocolo se encuentran en el rango del 30 al 70% dependiendo del sustrato para cinco cebadores y el etiquetado de la imprimación. Mezcle el cebador y los reactivos como se detalla en el protocolo de texto e incube la reacción de etiquetado a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Durante la reacción de etiquetado, prepare una columna de cidex G 10 taponando una punta de pipeta de un mililitro con lana de vidrio aislada y llenando la punta con solución G 10. Centrifugar y lavar tres veces con 500 microlitros de agua bidestilada y un lavado final con 50 microlitros de agua bidestilada. Después de la incubación de la reacción de etiquetado, el calor desactiva la quinasa durante 10 minutos a 70 grados centígrados.

A continuación, pase la mezcla de reacción a través del G 10. Para eliminar el gel de etiqueta radiactiva libre, purifique el cebador marcado con radio y recupere mediante la aplicación del método de trituración y remojo, el precipitado de etanol y G 10 desala el oligonucleótido eluido. Para la reacción de extensión del cebador, combine un mol PICA de cebador radiomarcado, P uno 10 moles PICA de cebador, P uno y 10 moles PICA de plantilla, T uno en 10 x tampón de reacción y arrodíllese en agua caliente.

Luego enfríe gradualmente a temperatura ambiente durante 45 minutos. Coloque el tubo en hielo y agregue el cóctel de fosfato de nucleósidos o DNTP y una unidad de hielo de ADN polimerasa. Complete la reacción con agua para un volumen total de 20 microlitros incubar a la temperatura óptima de trabajo de la enzima.

Luego agregue 20 microlitros de solución de parada y caliente las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Enfriar, las muestras a cero grados centígrados. Antes de resolver mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante.

Visualice las bandas mediante un generador de imágenes de fosfo, un generador de imágenes de fósforo para la polimerización de TDT, un cebador monocatenario diluido sin etiquetar P dos y un cebador marcado con radio en un microlitro de tampón TDT. Coloque el tubo en hielo y agregue el cóctel DNTP y la polimerasa TDT, luego incube a 37 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, agregue 10 microlitros de la solución de parada antes de calentar las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos y luego enfriar a cero grados Celsius.

Después de resolver la muestra mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante, visualice las bandas utilizando un generador de imágenes de fosfo. Aquí se muestra un espectro de RMN P 31 crudo típico de un DNTP modificado donde se pueden observar las señales características de los centros de fósforo. Además, señales provenientes del lado del difosfato y del monofosfato.

Los productos junto con los fosfatos más altos siempre se observan en esta etapa. Aquí se muestra el análisis de HPLC en fase inversa de la mezcla cruda. El pico principal corresponde a los cinco fosfatos primarios, mientras que el subproducto principal, el difosfato primario de cinco primos, muestra un tiempo de retención ligeramente menor.

Finalmente, después de una fase inversa completa, purificación por HPLC, el DNTP modificado se caracteriza por RMN y maldi para mostrar aquí el espectro de maloff de la sulfuroide, análogo de DUTP modificado. El aducto de sodio se puede ver con una sobrecarga de masa de 712.54 y no hay rastro de difosfato. Tanto el espectro de RMN P 31 como el de RMN de protones son cruciales para evaluar la pureza del dps modificado.

Dado que la presencia de colorantes no deseados y monofosfatos proporciona señales distintivas ilustradas, aquí está el resultado de las reacciones de extensión primaria con DUTP modificado con prolina trans, DATP modificado con histamina y DCTP modificado con ácido valérico utilizados como modificaciones solitarias como combinaciones de dos DN dps modificados o juntos, junto con un DGTP natural solitario. Finalmente, se analizaron reacciones representativas de polimerización mediadas por TDT con diferentes análogos de DUTP modificados con electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. En este contexto, el DUTP modificado con prolina cis y el DUTP modificado con péptidos son los mejores sustratos para la TDT.

Dado que las eficiencias de los relaves son comparables o superiores a las del DTTP natural, el DUTP modificado con urea es un sustrato bastante pobre en este contexto. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una semana si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta que los fosfatos cítricos nucleares son bloques de construcción activados por la naturaleza y, por lo tanto, se debe tener cuidado al manipularlos después de su creación.

Los investigadores en el campo de los ácidos nucleicos utilizan este método para explorar selecciones combinatorias para generar abers modificados y ácidos nucleicos catalíticos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar y caracterizar fosfatos modificados utilizando el procedimiento de cuatro pasos one pop, seguido de purificación por HPLC en fase inversa y reacciones de extensión primaria. Se harán evidentes algunos detalles experimentales que normalmente no se encuentran en las secciones experimentales.

Este método se puede utilizar en combinación con otras técnicas como la PCR para responder a preguntas adicionales. De hecho, se puede utilizar para evaluar la compatibilidad de los trifosfatos modificados con los métodos de selección en VIO.