Un In vivo Enfoque de reticulación para aislar Complejos de Proteína Desde Drosophila Los embriones
23 de abril de 2014
Complejos de proteínas con múltiples componentes juegan un papel crucial durante la función y el desarrollo celular. Aquí se describe un método usado para aislar los complejos de proteínas nativas a partir de embriones de Drosophila después de la reticulación en vivo seguido de la purificación de los complejos reticulados para el análisis de estructura-función subsiguiente.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en obtener complejos proteicos a partir de embriones vivos de drosófila mediante un enfoque de reticulación in vivo. Esto se logra primero cargando miles de moscas en una jaula de población y recolectando embriones tempranos. A continuación, las proteínas se reticulan in vivo con formaldehído, lo que estabiliza sus complejos proteicos internos.
Luego se preparan extractos proteicos a partir de los embriones reticulados para que los complejos proteicos puedan ser inmunoprecipitados. Los resultados identifican los complejos proteicos aislados mediante análisis de transferencia Western. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como el aislamiento tradicional de complejos proteicos con enfoques in vitro, es que este enfoque in vivo nos permite capturar interacciones proteína-proteína transitorias pero funcionalmente significativas, que podrían no detectarse con métodos tradicionales in vitro.
La técnica será demostrada por el Dr. Min Gao, un posdoctorado de mi laboratorio. Primero, mezcle agua y agar para moscas con una barra de agitación. Somete esta mezcla a autoclave durante el ciclo de autoclave.
Mezcle sacarosa en jugo de manzana y caliente esto a 70 grados Celsius en una placa. Posteriormente, combine las mezclas y déjelas enfriar durante 15 minutos antes de que el agar se solidifique. Prepare metil 4-hidroxibenzoato fresco en etanol.
Este es el conservante. Agréguelo a la mezcla solidificante y revuélvalo durante cinco minutos. Luego vierta la mezcla en placas de plástico o de poliestireno de 300 centímetros cuadrados sin formar burbujas.
Almacene las placas a cuatro grados Celsius y utilícelas dentro de una semana. Tenga preparada una jaula de población con 40 a 50.000 moscas para recolectar embriones. Fije dos placas recién rellenas con medio de maíz y melaza, agregando aproximadamente cuatro gramos de levadura de panadería espolvoreada sobre la superficie, a la jaula de población.
Deje que las moscas vivan en estas placas durante 48 horas a 25 grados Celsius. Después de dos días, espolvoree aproximadamente un gramo de levadura sobre dos placas de agar de jugo de manzana y sustituya las placas en la jaula de población por estas placas. Después de una hora, reemplace las placas en la jaula por otras dos del mismo tipo.
Las dos placas de recolección que las moscas utilizaron durante una hora se cargarán con embriones. Suspender los embriones y el agua en la placa y usar un pincel para ayudar a despegarlos. Luego, verterlos a través de un tamiz de dos capas.
La capa superior es una malla de acero de 850 micrones, y la capa inferior es una malla de acero de 75 micrones. Los embriones se acumularán en la malla más fina, separados de los residuos gruesos mediante un pincel. Transfiera los embriones a un recipiente de malla de nailon fino elaborado a partir de la tapa de un tubo cónico de 50 mililitros.
Lave los embriones con agua y séquelos en la malla sobre una toalla de papel. A continuación, sumerja los embriones en una solución de lejía al 50 % durante tres minutos. Agite suavemente en la lejía, luego enjuáguelos completamente con agua y séquelos con toques suaves.
A continuación, los embriones se sumergen en isopropanol durante unos 15 segundos. Con movimientos de agitación, esto deshace los grupos de embriones, y no debería tomar más de 30 segundos. Seque los embriones con papel absorbente y luego transfiéralos a una solución de heptano durante cinco minutos.
Pipetee frecuentemente el heptano sobre los embriones para evitar que se agrupen, seque los embriones con papel de filtro y enréllos con PBST. Después de enjuagar los embriones durante tres minutos, transfiéralos sobre la malla a un tubo de 15 mililitros con 10 mililitros de PBST. Retire la malla dejando los embriones en solución y observe entre 100 y 300 microlitros de embriones.
Dejar asentar en el fondo, aspirar el PBST y proceder inmediatamente con la reticulación para enlazar los embriones. Primero, añadir 10 mililitros de formaldehído al 0,2% recién preparado en PBST a los embriones. Incubarlos con agitación suave a 25 grados Celsius durante 10 minutos.
Tras 10 minutos de reacción, permita que los embriones se asienten y retire la solución. Luego, reemplace rápidamente la solución con 10 mililitros de glicina 0,25 molar en PBST para detener la reacción. Coloque el tubo en agitación durante otros cinco minutos. Tras la detención, retire la solución y lave los embriones tres veces con 10 mililitros de PBST por cada lavado.
Elimine el resto de PBST mediante aspiración con pipeta y almacene los embriones a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarios. Utilizando un homogenizador de baja velocidad y dos mililitros de tampón de lisis, homogenice 500 microlitros de embriones reticulados. Esto requiere aproximadamente 15 movimientos con una varilla ajustada.
Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga y colóquelo en agitación suave durante 15 minutos. Luego, centrifugue el lisado a 16.000 ×g durante cinco minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 15 mililitros.
El precipitado puede desecharse. Ahora, al sobrenadante, añada 40 microlitros de la suspensión de anti ha agros beet. Incube con agitación durante aproximadamente 2,5 horas después de que se complete la conjugación con las perlas.
Centrifugar las perlas a 2.500 Gs durante cinco minutos. Dejar aproximadamente 250 microlitros de sobrenadante en el tubo y resuspender las perlas en este. Transferir las perlas suspendidas a un filtro de 10 micrones en una columna de centrifugación.
Elimine la solución con una centrifugación de diez segundos a 12.000 G. Lave las perlas en la columna con 200 microlitros de tampón de lavado y realice otra centrifugación. Repita este procedimiento un total de tres veces. A continuación, agregue 40 microlitros de tampón de elución a las perlas e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos.
Agite suavemente el tubo cada cinco minutos durante este período para recoger el sobrenadante. Centrifugue la columna una vez más a 12.000 ×g durante 10 segundos. La eficacia del reticulado y de la purificación de los complejos de proteínas reticulados se analizó mediante electroforesis SDS-PAGE en un gel escalonado del 3 al 7 %, seguida de una transferencia western blot. Se utilizaron embriones que expresaban la proteína GFP con etiqueta HA para monitorear el grado de reticulado y probar diferentes concentraciones de formaldehído en el protocolo.
La mayor parte de la GFP en los embriones tratados no se entrecruzó, por lo que esto no ocurre. Se comparó un complejo de dos proteínas entrecruzadas aleatoriamente con un control sin entrecruzar. Se observan dos proteínas que no se entrecruzaron en una banda de 285 kilodalton que migra libremente.
El dos entrecruzado es más pesado y migra menos en el lisado proteico crudo. Aproximadamente la mitad de la proteína dos fue entrecruzada con su pareja que interactúa in vivo. Los compañeros que interactúan, eluidos con el péptido HA mediante comparación, presentaron tanto la proteína tubo libre como el complejo en la fracción eluida, tras lo cual se lavaron las perlas.
Tras eliminar el SDS, el tubo queda mayormente libre con complejo de tubo mínimo. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la espectrometría de masas para responder preguntas adicionales relacionadas con métodos como la identificación de componentes proteicos en los complejos aislados.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para aislar complejos proteicos nativos de embriones de Drosophila mediante un enfoque de reticulación in vivo. La técnica permite capturar interacciones proteicas transitorias que son cruciales para las funciones celulares.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Bioquímica de Proteínas
- Biología del Desarrollo
Antecedentes
- Los complejos proteicos multicomponentes son esenciales para diversas funciones celulares.
- Los métodos tradicionales pueden pasar por alto interacciones proteicas transitorias.
- El entrecruzamiento in vivo ofrece una manera de estabilizar estas interacciones.
- Los embriones de Drosophila sirven como modelo para estudiar complejos proteicos.
Objetivo del estudio
- Aislar complejos proteicos de embriones vivos de Drosophila.
- Utilizar el entrecruzamiento in vivo para capturar interacciones transitorias.
- Analizar la estructura y función de estos complejos proteicos.
Métodos Utilizados
- Cargar moscas en una jaula de población para recolectar embriones tempranos.
- Reticular proteínas in vivo con formaldehído.
- Preparar extractos proteicos a partir de embriones reticulados.
- Inmunoprecipitar complejos proteicos para su análisis.
Resultados principales
- Identificación de complejos proteicos aislados mediante análisis por inmunotransferencia.
- Demostación de la eficacia del entrecruzamiento in vivo.
- Captura de interacciones transitorias entre proteínas.
- La comparación con métodos tradicionales in vitro resalta sus ventajas.
Conclusiones
- El enfoque in vivo es superior para estudiar interacciones dinámicas entre proteínas.
- Este método puede mejorar la comprensión de las funciones de los complejos proteicos.
- Estudios futuros podrían ampliar esta técnica para otros organismos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La captura de interacciones transitorias entre proteínas en entornos celulares nativos sigue siendo un desafío crítico en la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos. Este enfoque de reticulación in vivo permite la estabilización de complejos lábiles directamente dentro de embriones de Drosophila, preservando interacciones fisiológicamente relevantes que podrían perderse durante la lisis convencional. El método apoya los esfuerzos iniciales de descubrimiento al proporcionar una representación más precisa de la composición endógena de los complejos, mejorando así la confianza predictiva en la evaluación posterior de las dianas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la estabilización de complejos proteicos transitorios para su análisis funcional.
- Valor operativo: Reduce los falsos negativos en la validación de dianas al capturar interacciones que se pasan por alto in vitro.
- Valor científico: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la preservación de la arquitectura nativa de complejos en un sistema modelo relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados adecuados para la estandarización de ensayos y pruebas de reproducibilidad.
- Valor operativo: Genera resultados cuantitativos mediante inmunoprecipitación y espectrometría de masas para la evaluación confiable de compuestos.
- Valor científico: Mejora la preparación para cribado al proporcionar lecturas de interacción con el blanco similares a las condiciones nativas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Ofrece conocimientos relevantes para enfermedades mediante el aislamiento de complejos a partir de embriones en desarrollo, un modelo para procesos celulares conservados.
- Valor operativo: Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al mantener la integridad de los complejos.
- Valor científico: Facilita la reducción mecanicista de riesgos al vincular la interacción con el blanco con resultados funcionales en el desarrollo de la línea germinal.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos iniciales, especialmente en casos donde interacciones transitorias influyen en la idoneidad de la diana. Complementa la selección fenotípica al proporcionar un contexto mecanicista para los fenotipos observados.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el aislamiento de complejos nativos en condiciones cercanas a las fisiológicas.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante el aislamiento reproducible de complejos estabilizados por entrecruzamiento.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas mediante inmunotransferencia (Western blot) y espectrometría de masas para comparar la composición de complejos en distintas condiciones.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al revelar redes de interacción conservadas en un modelo genéticamente manejable.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para el aislamiento de complejos en diversos tejidos y organismos cuando se adapta.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en los estudios de interacción con el blanco.
- Valor operativo: Fomenta la estandarización y la reproducibilidad mediante pasos definidos de reticulación y detención de la reacción.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al revelar interacciones transitorias que podrían indicar relevancia funcional.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en la estabilidad del complejo nativo y la intensidad de las interacciones.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de embriones, química de reticulación y técnicas de inmunoprecipitación.
- Depende del acceso a equipos de homogenización, centrifugación y filtración para la preparación del lisado.
- Necesita la estandarización entre equipos en cuanto a la concentración de formaldehído, el momento del bloqueo de la reticulación y la rigurosidad de los lavados.
- Incluye consideraciones de adaptación al aplicar el método a tejidos no embrionarios o a sistemas modelo alternativos.
- Presenta limitaciones prácticas, como la posible sobrereticulación a altas concentraciones de formaldehído, lo que podría enmascarar epítopos o dificultar la elución.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Preparing Large Apple Juice Agar Plates
2:04
Collecting Embryos and Pre-crosslinking Treatment
4:35
In vivo Crosslinking
5:34
Preparing Proteins and Immunoprecipitation
7:10
Results: Crosslinked Tud Protein Complex Analysis
8:23
Conclusion
