Name: Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a preparar co-culturas neuronales interconectadas con precisión de célula única mediante microfluidos y patronado de plasma. Este método permite estudiar interacciones neuronales con mínimas entradas celulares.

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Los autores agradecen a Ulrich Marggraf (ISAS) para SU-8 de fabricación y Maria Becker (ISAS) para obtener imágenes de SEM. La investigación fue apoyada financieramente por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG WE3737/3-1), una Bundesministerium für Bildung und Forschung subvención (BMBF 0101-31P6541) y por el Ministerium für Innovation, Wissenschaft und Forschung des Landes Nordrhein-Westfalen. Heike Hardelauf agradece al Leibniz Escuela Internacional &quot;Systems Biology Lab-on-a-Chip&quot; para el apoyo financiero.

Los protocolos están destinados a los neurocientíficos, y se resumen en la Figura 2. Como tal, es recomendar que la microfabricación de los SU-8 maestros utilizados para la replicación de PDMS se externaliza a las instalaciones comerciales o institucionales. Los dos diseños de máscara de capa están disponibles gratuitamente como información complementaria (CP) en la Real Sociedad de Química página web 12. Es importante destacar que la primera capa de SU-8 debe ser fabricado a una profundidad de 2,5-3,0 micras, y la segunda a una profundidad de 25-30 micras. Estas son las principales dimensiones necesarias para arraying neurona eficaz. El límite de altura de 3 micras es también necesario para evitar que las neuronas que se transportan o la migración entre los dos compartimientos 12. 1. Replicación de dispositivo de microfluidos en PDMS <ol><li> Mezclar el prepolímero de PDMS a fondo con el agente de curado (184) en una proporción de 10:01 y desgasificar la mezcla en un desecador de vacío durante típicamente 20 min. También puede poner la mezclatura en un tubo Falcon de 50 ml y use bajo g centrifugación para la desgasificación. </li><li> Coloque el 2-capa microestructurada SU-8 oblea en una placa calefactora 80 ° C y alinear marcos de polímero a cada dispositivo en la oblea. Vierta PDMS en los marcos a una profundidad de ≥ 5 mm y permiten&gt; 1 h para asegurar un curado térmico completo. </li><li> Una vez curado, retirar la oblea de la placa calefactora y dejar enfriar sobre una superficie plana. </li><li> Use gafas de protección y el trabajo de una esquina (lejos de los SU-8 microestructuras) con un bisturí rígido para premio suavemente el marco y PDMS de la oblea. </li><li> Retire el molde de PDMS de la estructura y el uso de un par de tijeras para cortar el dispositivo de exceso de PDMS. Este llamado parpadeo se produce a menudo cuando una fina película de PDMS se extiende entre el marco de polímero y la superficie de la oblea. </li><li> PDMS restantes se pueden aplicar a toda la oblea y se curan para proteger la oblea durante el almacenamiento. Eliminar a esta antes del moldeo dispositivo posterior, y al hacerlo, eliminar cualquier particular contaminantes de la superficie. </li></ol> 2. Asamblea de dispositivos y de interconexión <ol><li> Preparar los puertos de interfaz 6 utilizando un punzón de biopsia de diámetro 3 mm. Trabaje sobre una superficie oscura, en buenas condiciones de luz y con las características microestructuradas hacia arriba para ayudar a la alineación de los puertos con los canales de microfluidos. </li><li> Inspeccione el dispositivo para las partículas. Remover estos con cinta adhesiva reversible. </li><li> El circuito de microfluidos se encapsula usando una capa delgada de PDMS montado en un cubreobjetos de vidrio: Estos se preparan mediante el vertido de un volumen pequeño (~ 0,5 ml) de la mezcla de agente de curado de PDMS-(10:01, 601) sobre la base de una solución flexible, grado bacteriológico placa de Petri. Presione suavemente un cubreobjetos sobre la capa de PDMS, colocar sobre la placa calefactora cura térmicamente durante unos minutos. Rápidamente después del enfriamiento, use un escalpelo para cortar y el premio de la bicapa cubreobjetos-PDMS de la placa de Petri. Recorte con tijeras si es necesario. </li><li> Bonos Plasma dispositivo PDMSy capa de soporte para producir un buen cierre: Las condiciones óptimas son el instrumento específico. Por ejemplo, un horno de plasma que funciona a 70 W y 40 kHz en una atmósfera de oxígeno 0,2 mbar durante 40 segundos produce una excelente unión de PDMS-PDMS. Una vez tratada plasma, presione ambas piezas conjuntamente y dejar actuar durante un minuto para completamente fianza. </li><li> Use un tubo de silicona (1,6 mm de diámetro interior, 3,2 mm OD) para interactuar con bombas y jeringuillas. </li></ol> 3. Biomaterial Patrones y Operaciones de microfluidos Los protocolos para los patrones en biomaterial in situ, la cultura neurona y tratamientos fluídicos se ilustran en la Figura 2. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Protocolos de microfluidos Illustrated. A) PL y PLL-g-PEG patrón; Además de la capa de adhesión celular (por ejemplo,PL, verde), con la producción de la máscara de agua alineados B) del tratamiento con plasma de aire atmosférica del PL expuesto evaporación.; se utilizan dos pasadores de antena, con la introducción de la antena de plasma ilustrado con una estrella de color rosa. C) PBS (azul) de lavado por aspiración se utiliza para evitar la contaminación de la región de plasma tratado con PL. D) de entrega de PLL-g-PEG (roja ) por aspiración para recubrir las regiones tratadas con plasma E) de carga de la célula.; arraying microfluidos simultánea de las neuronas para ambos compartimentos que flanquean por aspiración, F) medios de comunicación (rosa) de perfusión utilizando un flujo de accionamiento hidrostático G) tratamientos de fluidos aislados.; tratamiento periférico de un agente de prueba (negro) libró de la entrada inferior de flanqueo por aspiración y H) central de tratamiento librado de la entrada central inferior por aspiración. La figura y la leyenda reproducidas con permiso de la Sociedad Real de Química(RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> Inmediatamente después plasma la unión de las canales de microfluidos PDMS son muy hidrófilos (ángulo de contacto ≤ 5 °). Tales superficies son adecuados para la adhesión y la cultura de líneas celulares tales como células similares a neuronas SH-SY5Y diferenciadas humanos. Para el cultivo ex vivo de las neuronas primarias y la cultura de líneas de células precursoras neuronales, tales como la línea celular de Lund mesencefálico humana (LUHMES) un revestimiento de poliamina, ya sea polilisina (PL) o poliornitina (PO), se requiere como un ancla electrostática. Además proteínas de adhesión tales como la laminina o fibronectina se requieren a menudo como el recubrimiento de la integrina-interfaz. Sin embargo, los revestimientos de PL y PO se unen fácilmente las neuronas, lo que dificulta la entrega de microfluidos a los sitios de la matriz y también imponer tensiones de cizallamiento no deseadas. Para resolver este problema biomaterial en el chipSe requiere patrón para localizar materiales de adhesión en los sitios de trampa y los microcanales excrecencia. Esto también promueve el desarrollo de las conexiones entre compartimentos y reduce el enredo local. El protocolo también implica la adición de materiales de PEG a las áreas vecinas para asegurar las proteínas y las neuronas se limitan a las ubicaciones deseadas durante largo cultura. El siguiente protocolo se documenta en la Figura 3: <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Agua de enmascarar para modelar biomaterial por estarcir plasma. A) Ilustración del proceso de enmascaramiento de agua con las micropilares PDMS fijar el menisco de agua en el lugar de colocación de letreros de plasma. La curvatura del menisco en el plano vertical se ha descuidado. B) máscara de agua visualizado con un colorante rojo y se coloca por menisco pinning. C) El patrón de recubrimiento PL-FITC fotografiado después de estarcir plasma. D) La adición de proteína de rechazar y repelente celular PLL-g-PEG-TRITC a un recubrimiento PL-FITC plasma con dibujos. Esto se utilizó para el registro de células SH-SY5Y y también para modelar una capa de fibronectina adicional para las células LUHMES. La figura y la leyenda reproducido con permiso de la Sociedad Real de Química (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <ol><li> El enmascaramiento de agua para In situ biomaterial Patterning por Plasma Stenciling <ol><li> Poco después de la pipeta de unión de plasma un volumen de 0,5 l de PL o PO (100 g / ml en PBS 1X) en el puerto del centro de la parte inferior. En cuestión de segundos todo el circuito de microfluidos se llena por acción capilar. Dejar durante unos minutos para cubrir completamente las superficies de PDMS hidrófilos con el poliAminas. </li><li> Eliminar las moléculas de poliamina no unidos por lavado aspiración impulsada con 1x PBS (ver Figura 2C) durante 1 min. </li><li> Quite todo el PBS de los puertos y calentar el dispositivo mediante la iluminación con un microscopio. Esto aumenta la evaporación de los puertos para la formación de agua máscara rápida. La máscara de agua (se ilustra en la Figura 3A y documentado en la Figura 3B) se establece dentro de ~ 5 min. </li><li> Inspeccione el dispositivo mediante microscopía para asegurar el enmascaramiento del agua se ha completado. Tenga en cuenta las estructuras de depósito aguas arriba del sitio de matriz están incluidos en el diseño de la máscara para prolongar la estabilidad de la máscara de agua (~ 15 min). </li><li> Inserte los pasadores de acero inoxidable en los puertos (Figura 2B). Estos se utilizan para acoplar el plasma generado por una mano la presión de descarga en corona atmosférica o Tesla generador (por ejemplo, que funciona a 2 MHz, la señal de 30 kV) 19,20 en los canales de microfluidos vacantes. Coloque la punta de tse plasma fuente cercana a la punta de un alfiler y plasma a tratar la de microcanal para ≤ 1 seg. Utilice las condiciones de poca luz para observar el patrón de plasma. </li><li> Quite la máscara de agua con un paso de lavado. Utilice la aspiración paralelo desde los puertos superiores 3. Utilice 4 longitudes iguales de tubo de silicona unidos por un adaptador de 4 vías a una bomba de aspiración de lograr la aspiración paralelo. Inicie la aspiración y dispensación PBS en los 3 puertos inferiores para dibujar PBS a través del circuito de microfluidos. De esta manera un contraste material PDMS poliamina es producido (ver Figura 3 C). Evacuar PBS desde el circuito de microfluidos y se deja durante varias horas para restaurar el, estado hidrófobo nativa. Esto hace que el PDMS totalmente no permisiva para la adhesión celular. </li><li> En caso de que los materiales de adhesión adicionales, tales como la laminina o fibronectina, se necesitarán son necesarios los siguientes pasos y se debe hacer inmediatamente después de quitar la máscara de agua: pipeta un volumen de 10 l de injerto de copolímero de poli-L- Lisina-poli (etilenglicol) (PLL-g-PEG, 100 g / ml, en PBS) en ambos canales de fondo de acompañamiento, seguido por la aspiración de los canales que flanquean superiores para 2 min. </li><li> Sin interrumpir el flujo, eliminar el exceso de PLL-g-PEG por intercambio con un tampón PBS. Este selectivamente recubre las regiones no-poliamina-revestido con el resto de PEG que actúa para evitar la adsorción de proteínas y la adhesión celular 17,21. </li><li> Proteínas de adhesión tales como la laminina o fibronectina pueden ser co-localizada con el recubrimiento de poli-amina: Pipetear 10 volúmenes l de estas proteínas ECM (típicamente 10 mg / ml) en los tres puertos de fondo. Aspirar a partir de los tres principales puertos hasta que el dispositivo se llena con la solución de proteína y se incuba durante 1 hora para producir un revestimiento de buena calidad. </li><li> Retire el exceso de proteínas mediante la aspiración de PBS a partir de los 3 puertos inferiores. </li></ol></li><li> Microfluidic sola neurona Arraying <ol><li> Prime los dispositivos con aprocomió medios. Añadir 20 volúmenes mu l a los 3 puertos de fondo y por la aspiración paralelo de los tres puertos superiores llenar rápidamente el circuito de microfluidos con los medios de comunicación. Utilice un conector de tubo de 4 vías para acoplar los 3 puertos superiores a través de un tubo de silicona de longitud igual a una bomba de aspiración. </li><li> Añadir 20 l de una suspensión de células desglosados ​​(1 x 10 6 células / ml) a cada uno de los puertos de entrada de acompañamiento (0, en la Figura 1). </li><li> Equipar una bomba de aspiración con un regulador de flujo o utilizar una jeringa para aspiración suave de los puertos superiores 3. De agrupación completa neurona requiere típicamente 1 min. </li><li> Coseche exceso neuronas que quedan en los 4 puertos de flanqueo con una pipeta para poner en orden en dispositivos de microfluidos posteriores. </li><li> Retire el tubo. Rellene todos los puertos con los medios y coloque el dispositivo en la incubadora. En pocas horas las células se vuelven totalmente adherente sobre el patrón de biomaterial. </li></ol></li><li> Neurona Cultura, Selectiva Tratamiento neumático y Immunostaining <ol><li> Cambie los medios de comunicación por perfusión periódica utilizando alimentación hidrostática (una diferencia de altura de columna de 2 mm es adecuada lento). </li><li> Alternativamente, sumerja el dispositivo de microfluidos en medios de comunicación, el intercambio de los medios de comunicación periódicamente (2-3 días), como con los cultivos celulares convencionales. </li><li> Tratamientos de fluidos selectivos a cualquiera de neurona compartimiento de cultivo o el compartimento central de la excrecencia de neuritas se consiguen de la siguiente manera: Dispensar 20 l de la sustancia de ensayo en el puerto inferior del canal de interés, y aspirado desde el puerto directamente encima. Para los tratamientos largos reducen la velocidad de flujo utilizando un regulador de flujo y reponer la sustancia de ensayo como se requiere. </li><li> Protocolos Inmunomarcación varían para cada diana molecular y reactivos asociados. Con el fin de contrarrestar el riesgo potencial de daño inducido por cizalla a las neuronas se utilizó una tasa de flujo lento. Esto se traduce en un aumento de los tiempos de aplicación para perfundir plenamente el sistema, extendiendo los tiempos normales de protocolo. Hyperfusión hidrostática utilizando puertos con diferentes alturas de columna (por ejemplo, de 2 mm) se utiliza para entregar los reactivos. Más rápida adición de reactivos y eliminación de material mediante una bomba se pueden utilizar para reducir los tiempos experimentales. Conecte una bomba de aspiración de los puertos superiores 3 para dibujar los reactivos de los 3 puertos inferiores. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+control+of+neurite+development+by+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Local control of neurite development by nerve growth factor.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 74 (10), 4516-4519 (1997).</li>
<li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+sympathetic+neurons+in+compartmentalized+cultures.+I.+Local+control+of+neurite+growth+by+nerve+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of sympathetic neurons in compartmentalized cultures. I. Local control of neurite growth by nerve growth factor.</a> Dev Biol. 93 (1), 1-12 (1982).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+multicompartment+device+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Microfluidic multicompartment device for neuroscience research.</a> Langmuir. 19, 1551-1556 (2003).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2 (8), 559-565 (2005).</li>
<li>Kilinc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian-like+degeneration+of+central+neurons+after+synchronized+and+geometrically+registered+mass+axotomy+in+a+three-compartmental+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotox.+Res%22%5BJournal%5D)">Wallerian-like degeneration of central neurons after synchronized and geometrically registered mass axotomy in a three-compartmental microfluidic chip.</a> Neurotox. Res. 19, 149-161 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+and+multifactor+involved+assay+of+neuronal+regeneration+after+chemical+injury+in+an+integrated+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled and multifactor involved assay of neuronal regeneration after chemical injury in an integrated microfluidics.</a> Anal. Chem. 84 (15), 6444-6453 (2012).</li>
<li>Kim, Y. T., Karthikeyan, K., Chirvi, S., Dave, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-optical+microfluidic+platform+to+study+injury+and+regeneration+of+single+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Neuro-optical microfluidic platform to study injury and regeneration of single axons.</a> Lab Chip. 9, 2576-2581 (2009).</li>
<li>Hellman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+axonal+injury+and+regeneration+in+micropatterned+neuronal+culture+using+pulsed+laser+microbeam+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Examination of axonal injury and regeneration in micropatterned neuronal culture using pulsed laser microbeam dissection.</a> Lab Chip. 10 (16), 2083-2092 (2010).</li>
<li>Kunze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-pathological+connected+primary+neurons+in+a+microfluidic+device+for+Alzheimer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Co-pathological connected primary neurons in a microfluidic device for Alzheimer studies.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (9), 2241-2245 (2011).</li>
<li>Liu, W. W., Goodhouse, J., Jeon, N. L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+chamber+for+analysis+of+neuron-to-cell+spread+and+axonal+transport+of+an+alpha-herpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic chamber for analysis of neuron-to-cell spread and axonal transport of an alpha-herpesvirus.</a> PLoS One. 3 (6), (2008).</li>
<li>Markus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Varicella-Zoster+virus+%28VZV%29+infection+of+neurons+derived+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Direct+demonstration+of+axonal+infection%2C+transport+of+VZV%2C+and+productive+neuronal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Varicella-Zoster virus (VZV) infection of neurons derived from human embryonic stem cells: Direct demonstration of axonal infection, transport of VZV, and productive neuronal infection.</a> J. Virol. 85 (13), 6220-6233 (2011).</li>
<li>Dinh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+construction+of+minimalistic+neuronal+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic construction of minimalistic neuronal co-cultures.</a> Lab Chip. 13 (7), 1402-1412 (2013).</li>
<li>Tan, W. H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trap-and-release+integrated+microfluidic+system+for+dynamic+microarray+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A trap-and-release integrated microfluidic system for dynamic microarray applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (4), 1146-1151 (2007).</li>
<li>Frimat, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+array+with+cellular+valving+for+single+cell+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture.</a> Lab Chip. 11 (2), 231-237 (2011).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (14), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+network+formation+assay%3A+A+spatially+standardized+neurite+outgrowth+analytical+display+for+neurotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The network formation assay: A spatially standardized neurite outgrowth analytical display for neurotoxicity screening.</a> Lab Chip. 10, 701-709 (2010).</li>
<li>Hardelauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fidelity+neuronal+networks+formed+by+plasma+masking+with+a+bilayer+membrane%3A+analysis+of+neurodegenerative+and+neuroprotective+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High fidelity neuronal networks formed by plasma masking with a bilayer membrane: analysis of neurodegenerative and neuroprotective processes.</a> Lab Chip. 11 (16), 2763-2771 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Frimat, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+stencilling+methods+for+cell+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Plasma stencilling methods for cell patterning.</a> Anal. Bioanal. Chem. 395 (3), 601-609 (2009).</li>
<li>Huang, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28L-lysine%29-g-poly%28ethylene+glycol%29+layers+on+metal+oxide+surfaces%3A+surface-analytical+characterization+and+resistance+to+serum+and+fibrinogen+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Poly(L-lysine)-g-poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: surface-analytical characterization and resistance to serum and fibrinogen adsorption.</a> Langmuir. 17, 489-498 (2001).</li>
<li>Li, N., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+topographical+and+biochemical+cues+by+axons+during+growth+on+microfabricated+3-D+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Integration of topographical and biochemical cues by axons during growth on microfabricated 3-D substrates.</a> Exp. Cell Res. 311 (2), 307-316 (2005).</li>
<li>Huang, L. R., Cox, E. C., Austin, R. H., Sturm, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+particle+separation+through+deterministic+lateral+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Continuous particle separation through deterministic lateral displacement.</a> Science. 304 (5673), 987-990 (2004).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+nanoparticle+functionality+and+toxicity+on+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">A review of nanoparticle functionality and toxicity on the central nervous system.</a> J. R. Soc. Interface. 7, (2010).</li>
<li>Brenneman, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+olfactory+transport+of+inhaled+manganese+%28%28MnCl2%29-Mn-54%29+to+the+rat+brain%3A+Toxicokinetic+investigations+in+a+unilateral+nasal+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Direct olfactory transport of inhaled manganese ((MnCl2)-Mn-54) to the rat brain: Toxicokinetic investigations in a unilateral nasal occlusion model.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 169 (3), 238-248 (2000).</li>
<li>Magalães, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+neuritic+transport+of+scrapie+prion+protein+coincident+with+infection+of+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Uptake and neuritic transport of scrapie prion protein coincident with infection of neuronal cells.</a> J. Neurosci. 25 (21), 5207-5216 (2005).</li>
<li>Diogenes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+alpha-synuclein+oligomers+modulate+synaptic+transmission+and+impair+LTP+via+NMDA-receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular alpha-synuclein oligomers modulate synaptic transmission and impair LTP via NMDA-receptor activation.</a> J Neurosci. 32 (34), 11750-11762 (2012).</li>
<li>Egger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nat. Protoc. 8 (5), 958-965 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

La técnica de agrupación de microfluidos es el primero de su tipo que permite precisión simple manejo de las neuronas para establecer culturas minimalistas. Junto con el método in situ patrón biomaterial, un enfoque poderoso para alinear patrones celulares con estructuras de microfluidos, estas culturas minimalistas tienen niveles de conectividad de alta intercompartimiento con reducida entrelazamiento local. Estas características se pueden utilizar para el estudio eficiente de transmisión inter-compartimiento,...

<html> Tejido neuronal es muy complejo; una mezcla celular heterogénea que se ordena espacialmente dentro de las capas y los compartimentos definidos y con conectividad de plástico a través de contactos celulares y en especial a través de los axones y dendritas excrecencias. Se requieren nuevas técnicas para conferir una mayor libertad experimental para obtener una visión más profunda y los mecanismos centrales para desentrañar la enfermedad, el desarrollo y la función saludable. La cámara de Campenot 1,2 y, más recientemente microfabricado realizaciones 3,4 se pueden utilizar para la preparación ex vivo de co-cultivos neuronales conectados en red con la capacidad para perturbar de forma selectiva las diferentes poblaciones somáticas y también sus excrecencias de neuritas. Estos dispositivos de microfluidos han, por ejemplo, han utilizado para estudiar la degeneración axonal y la regeneración siguiente químico 5,6 o láser axotomía 6-8, tauopatía 9, difusión viral 10,11, y la localización del mRNA en los axones 4. ent &quot;&gt; Para ampliar el alcance de los neurobiólogos, se requieren desarrollos tecnológicos para preparar co-cultivos neuronales minimalistas. Esto permite que el desenmarañado de la red neuronal para la investigación del sistema con una sola célula y la precisión de sub-celular. El requisito para el número de células mínimas abre la posibilidad de analizar los tipos de células raras, incluyendo células dopaminérgicas de la sustancia negra pertinentes a la enfermedad de Parkinson, los ganglios de espiral desde el oído, las neuronas periféricas, y las células madre. Más allá de esto, la economía celular es relevante a la iniciativa de las 3R. El uso de estas plataformas de microfluidos, pantallas de toxicidad a gran escala u otras de alto rendimiento, rica serie experimental de datos que requieren las neuronas de los animales puede considerarse ahora. En este trabajo se describen los protocolos para la fabricación y el uso de un dispositivo de microfluidos. De agrupación de microfluidos en combinación con un en biomateri situmétodo de modelado al se puede utilizar para el registro de los co-cultivos neuronales altamente interconectadas que utilizan el número de células mínimas. De agrupación de microfluidos se basa en un enfoque de flujo diferencial 12-15, en el que las trampas microestructurados se colocan dentro de un circuito de fluido (ilustrada junto con imágenes de SEM en la Figura 1). La ruta de 0 → 1 tiene la resistencia fluídica inferior (R2&gt; R1) para el transporte de las neuronas a una serie lineal de aberturas microestructurados - las entradas a los canales de desarrollo de neuritas. Ocupación de la trampa por una sola célula impide localmente el flujo de desviar las líneas de corriente para atrapar las células posteriores en trampas vecinos. Ocupación completa de las trampas de la matriz cambia la relación de fluidos (R1&gt; R2) para desviar las líneas de corriente en la trayectoria de serpentina (0 → 2) para producir un modo de derivación de operación para la eliminación del exceso de neuronas. Figura 1. Microfluidic Circuito. A) El circuito de resistencia diferencial de fluido para el solo arraying neurona, con flanqueando cámaras de cultivo interconectados por canales de desarrollo de neuritas. B, las imágenes C) de SEM de la bicapa neurona compartimentada gama co-cultivo con menisco fijando micropilares. Con este diseño, se utilizaron estructuras de captura de neuronas en forma de tridente-para promover fasciculación de las excrecencias de neuritas. La figura y la leyenda reproducido con permiso de la Sociedad Real de Química (RSC) 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51389/51389fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> La preparación de las redes neuronales micropatterned en sustratos planos se puede conseguir fácilmente (por EJEMPLOS<html> es de nuestro grupo, ver Frimat et al. 16 y Heike et al. 17). Sin embargo, la encapsulación de patrones materiales bioactivos dentro de los dispositivos de PDMS y con el requisito de alineación micrómetro escala de estos a los canales de microfluidos plantea un gran desafío técnico. En la sección 3.1 de un protocolo para la en-chip, o in situ, se presenta la preparación de los patrones de biomateriales. Estos patrones permiten la inscripción de las neuronas durante las largas escalas de tiempo de cultivo y promover crecimientos entre los compartimentos. Microestructuras de menisco-colocación de clavos se utilizan para alinear una llamada máscara de agua con la neurona sitios y canales de desarrollo de neuritas arraying. El agua máscara protege los recubrimientos de moléculas de adhesión durante el tratamiento de plasma, mientras que las superficies expuestas se desintegran para definir el patrón de biomaterial. Además, se proporcionan protocolos para el cultivo celular y para el aislamiento de fluido necesario para el tratamiento selectivo de los diferentes compartimentos de co-cultivo. ve_content &quot;&gt; Los protocolos están diseñados para aprovechar los principios de uso fácil de la litografía suave para la replicación de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) dispositivos de microfluidos 18. Del mismo modo, en el patrón de biomaterial in situ es sencillo, la explotación de la superficie de evaporación y fenómenos de tensión, y sólo que requiere una fuente de plasma de mano barata. El circuito de microfluidos con eficacia los programas de carga celular y compartimiento tratamientos específicos que hacen estas operaciones De esta manera, se pretende dar a los neurobiólogos simplemente una cuestión de distribución de materiales en el puerto inferior correcto y aspirando desde arriba. la libertad de preparar y usar los dispositivos de microfluidos en sus propios laboratorios.

<table><tbody><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS Elastosil RT 601</td><td>Wacker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>630-1590</td><td>130-160 mm de espesor</td></tr><tr><td>3 mm punzones de biopsia Kai</td><td>Medical</td><td></td><td>Maneje con cuidado - extremadamente afilado</td></tr><tr><td>Tubo Tygon</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-50-HL</td><td>1,65 mm de diámetro interior; Jeringa de 3,35 mm de diámetro exterior</td></tr><tr><td>de 1 ml ( Inkjekt y Omnifix)</td><td>Braun</td><td>6064204</td><td></td></tr><tr><td>Conector de tubo de 4 vías</td><td>VWR o Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regulador de caudal</td><td>Harvard Apparatus</td><td>722645</td><td></td></tr><tr><td>clavijas de 0,5 mm</td> Departamentos <td></td><td></td>de <td>confección</td></tr><tr><td>PLL-g-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>La estabilidad en el almacenamiento puede ser un problema</td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Polilisina-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3069</td><td></td></tr><tr><td>Poliornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente invertido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ejemplo de bomba de aspiración</td><td>KNF Neuberger, Laboport</td><td>N811KVP</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de descarga de corona portátil</td><td>Leybold-Heraeus, EE. UU</td>. Es posible que <td>VP23</td><td>no cumpla con los estándares de seguridad de su país</td></tr><tr><td>Horno de plasma Femto</td><td>Diener Electrónico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desecador o centrífuga</td><td></td><td></td><td></td> de vacío</tr></tbody></table>

preparación de neuronales co-culturas con precisión single cell

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Realizaciones de microfluidos de la cámara Campenot han despertado gran interés por parte de la comunidad de las neurociencias. Estas plataformas de co-cultivo interconectadas se pueden utilizar para investigar una variedad de preguntas, que abarca la neurobiología del desarrollo y funcional a la infección y la propagación de la enfermedad. Sin embargo, los sistemas convencionales requieren insumos significativos celulares (muchos miles por compartimiento), inadecuados para el estudio de las células de baja abundancia, como el nigra del substantia primaria dopaminérgico, ganglios espiral, y las neuronas melanogaster Drosophila y poco práctico para la experimentación de alto rendimiento. Los cultivos densos también se enredan muy localmente, con unos crecimientos (&lt;10%) que interconectan las dos culturas. En este trabajo se describen los protocolos de microfluidos y de modelado sencillas que frente a estos desafíos: (i) una neurona única de microfluidos método arraying, y (ii) un método de enmascaramiento de agua para recubrimientos de biomateriales de modelado de plasma para Register neuronas y promover la excrecencia de entre los compartimentos. Co-cultivos neuronales Minimalistic se prepararon con alto nivel (&gt; 85%) la conectividad intercompartimiento y se pueden utilizar para los de alto rendimiento experimentos neurobiología con precisión simple célula.

Hazañas de enmascaramiento Agua tensión superficial. La tolerancia a la presión en la interfase aire-líquido escalas inversamente con el radio de curvatura [ <img fo:content-width="1in" src="files/ftp_upload/51389/51389eq1.jpg" width="113" /> , La producción de las interfaces altamente estables en las dimensiones de microfluidos. Los micropilares anclar eficazmente el agua máscara en su lugar. Formación de máscara de agua es impulsado por la evaporación de los puertos microfluídicos, con la tasa de aumento de por calent...

Se describen protocolos para sola neurona arraying microfluidos y el enmascaramiento de agua para el patrón de plasma en el chip de recubrimientos de biomateriales. Co-cultivos altamente interconectadas se pueden preparar usando entradas de celda mínimos.

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

El objetivo general de este procedimiento es distribuir neuronas individuales en dos compartimentos microfluídicos para la preparación de un cultivo celular neuronal conectado. Esto se logra primero mediante la moldeación por réplica del dispositivo microfluídico en PDMS y la encapsulación del dispositivo mediante unión por plasma. El segundo paso consiste en definir el patrón de polilisina dentro del dispositivo microfluídico.Esto se logra llenando el dispositivo con polilisina, permitiendo la formación de una masa de agua por evaporación y luego utilizando un tratamiento con plasma para eliminar la polilisina expuesta y crear el patrón del biomaterial. A continuación, use una jeringa para aspirar las neuronas a través del circuito microfluídico para la disposición de neuronas individuales. El dispositivo se coloca en el incubador de cultivo de tejidos para que los neuritos crezcan y conecten las dos poblaciones de neuronas.El paso final consiste en utilizar una bomba de aspiración para tratar selectivamente un compartimento y monitorear la propagación de materiales y patología dentro del circuito neuronal. La demostración del procedimiento estará a cargo de Yayu Chang y Sarada de

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un procedimiento para la generación de cultivos neuronales a partir de finales de embriones y la corteza temprana de ratón postnatal. Estos cultivos pueden ser utilizados para inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, calcio y sodio de imagen y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación del gen letal después del parto.

Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

Aquí les ofrecemos un protocolo para el cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial. Los cultivos de neuronas de establecer la polaridad y la creación de sinapsis, y se puede separar de la glía para su uso en diversas aplicaciones, tales como la electrofisiología, imágenes de calcio, los ensayos de supervivencia de las células, inmunocitoquímica, y ADN / ARN / aislamiento de las proteínas.

Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

Este video muestra un método para diferenciar células progenitoras neuronales humanas (NPCs) en neuronas. Las NPC se introducen en un cocultivo establecido de neuronas corticales de astrocitos de ratón y rata, lo que promueve la diferenciación de las NPC en neuronas. La diferenciación se confirma mediante la visualización de las células bajo un microscopio confocal.

Una técnica de cocultivo para diferenciar células progenitoras neurales humanas en neuronas

Este video ilustra un método para establecer un cocultivo indirecto neurona-astrocito utilizando un enfoque compartimentado. En esta configuración, las neuronas y los astrocitos están separados espacialmente, pero comparten un medio condicionado. Los factores neurotróficos liberados por los astrocitos promueven la diferenciación neuronal y la formación de conexiones sinápticas, lo que sugiere interacciones neurona-glía.

Una técnica de cocultivo indirecto neurona-astrocito para estudiar las interacciones neurona-glía

Células neuroprogenitoras Humanos (CPN) se ampliaron en condiciones proliferantes. NPC se diferenciaron en cultivos de neuronas-rica en la presencia de una combinación de neurotrofinas. Marcadores neuronales se detectaron por tinción de inmunofluorescencia. Para aislar una población pura de las neuronas, NPCs se diferenciaron en láminas de membrana PEN y se realizó con láser captura microdissection.

Microdisección de captura por láser de neuronas a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas en cultivo

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Este estudio presenta una técnica para el aislamiento de neuronas de ratones neonatales WT. Requiere la cuidadosa disección de la médula espinal del ratón neonatal, seguida de la separación de las neuronas del tejido de la médula espinal mediante escisión mecánica y enzimática.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

Este protocolo describe un cocultivo microglía-neuronal establecido a partir de células neuronales primarias aisladas de embriones de ratón en los días embrionarios 15-16 y microglía primaria generada a partir de los cerebros de ratones neonatos en los días postnatales 1-2.

Generación y cocultivo de microglía primaria murina y neuronas corticales

La técnica amperométrica mide la liberación de dopamina a partir de una única célula mediante la detección de la corriente oxidativo producido por la oxidación espontánea dopamina. Fijación de tensión simultánea y metodología amperometría revelar la relación mecanicista entre el general "actividad" del transportador de dopamina y el papel regulador de esta actividad en el transporte inverso de la dopamina.

Medición única célula de la liberación de dopamina simultánea con fijación de voltaje y Amperometría

Aprende a preparar co-culturas neuronales interconectadas con precisión de célula única mediante microfluidos y patronado de plasma. Este método permite estudiar interacciones neuronales con mínimas entradas celulares.

Preparación de Neuronales Co-culturas con precisión Single Cell

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