Transcripción y metabolito de perfiles para la Evaluación de árbol Tabaco y Poplar como materia prima para la industria basada en Bio

El objetivo general de este procedimiento es establecer y optimizar los datos de secuenciación de metabolitos y ARN del material de hojas de árboles de tabaco para estimaciones orientadas a la biología de sistemas. Esto se logra recolectando primero el material biológico de una serie de hojas en desarrollo. El segundo paso consiste en realizar la extracción del material utilizando los disolventes adecuados en función del análisis posterior.

A continuación, los metabolitos e hidrocarburos se miden mediante cromatografía de gases, espectrometría de masas o GCMS y las transcripciones se analizan mediante la adquisición de datos de secuenciación de ARN. En última instancia, la combinación de perfiles de metabolitos y perfiles transcripcionales a través de la secuenciación de ARN se utiliza para mostrar cómo las hojas de los árboles de tabaco desarrollan hidrocarburos de cadena larga y otros compuestos importantes. Este método se puede utilizar para identificar y cuantificar metabolitos útiles importantes producidos en las hojas del árbol de tabaco.

Sin embargo, este método puede proporcionar información sobre el metaboloma del árbol del tabaco. También se puede utilizar para otros sistemas como el tabaco o especies relacionadas. Por lo general, las personas nuevas en ese método tendrán dificultades porque las hojas de los árboles de tabaco son difíciles de extraer buen ARN.

En este video multi Bioo PRO, verá a los miembros del grupo FERNA extraer y metabolizar el perfil. Usando GCMS, también verá a un miembro del Grupo Fraser extraer hidrocarburos y también a un miembro de mi propio grupo que extraerá ARN para la secuenciación de ARN. Comience cultivando plantas de neko Oceana Glauca en macetas de 30 centímetros de diámetro que contengan M dos medios de cultivo profesionales como se detalla en el protocolo de texto para preparar los metabolitos primarios, Coseche las hojas y los tallos de la planta y congele el material Liofilice inmediatamente los materiales vegetales congelados mediante liofilización durante tres días, luego muela las muestras liofilizadas con un molino mezclador con bolas de metal, alícuota los materiales secos molidos finos resultantes en un tubo de centrífuga de dos mililitros o un vial de vidrio. A continuación, alícuota 10 miligramos de hoja o 20 miligramos de tallo molido material vegetal seco en tubos de fondo redondo con tapón de rosca de dos mililitros.

Agregue 1,4 mililitros de metanol 100% y vórtice durante 10 segundos. A continuación, añada 60 microlitros de costilla atol como patrón cuantitativo interno antes de la formación en vórtice. Durante 10 segundos adicionales, agregue una bola de acero inoxidable y homogeneice el material con un molino mezclador durante dos minutos a 25 hercios después de la centrifugación durante 10 minutos.

A 11.000 veces la gravedad, transfiera el sobrenadante a un vial de vidrio. Añade 750 microlitros de cloroformo y 1,5 mililitros de agua antes de vorticinar la mezcla durante 10 segundos. A continuación, transfiera 150 microlitros de la fase superior a un tubo de centrífuga nuevo de 1,5 mililitros.

A continuación, seque las muestras con una aspiradora rápida. Es imperativo que las muestras se reduzcan a la sequedad entre tres y 24 horas hasta que no haya líquido residual. Una vez seco, añadir 40 microlitros de clorhidrato de metín.

A continuación, agite la mezcla en una coctelera horizontal de bloques de calor durante dos horas a 37 grados centígrados. Agregue 70 microlitros de la mezcla M-S-T-F-A antes de volver a agitar durante dos horas a 37 grados centígrados. Antes de transferir el líquido a viales de vidrio adecuados para el análisis de GC MS, gire las gotas de la tapa antes de transferir el líquido a los viales de vidrio adecuados para el análisis de GC MS.

A continuación, GCMS, analice los datos configurando el software para el análisis de datos de espectrometría de masas y seleccionando el análisis de datos que se va a procesar. Prepare una tabla de picos de interés detectados de acuerdo con la clase compuesta. Identifique los picos por coalición de compuestos estándar, posteriormente anote los picos detectados utilizando análisis de espectrometría de masas, algoritmos de caracterización estructural, estudio de la literatura y búsqueda en bases de datos de metabolitos para la extracción de hidrocarburos.

Sumerja aproximadamente 200 miligramos de hojas de ncoa glauco recién cosechadas insolventes durante dos a 20 minutos, retire las hojas y seque completamente los solventes por evaporación rotativa. A continuación, vuelva a suspender las muestras en un mililitro de hexano de grado HPLC. Proceda a realizar el análisis GCM de las muestras utilizando los parámetros que se detallan en el protocolo de texto.

Inicialmente, procese los componentes del cromatograma utilizando un MS automatizado. Sistema de deconvolución e identificación y el NIST 98 MS. Biblioteca. Confirmar la identificación de hidrocarburos saturados de acan de cadena larga comparando los tiempos de retención y los patrones clásicos de fragmentación con los estándares auténticos conocidos. A continuación, determine los hidrocarburos cuantitativamente comparando las áreas de picos integradas con las curvas de dosis-respuesta.

Construido a partir de estándares auténticos, calcule las medias y el error estándar de las medias utilizando el software Excel. Este protocolo combina la extracción de ARN TRIOL con un kit fácil de RN para obtener una molienda de ARN de alta calidad de 100 miligramos de material vegetal congelado en tubos de centrífuga de dos mililitros con una bola de metal mediante un molino mezclador. Después de la homogeneización de la muestra, agregue un mililitro de triol después de centrifugar el material durante 10 minutos a 12.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción. Añadir 200 microlitros de cloroformo e invertir el tubo varias veces antes de incubar durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de centrifugar la mezcla durante 15 minutos.

Al igual que antes, transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo de reacción. Agregue aproximadamente 2,5 volúmenes de etanol. Invierta el tubo varias veces e incube durante 30 minutos a menos 80 grados centígrados.

A continuación, mueva la muestra, incluido cualquier precipitado, a una columna de centrifugación. Centrifugar la columna durante 15 segundos a 8.000 veces la gravedad y desechar el flujo a través de ella. Agregue 700 microlitros de tampón de lavado RW one, que se proporciona en el kit de extracción a la columna de centrifugación y la centrífuga.

Nuevamente, después de descartar el flujo, agregue 500 microlitros del segundo tampón de lavado, RPE también proporcionado por el kit a la columna de centrifugado. Centrifugar la columna nuevamente y desechar el flujo antes de agregar más tampón RPE y centrifugar. Como antes, coloque la columna de centrifugación en un nuevo tubo de reacción de 1,5 mililitros y agregue 50 microlitros de centrífuga de agua libre de ARN, la columna durante un minuto a 8.000 veces la gravedad para eluir el ARN.

Elimine el ADN residual utilizando un kit libre de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como paso final, determine la calidad del ARN. El ARN debe tener números de integridad de ARN superiores a ocho antes de enviar el ARN para la secuenciación de próxima generación.

El perfil de HPLC muestra un resultado representativo del análisis isoprenoides de los extractos de hojas de ncoa glauca. Los diferentes ISOPRENOIDES de C 40 y superiores se detectaron utilizando un detector de matriz de fotodiodos. Los picos se anotaron en base a cromatografía de código y comparación espectral entre patrones auténticos.

Los dos cromatogramas MS son el resultado del análisis de metabolitos primarios de ncoa, hojas de glauco y material de tallo. También se da el espectro MS de un pico correspondiente a la serina, como ejemplo, se muestra la salida representativa del bioanalizador utilizado para determinar la calidad del ARN. Los dos picos principales en el cromatograma corresponden a 18 s y 25 s de ARN ribosómico, lo que indica ARN intacto en esta muestra.

Aparecerían picos adicionales de ARN ribosómico fragmentado en caso de ARN parcial o muy degradado una vez dominado. Esta técnica se puede realizar rápidamente y es compatible con el análisis de otros metabolitos siguiendo este procedimiento. Se pueden utilizar otros métodos, como la PCR en tiempo real u otras formas de analizar el ARN, para responder a preguntas adicionales, como la producción de ARN pequeños o la expresión de genes específicos.

Después de ver este video, debería tener muy buena comprensión sobre cómo extraer y evaluar los datos de metabolitos del árbol de tabaco.