Inmunohistoquímicos y métodos de imagen de calcio en Wholemount Rata Retina

El objetivo general de este procedimiento es marcar selectivamente las células ganglionares de la retina en toda la preparación de la montura mediante una inyección de un tinte indicador de calcio en el muñón del nervio óptico. Esto se logra inyectando primero un tinte indicador de calcio de muy alta afinidad, como el flujo cuatro en el muñón del nervio óptico. A continuación, la retina se aísla de la copa ocular y se divide en cuadrantes para montarla en un portaobjetos de vidrio en una cámara de registro configurada para imitar las condiciones fisiológicas, las contribuciones de los canales de calcio dependientes de voltaje a la señal de calcio.

En la retina, las células ganglionares se pueden medir en células despolarizadas utilizando bloqueadores de canales. En última instancia, los resultados pueden proporcionar mediciones semicuantitativas de la contribución de los canales de calcio educados en voltaje a una señal como una señal de calcio evocada con alto contenido de potasio. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la electroporación y la carga a granel, es la capacidad de etiquetar selectivamente las células ganglionares de la retina y sus axones en un almacén de preparación de montaje completo, diseccionar ojos radiales e hibernar un medio objetivo o una solución similar.

Ahora, si tiene la intención de realizar experimentos de imágenes de calcio, rellene las células ganglionares de la retina con flujo cuatro. Inyectar 0,5 microlitros de 40 milimolares de sal penta potásica, reconstituida en agua en el nervio óptico, muñón aproximadamente un milímetro posterior al globo ocular. Transfiere el globo ocular a los campaneros de mamíferos.

Burbujeado con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono o una hora a temperatura ambiente. Mantenga la preparación en la oscuridad. Diseccionar los ojos bajo un microscopio con intensidad de luz controlada.

Con una cuchilla de afeitar, haga suavemente una pequeña incisión en la parte delantera del globo ocular y extraiga la córnea. A continuación, retire el cristalino de la superficie interna de la retina con unas pinzas. Sostenga la esclerótica firmemente.

Al retirar el vítreo con las otras pinzas, pegue suavemente la base vítrea hacia el centro de la retina. La preparación resultante, llamada copa I, se puede procesar para la preparación inmunohistoquímica de montaje completo, preparación de imágenes de calcio o se puede preparar para secciones transversales de retina para hacer una preparación inmunohistoquímica de montaje completo. Primero, haz cuatro cortes en la retina para que quede plana.

Coloque la retina en el portaobjetos de la cubierta de vidrio con la capa de células ganglionares hacia abajo. En segundo lugar, agregue una gota de solución a la retina y cúbrala con papel de filtro de celulosa si es necesario, aplane la retina con un cepillo o pinzas. En tercer lugar, cuando la retina esté completamente plana y se desprenda del papel de filtro, colóquela de nuevo en la solución.

Para procesar la preparación primero, transfiéralo a 4% de aldehído paraformado durante 10 a 15 minutos. A continuación, lavar las retinas tres veces con tampón de fosfato 0,1 molar a pH 7,4 durante 30 minutos por lavado durante un total de 90 minutos. A continuación, incuba las retinas en 500 microlitros de solución bloqueante durante la noche a cuatro grados centígrados.

Esta solución es un 5% de suero normal de cabra o suero de burro en tampón de fosfato con 0,3% de tritton y 0,1% de azida de sodio durante los próximos cinco a siete días, incubar las retinas en la solución primaria de anticuerpos a cuatro grados centígrados. La composición de esta solución debe ser alcanzada empíricamente. Lave la solución de anticuerpos primarios tal como se lavó el fijador.

A continuación, incubar las retinas en anticuerpo secundario a una concentración de uno a 1000 durante la noche a cuatro grados centígrados. Retire el anticuerpo secundario con tres lavados más y tampón de fosfato. A continuación, monta las retinas para su visualización y séllalas con esmalte de uñas.

Estas diapositivas deben almacenarse en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Comience con la preparación de la montura completa de imágenes de calcio desde la copa I en timbres. Primero, corta el tejido de la retina en cuadrantes.

Coloque un cuadrante plano en la cámara de grabación con la capa ganglionar hacia arriba y, por lo tanto, la capa del fotorreceptor hacia abajo. Seque cuidadosamente el área circundante con una toallita Kim y coloque suavemente el arpa engrasada sobre el pañuelo. Ahora cargue la preparación de retina en el equipo y termine de configurar el sistema de superfusión impulsado por gravedad de ocho canales.

Si la retina montada se mueve después de colocar el arpa, retírela y límpiela con cuidado. Seque el área que rodea la retina y vuelva a montar el arpa super. Fusione la cámara de registro con una solución de timbre de mamíferos y mantenga la solución burbujeando continuamente con un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono.

En primer lugar, como control sin fármacos, se realizan dos pulsos emparejados de potasio alto de tres milimolares a 60 milimolares durante 33 segundos. Al despolarizar, el RGC debe activar los canales de calcio dependientes de voltaje si la preparación está funcionando. Ahora proceda con los experimentos.

El nifedipino y el bloqueador de canales de calcio dependientes de voltaje de tipo L se usan comúnmente para evaluar la contribución de los canales de calcio dependientes de voltaje de tipo L a la señal de calcio de cobalto evocada por despolarización. Un bloqueador de canales de calcio no específico se puede utilizar para bloquear de forma no selectiva los canales de calcio dependientes de voltaje. Escanee la preparación cada cinco segundos para visualizar y adquirir imágenes del rgc fluorescente.

Utilice la potencia del láser más baja posible. La excitación debe establecerse en 488 nanómetros y la emisión debe recogerse con un filtro LP de 505 nanómetros. Utilizando los protocolos descritos, se realizó un inmunomarcaje contra la proteína de células ganglionares R-B-P-M-S, que es una proteína de unión al ARN con flujo de empalme múltiple. Cuatro.

De hecho, la tinción se limitó a las células ganglionares en función de la especificación del anticuerpo. A continuación, se estudió la contribución de los canales de calcio activados por voltaje a la señal de calcio en los GC R utilizando los valores de intensidad fluorescente adquiridos del rgc. A niveles basales, los axones de RGC y RGC se pueden ver marcados con el flujo cuatro.

Con el fin de adquirir los valores de intensidad fluorescente, se colocaron ROIs en la célula ganglionar, somata y/o axones. Después de aplicar alto contenido de potasio a toda la preparación de la montura, la señal fluorescente de los RG C aumentó. A esto le siguió una reducción posterior de los valores de intensidad de fluorescencia en presencia de cobalto durante el segundo pulso de alto potasio.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cargar selectivamente las células ganglionares de la retina con un troquel indicador de calcio sintético en una preparación de montaje completo.