Detección rápida de la transcriptasa inversa del VIH y inhibidores de la integrasa

El objetivo general del siguiente experimento es examinar compuestos de interés para determinar su citotoxicidad celular y su capacidad para inhibir el VIH de tipo salvaje o resistente a los medicamentos en un solo ensayo de infectividad. Esto se logra exponiendo primero las células a los compuestos para su absorción y luego incubando las células tratadas con luciferasa que expresa el VIH de tipo salvaje o resistente a los medicamentos. A continuación, se puede medir la actividad luciferasa del virus.

En última instancia, la señal de lectura de luciferasa se puede utilizar para cuantificar la inhibición de la replicación del vector viral VIH V por parte de los compuestos. Esta técnica tiene implicaciones terapéuticas, ya que se puede utilizar para detectar nuevos compuestos que muestren una mejor eficacia contra el VIH resistente a los medicamentos. Dichos compuestos podrían utilizarse potencialmente en terapias antirretrovirales en pacientes con VIH Uno El día anterior a la transfección, placa 2 93 células en placas de 100 milímetros a una densidad de 1.500.000 células.

Al día siguiente, transfecte las células con 16 microgramos de VIH de tipo salvaje o mutante y cuatro microgramos de VSV utilizando la aplicación del método del fosfato de calcio. Seis horas después, lave las 2 93 células dos veces con PBS y luego incélelas con medios frescos durante 48 horas. Dos días después, recoja el virus que contiene sobrenadantes S de las placas de 100 milímetros de diámetro y clarifique los sobrenadantes mediante centrifugación a baja velocidad durante 10 minutos a 1.620 Gs a temperatura ambiente.

A continuación, filtre los sobrenadantes a través de un filtro de jeringa de 45 micromolares de tamaño de poro y trate las suspensiones virales con turbo ADN. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, diluya el virus con medios frescos y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Para realizar el cribado de los compuestos en un ensayo de infectividad el día anterior al experimento, siembre 4.000 de las células de interés en cada pocillo de un 96.

Coloque 100 microlitros de medio e incube a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. 24 horas después, diluya en serie el compuesto de la solución madre en medio fresco. Las concentraciones finales elegidas dependerán de un rango de concentraciones determinado empíricamente, como se describe en la tabla.

A continuación, agregue la dilución en serie de los compuestos a los pocillos por triplicado. A una décima parte del volumen de la concentración final, incubar la dilución adecuada de los compuestos con las células durante un mínimo de tres horas. Después de la incubación, utilice una pipeta multicanal para añadir 100 microlitros de virus diluido a cada uno de los pocillos.

Acepte los pozos de control negativos. A continuación, incubar las placas durante otras 48 horas. Después de la incubación, utilice una pipeta de vidrio equipada con una punta de pipeta de 200 microlitros para aspirar el medio de los pocillos, comenzando en la parte superior del medio y avanzando lentamente hacia la esquina inferior del pocillo.

Agregue inmediatamente 100 microlitros de PBS suplementado con cloruro de magnesio 0,5 milimolar a cada pocillo y, para medir la actividad de la luciferasa, agregue 10 microlitros del tampón de sustrato del ensayo de genes indicadores de luminiscencia a cada vial de reactivo liofilizado suministrado. A continuación, añada 100 microlitros del reactivo reconstituido a cada pocillo e incube la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que se desarrolle la señal. Finalmente, lea la placa de 96 pocillos usando un luminómetro de microplaca.

En la tabla se presentan los valores de luciferasa de un procedimiento exitoso de detección de compuestos. Tenga en cuenta que los compuestos potencialmente potentes exhiben una actividad de luciferasa creciente, y el control exhibe la señal más alta en este injerto representativo de Kaleido. La concentración del compuesto frente al porcentaje de inhibición de la actividad de Lucifer se ha trazado para determinar si el compuesto es eficaz para inhibir la replicación del VIH de tipo salvaje o resistente a los medicamentos.

Al intentar este procedimiento, es importante distribuir con precisión una cantidad uniforme de células y virus en todos los pocillos de las placas, y asegurarse de poner la concentración adecuada de compuestos en cada pocillo.