Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos

El objetivo general de este procedimiento es identificar metabolitos vegetales que sean antimicrobianos frente a bacterias anaerobias. Esto se logra primero separando un extracto vegetal mediante cromatografía en capa fina o TLC. A continuación, el cromatograma se corta en zonas que comprenden uno o más compuestos.

Luego, las zonas se colocan sobre agar inoculado con bacterias anaerobias y se incuban. Tras la incubación, se retiran las zonas y las placas se tiñen para identificar los compuestos que inhiben el crecimiento bacteriano. Los datos resultantes revelan la presencia o ausencia de metabolitos vegetales antimicrobianos.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nutrición de rumiantes, como cuáles son los efectos de los metabolitos secundarios de las plantas sobre la utilización de nutrientes por microorganismos específicos. Aunque este método revela compuestos vegetales que son inhibitorios para bacterias ruminales, también puede aplicarse para identificar compuestos inhibitorios frente a otras bacterias o hongos.

En este protocolo, se utilizarán compuestos fenólicos del trébol rojo para demostrar la identificación de compuestos antimicrobianos mediante biografía por contacto. Comience por limpiar las placas de cromatografía en capa fina o placas CCF trabajando en una campana extractora. Prepare suficiente disolvente de limpieza para cubrir el fondo de la cámara de desarrollo de CCF, así como el borde inferior de una placa CCF.

Cuando se coloca dentro de la cámara aquí, se prepara acetato de etilo y metanol en una proporción de dos a uno. A continuación, usando guantes y trabajando en una campana extractora, use tijeras para cortar placas de sílice flexibles con respaldo de aluminio o plástico, de modo que se ajusten a la cámara de elución.

Introduzca las placas en la cámara con las tapas apoyadas contra las paredes de la cámara. Las placas no deben tocarse entre sí. Tape la cámara y deje que el disolvente ascienda por las placas mediante acción capilar.

Cuando el disolvente haya alcanzado la parte superior de las placas, retírelas de la cámara y colóquelas en posición vertical en la campana extractora hasta que el disolvente se haya evaporado. Una vez que las placas estén secas, verifique si las impurezas han migrado cerca del extremo superior de las placas de CCF. Estas aparecerán como una banda amarilla a la luz visible o como una banda fluorescente bajo luz ultravioleta.

Si la mayor parte de la placa aún tiene un tono amarillento, repita el proceso de limpieza en la misma cámara de CCF utilizando el mismo disolvente. Después de retirar las placas de CCF de la cámara, deseche el disolvente. Deje que el disolvente residual evapore completamente antes de usar la cámara para la siguiente parte del protocolo.

A continuación, para eliminar la humedad residual que puede afectar la migración de los compuestos en la sílice, coloque las placas en posición vertical en una estufa de secado a 100 grados Celsius durante 10 a 15 minutos para placas de 20 por 20 centímetros, y durante cinco minutos para placas de 7 por 10 centímetros. Una vez que las placas estén secas, déjelas enfriar a temperatura ambiente antes de cargarlas con los extractos. Para preparar las cámaras para la separación de extractos, use tijeras para cortar un trozo de papel de filtro ligeramente inferior a la altura de la cámara y de un ancho aproximado a la mitad del perímetro de la cámara.

Este papel actuará como una mecha para ascender los disolventes por la pared de la cámara y saturarla con papeles de disolvente, mejorando así la reproducibilidad de las separaciones. En una campana extractora, mezcle aquí los disolventes. Los disolventes utilizados son acetato de etilo y metanol en una proporción de cuatro a uno (volumen por volumen). Vierta la mezcla de disolventes en la cámara y tápela.

Utilice un lápiz para marcar ligeramente el origen en un punto de la placa de TLC que quedará por encima de la superficie del disolvente de desarrollo en la cámara. Si el material absorbente de la placa de TLC es blando y se daña fácilmente, realice marcas en los bordes como se muestra aquí. A continuación, disuelva los extractos en suficiente disolvente orgánico para obtener una solución concentrada en lugar de una suspensión turbia.

Aquí el disolvente utilizado es metanol. Mediante micropipetas capilares o una jeringa de microlitros, cargue los patrones y las muestras como bandas estrechas, dejando un margen de un centímetro en los lados de la placa; permita que las bandas sequen, agitando la placa o colocándola en una campana extractora, lo cual ayuda a acelerar el secado. Una vez que las bandas hayan secado, cargue nuevamente las muestras en el mismo lugar o sobre el mismo punto.

Si se necesita una mayor concentración de muestra en la placa, repita según sea necesario en la cámara de CCF. Asegúrese de que la mecha completa se haya saturado con disolvente. Luego, con pinzas o tenazas, coloque las placas dentro de la cámara de CCF.

Las placas no deben tocar la mecha. Cubra la cámara y deje que las placas se desarrollen antes de que el frente del disolvente alcance la parte superior de la placa. Retire las placas del tanque de CCF y marque con un lápiz la altura del frente del disolvente.

Deje secar la placa. En una campana extractora, revele las placas TLC restantes en la misma cámara TLC, que generalmente puede utilizarse durante todo un día si se mantiene cerrada. Si la cantidad de disolvente en la cámara disminuye notablemente, prepare más mezcla de disolvente después de que las placas estén secas.

Visualice las bandas bajo luz visible o UV. Una cámara de visualización con una lámpara UV portátil es práctica, especialmente si la lámpara puede detectar compuestos tanto en luz UV de onda corta de 254 nanómetros como en luz UV de onda larga de 365 nanómetros. Utilice un lápiz para delimitar las bandas y obtenga imágenes de las placas usando un sistema de documentación fotográfica de geles equipado con luces superiores, UV y/o luz visible.

Finalmente, para ayudar a caracterizar las bandas, calcule el factor de retención o valores RF midiendo primero la distancia recorrida por el compuesto, luego midiendo la distancia recorrida por el disolvente y dividiendo la primera por la del disolvente. Una vez que se hayan marcado las posiciones de las bandas, las placas pueden almacenarse para su uso posterior. Utilícelas en el bioensayo.

Envuelva las placas en plástico y cúbralas con papel de aluminio. Almacene las placas a menos 20 grados Celsius. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad del compuesto, ya que la sílice no es neutra.

Algunos compuestos pueden degradarse mientras están en la placa de CCF. En preparación para el ensayo de biografía por contacto, prepare e inocule bacterias productoras de amoníaco en exceso o medio HAB bajo condiciones anaeróbicas. La cepa utilizada en este caso es Clostridium sticklandii cepa sr.

Cultive la muestra hasta la fase exponencial o estacionaria a 39 grados Celsius. Utilice técnicas estériles anaeróbicas al trabajar con microorganismos anaerobios. Prepare al 0,75 % peso por volumen.

Agar en el mismo medio utilizado para cultivar las bacterias una vez que la temperatura del agar haya disminuido a menos de 60 grados Celsius. Inocular el agar fundido con 1% en volumen por volumen del cultivo y mezclar suavemente; colocarlo inmediatamente en una cámara anaeróbica y verterlo en placas de Petri plásticas de 15 por 100 milímetros con tijeras. Cortar la placa de capa fina (TLC) en zonas que contengan la banda o bandas de interés.

Utilizando un rotulador, marque los lados posteriores de las placas. Coloque una tira de CCF no utilizada sobre la placa de agar como control. Luego, coloque las bandas con la cara hacia abajo sobre las placas de agar.

Incubar las placas con el lado del agar hacia abajo en la cámara anaeróbica del incubador durante 24 horas a 39 grados Celsius con pinzas. Retirar las bandas de TLC de las placas de agar mientras estas se encuentran en la cámara anaeróbica.

Añada tetra oleum rojo gota a gota sobre las superficies de las placas de agar. Deje que el color se desarrolle durante al menos 20 minutos. Cuando la placa control se vuelva completamente roja, retire las placas de la cámara anaeróbica.

Clostridium stick Landi es una bacteria anaerobia, por lo que comenzará a perder viabilidad inmediatamente después de su extracción de la cámara anaerobia, aunque el color permanece estable durante más de 24 horas. Fotografíe las placas con una cámara digital bajo luz visible, utilizando un fondo que proporcione contraste suficiente. Se observará un color rojo brillante cuando las células vivas estén teñidas.

Las células muertas no se tiñen. Aquí se muestran separaciones representativas por sílice, cromatografía en capa fina, de extractos de trébol rojo que contienen compuestos fenólicos. La separación en acetato de etilo y hexano en una proporción de nueve a uno a lo largo de 8,5 centímetros dio lugar a cinco bandas, una de las cuales se resolvió completamente desde el origen.

Los patrones cargados fueron Formin Bio Canon A y Genine. Se aplicaron cuatro bandas de esta placa a cultivos con Clostridium stick Landi, una bacteria ruminal productora de amoníaco en exceso, durante 24 horas, y se tiñeron con rojo tetra oleína según se describe aquí. La incubación con la banda uno Bio Canon A y parte de la banda dos cuatro Monon nein en agar sembrado con bacterias dio como resultado una zona bien definida de inhibición.

Sin embargo, la incubación del resto de la banda dos, junto con las bandas tres y cuatro, no inhibió el crecimiento bacteriano. Estos resultados demostraron que el bio Canon A fue inhibitorio para el crecimiento de see stickland eye, pero la forma aone Nein no lo fue. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la técnica es flexible.

Pueden utilizarse otros microorganismos de prueba siempre que se seleccionen medios adecuados e incluyan controles para asegurar que la química de separación y el método de detección sean compatibles siguiendo este procedimiento. Otras técnicas como la cromatografía líquida de alta eficacia y la espectrometría de masas pueden emplearse para ayudar a caracterizar los compuestos antimicrobianos identificados en un bioensayo.