Name: Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprende a identificar metabolitos antimicrobianos en plantas mediante cromatografía en capa fina y bioautografía de contacto. Este método permite detectar compuestos fenólicos del trébol rojo con actividad antibacteriana contra bacterias anaerobias del rumen bovino.

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Damos las gracias al difunto Dr. Norma Taylor, Dept. Vegetal y Edafología de la Universidad de Kentucky, por permitirnos usar muestras de sus parcelas de trébol rojo para este estudio. Este proyecto fue financiado por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.

1. Preparación del extracto de la planta <ol><li> Ver Kagan y Flythe 10 para la extracción de compuestos fenólicos de cv Trifolium pratense. Kenland. </li><li> Para extraer otros compuestos en otras plantas, comprobar la literatura análisis fitoquímico para los métodos de extracción de plantas-o-metabolitos específicos (muchos se describen), o buscar protocolos tales como los de Khurram et al. 7,8 que aíslan muchos compuestos con una amplia gama de polaridades. </li></ol> 2. Preparación de las placas de capa fina <ol><li> Limpiar las placas de TLC mediante el desarrollo en uno o más disolventes polares y neutros, con el fin de mover los contaminantes adsorbidos lejos de la zona de desarrollo. <ol><li> En una campana de humos, preparar suficiente disolvente de limpieza (por ejemplo 15-100 ml de acetato de etilo-metanol 2:1, v / v) para cubrir la parte inferior de la cámara de desarrollo de TLC, así como el borde inferior de una placa de TLC cuando conjunto dentro de la cámara. </li><li> Utilice comercialmentevidrio cialmente disponibles TLC desarrollando cámaras (diferentes tamaños disponibles, con tapas) o vasos de precipitados Pyrex de papel de aluminio cubierto o tarros de conserva. </li><li> Utilice unas tijeras para cortar aluminio-o (flexibles) placas de gel de sílice con forro de plástico, que vienen en varios tamaños (20 cm x 20 cm y más pequeñas), para adaptarse a la cubeta de desarrollo disponibles. (Precaución: La sílice puede causar daño a los pulmones si se inhala Trabajar en una campana extractora, y manejar las placas de TLC con guantes para evitar los aceites de la piel sobre la sílice.). </li><li> Inserte las placas dentro de la cámara, con las partes superiores se inclinan contra las paredes de la cámara. Las placas no deben tocarse. Cubra la cámara y dejar que el disolvente se mueven hasta la placa por acción capilar. </li><li> Cuando disolvente haya alcanzado la parte superior de las placas, quite las placas de la cámara y disponer en una posición de pie dentro de la campana de extracción hasta que el disolvente se ha evaporado. </li><li> Compruebe si las impurezas han emigrado cerca de la parte superior de la placa de TLC mediante la búsqueda de una banda amarilla bajo visibleluz, o una banda fluorescente bajo la luz ultravioleta (UV) (véase el &quot;frente impureza&quot; o si en la Figura 2B). Si la mayoría de la placa todavía tiene un tinte amarillento, repita el proceso de limpieza. </li><li> Después de quitar las placas de TLC de la cámara, desechar el disolvente. Permitir que el disolvente residual se evapore por completo antes de utilizar la cámara para el Protocolo 2. </li><li> Para eliminar la humedad residual que puede afectar a la migración de los compuestos sobre sílice 16, apuntalar las placas en posición vertical en un horno de secado a 100 ° C (10-15 min para un 20 cm x 20 cm de placa, y 5 min de 7 cm x 10 cm placas ). </li><li> Si un horno de secado 100 ° C no está disponible, placas de calor para un período de tiempo más largo a temperaturas más bajas (es decir, 40 min a 60 ° C). </li><li> Después de que las placas están secas, deje que se enfríen a temperatura ambiente antes de la carga. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de Desarrollo de las Cámaras por la Separación Extract <ol&gt; <li> Utilice unas tijeras para cortar un trozo de papel de filtro ligeramente por debajo de la altura de la cámara, y aproximadamente la mitad del perímetro de la cámara de ancho. Este documento actúa como una mecha para extraer los solventes hasta la pared de la cámara y saturar la cámara con los vapores de solventes, lo que mejora la reproducibilidad de las separaciones 1. </li><li> En una campana de extracción, mezcla de disolventes (acetato de etilo-metanol 4:1, v / v, para este estudio). Vierta la mezcla de disolvente en la cámara y la tapa. Espere hasta que la mecha está mojada con solvente, lo que indica la saturación de la cámara, para poner las placas en la cámara. </li></ol> 4. La carga y el Desarrollo de las placas de TLC <ol><li> Marque ligeramente el origen con el lápiz. Si la placa de adsorbente TLC es suave y fácil de dañar, hacer marcas en los bordes. Los compuestos deben estar por encima de la superficie del disolvente de desarrollo cuando las placas se insertan en la cámara de TLC. </li><li> Disolver los extractos en disolvente orgánico suficiente (en este caso, metanol) para tener una solución concentrada en lugar de una turbiasuspensión. </li><li> Cargue las muestras y estándares como bandas estrechas con una jeringa de microlitro o micropipetas capilares, dejando un borde de 1 cm en los lados de la placa. Permita que las bandas se sequen (avivando la placa o cargarlo en una campana de humos ayuda). </li><li> Si se necesita una mayor concentración de la muestra en un plato, &quot;overspot&quot; de cargar las muestras una vez más en las bandas secas. </li><li> Con unas pinzas o tenazas, placa (s) situada en el interior de la cámara de TLC saturado. Las placas no deben tocar la mecha, ya que puede proporcionar solvente a las placas en los puntos de contacto, alterando así el camino de la migración compuesto. Cubierta de la cámara y dejar que las placas se desarrollan. </li></ol> 5. Preparación de las placas para valoración biológica <ol><li> Quite la placa (s) de depósito de TLC antes de que el frente del disolvente alcance la parte superior de la placa, y marcar la altura de la frente del disolvente con un lápiz. Deje placa seca en la campana de humos. <ol><li> Desarrollar las placas de TLC restantes en la misma cámara de TLC, que es GEnerally utilizable para un día entero si se mantiene cerrado. Remake mezcla de disolvente para cámara de TLC si la cantidad de disolvente en la cámara disminuye notablemente. </li></ol></li><li> Después de placas están secas, visualizar bandas bajo luz visible o UV, y delimitar las bandas con un lápiz. Una cámara de visión con una lámpara UV portátil es conveniente, especialmente si la lámpara puede detectar compuestos, tanto en 254 nm (UV de onda corta) y 365 nm (longitud de onda larga UV). Nota: En este momento o después de la etapa siguiente, las placas pueden ser envueltos en papel plástico, cubierto con papel de aluminio, y se almacenan a -20 ° C. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad del compuesto. Debido a que la sílice no es neutral, algunos compuestos se degradan mientras que en la placa de TLC. </li><li> Fotografiar o dibujar placas. <ol><li> Utilice un sistema de documentación fotográfica gel si uno equipado con UV por encima y / o luz visible está disponible. </li><li> Si hay un sistema de documentación fotográfica comercial está disponible, placas fotografía dentro de una caja forrada con papel oscuro o de tela, with un conjunto de cámara en un trípode y una luz UV portable sujeta a un anillo de soporte 17. Al fotografiar las placas que no tienen ningún indicador fluorescente, utilice un filtro de luz azul sobre el lente de la cámara para mejorar la apariencia de banda 17. </li></ol></li><li> Para ayudar en la caracterización de las bandas, calcular los valores del factor de retención (Rf) midiendo las distancias recorridas por los compuestos y frente del solvente y dividiendo el primero por el segundo (Figura 2A). </li></ol> 6. Bacteriana cultura y Ensayo <ol><li> Preparar e inocular los medios de comunicación en condiciones anaeróbicas. El cultivo utilizado en este caso fue Clostridium SR cepa sticklandii, que se obtuvo de la colección de cultivos de James B. Russell, de la Universidad de Cornell, Ithaca, NY. <ol><li> Ver Flythe y Kagan 13 y la lista de materiales para una descripción de los medios de comunicación HAB. </li></ol></li><li> Mantener el cultivo hasta la fase exponencial o estacionaria. Utilice techniqu anaeróbico estériles cuando se trabaja con microorganismos anaerobios. </li><li> Inocular la cultura (1% v / v) en agar fundido después que la temperatura del agar (0,75% W / V) ha disminuido a menos de 60 ° C. Mezclar suavemente y poner inmediatamente en una cámara anaeróbica (95% de CO 2 5% atmósfera de H2 para medios HAB) para verter. </li><li> Vierta en x 100 mm placas Petri de plástico de 15 mm, y dejar que se solidifique. </li><li> Con unas tijeras, corte la placa de TLC en zonas que contienen la banda (s) de interés. Coloque bandas boca abajo sobre placas de agar, marcando bandas en el forro de la placa para realizar un seguimiento de la orientación del original en la placa de TLC. Colocar una tira de TLC no utilizada en una placa de agar como control. </li><li> Incubar las placas de agar, agar hacia abajo, en la cámara anaeróbica (24 hr, 39 ° C). </li></ol> 7. La visualización de las placas de agar bioensayan <ol><li> Con unas pinzas, extraer bandas de placas de agar mientras están en la cámara anaeróbica. </li><li> Añadir 1% (w / v) de TErojo trazolium, preparada en agua, gota a gota sobre las superficies de las placas de agar. Deje que el color se desarrolle por lo menos durante 20 minutos, o hasta que la placa de control se vuelve completamente roja, antes de sacarlo de la cámara anaeróbica. Las bacterias anaerobias se comienzan a perder viabilidad después de la toma de la cámara anaeróbica, pero el color es estable durante más de 24 horas. </li><li> Fotografiar bajo luz visible. </li></ol>

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</ol>

La mención de nombres comerciales o productos comerciales en el artículo es el único fin de proporcionar información específica y no implica recomendación ni aprobación por el USDA. Los autores declaran no tener ningún interés financiero en competencia.

Este protocolo describe un método sencillo para la separación de un extracto en subconjuntos de compuestos y ensayando esos subconjuntos por contacto bioautografía. El método es bastante similar a uno utilizado por Chomnawang et al. 15 para la detección de metabolitos vegetales inhibitorios para las bacterias que causan la gonorrea. El tipo de bioautografía empleado para la detección de compuestos antimicrobianos de plantas depende de muchos factores, incluyendo el microorganismo de ensayo, la config...

El ensayo para compuestos antimicrobianos en las plantas requiere la separación de los componentes de un extracto de la planta, la exposición de un microorganismo de ensayo a los componentes, y la determinación de si el crecimiento del microorganismo es inhibido por cualquiera de los compuestos. Separaciones por papel o la cromatografía en capa fina (PC o TLC) son convenientes porque muchos compuestos pueden ser separados en una superficie plana. La separación se basa en la polaridad, con algunos compuestos que se unen fuertemente al adsorbente (celulosa en el caso de la PC, y una variedad de adsorbentes en el caso de TLC) y la migración de menos que otros 1. La Figura 1 proporciona un ejemplo de las posiciones relativas de compuestos fenólicos polares y no polares después de separación en una placa de TLC de sílice. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama que ilustra las distribuciones de compuestos de diferentes polaridades después de separación en una capa fina de sílice para cromatografía (TLC) placa. Compuestos fenólicos de trébol rojo (Trifolium pratense L.) se utilizan como un ejemplo. Los compuestos polares, tales como clovamide, tienen una fuerte afinidad por un adsorbente polar como sílice y permanecen cerca del origen (O), mientras que los compuestos polares menos, tales como las tres isoflavonas cerca de la frente del disolvente (SF), partición más fácilmente en los disolventes (que son menos polares que a menos que la sílice se incluyen agua, ácidos o bases) y migrar más arriba de la placa. Después de la separación de un extracto en una placa de TLC, microorganismos de prueba pueden estar expuestos a todos los compuestos en la placa, acelerando así la identificación de los componentes activos de un extracto 2. Si un cultivo fúngico o bacteriano se expone a la cromatograma, el crecimiento microbiano se producirá en todas partes excepto en áreas con crecimiento-inhibidorcompuestos y. Las zonas de inhibición a continuación, se pueden visualizar mediante la observación del contraste entre el crecimiento del micelio y las áreas de crecimiento libre de hongos si se han aplicado 3 o por pulverización con compuestos que cambian de color cuando se reduce o hidrolizado por las células vivas 4. Aunque el uso de papel o de capa fina cromatogramas para los ensayos antimicrobianos se aplicó primero a los antibióticos y fungicidas 5 3,6, extractos de plantas ahora son analizados con frecuencia para los compuestos antimicrobianos con este método, a menudo referido como bioautografía. Los protocolos descritos en el presente documento se aplican a bioautografía de los cromatogramas de capa fina. TLC se utiliza ampliamente debido a que es relativamente rápida y se puede realizar en diferentes adsorbentes (por ejemplo, sílice, almidón, alúmina), así como proporcionando buena resolución y sensibilidad 1. Los extractos de plantas se pueden preparar para TLC de muchas maneras. Los métodos comunes incluyen material vegetal de extracción en alcmezclas ohol-agua tales como etanol al 80% 7,8, posiblemente con la adición de ácido o base 9. Después de una extracción en tales disolventes, que contienen un poco de agua y son, posiblemente, ácido o básico, extractos deben concentrarse de manera que puedan ser aplicadas a placas de TLC en un volumen mínimo. La concentración de los extractos de alcohol-agua se puede lograr mediante la partición con disolventes orgánicos inmiscibles en agua 8 o con una mezcla de tales disolventes, tales como acetato de acetato de etilo-éter (1:1, v / v) 10,11. Diferentes metabolitos vegetales se extraen en diferentes disolventes orgánicos, dependiendo de sus polaridades. Para garantizar que los ácidos o bases orgánicos vegetales se extraen en disolventes orgánicos en esta etapa, el pH de un extracto de alcohol y agua se puede subir o bajar con un ácido o base soluble en agua para convertir los analitos disociadas en sus formas no disociada, que luego se soluble en disolventes orgánicos neutros 9. La fase orgánica puede entonces ser correovaporated bajo presión reducida o en atmósfera de nitrógeno y se ajustó hasta el volumen deseado para TLC. El pH del extracto es poco probable que sea letal para microorganismos de bioensayo debido a la compartimentación de los analitos en disolventes neutros, pequeño volumen final, y la evaporación del extracto sobre la placa de TLC antes de la separación. Ambos hongos y bacterias se emplean como microorganismos de prueba en bioautografía de extractos de plantas 2. Las esporas de algunos hongos, tales como Cladosporium cucumerinum, germinan en placas de TLC (aparte de las zonas con compuestos inhibidores) si se pulveriza sobre las placas en una solución nutriente y se incubaron en un ambiente húmedo durante varios días 3. El micelio oscuro de la C. cucumerinum en zonas no inhibidor proporciona un fuerte contraste con las zonas francas de crecimiento del micelio. Aunque las bacterias se han aplicado a cromatografía en capa fina (TLC) placas de la misma manera 4,12, las bacterias también se vierten sobre TLCsuperficies de las placas de agar se superpone a 13,14. Levaduras, tales como Candida albicans, se puede aplicar en las capas de agar, así 14. Alternativamente, las placas de TLC se pueden colocar boca abajo en agar inoculado con bacterias o levaduras 10,15 8, un método conocido como el contacto bioautografía 2. Se describe un método para el contacto bioautografía para la detección de compuestos fenólicos antimicrobianos a partir de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland). El microorganismo de ensayo es Clostridium sticklandii, un hiper bacteria productora de amoníaco ruminal (HAB) y obligar anaerobio. Aunque las separaciones utilizadas no resuelven todos los componentes del extracto, facilitan la identificación de las zonas de actividad antimicrobiana, reduciendo de este modo el conjunto de posibles compuestos antimicrobianos. El protocolo utiliza procedimientos estándar para TLC 1. El protocolo también describe algunas de las técnicas necesarias para obli cultivoanaerobios puerta de dicho ensayo, el uso de contactos bioautografía 15 y un método de visualización con una sal de tetrazolio, que tiñe las células vivas 2,4.

<table><tbody><tr><td>Sílice F254 Placas TLC, con respaldo de aluminio, 0,2 mm de espesor, 20 cm x 20 cm</td><td>EMD Chemicals</td><td>5554/7</td><td>Estas placas están recubiertas con sílice que contiene un indicador fluorescente a 254 nm. Los compuestos que se absorben en esa longitud de onda aparecen oscuros sobre un fondo verde fluorescente. Las fuentes alternativas incluyen Analtech, Selecto Scientific, Fluka. Es posible que se necesiten adsorbentes distintos de la sílice. Las placas con respaldo de plástico pueden ser adecuadas, dependiendo de los solventes que se utilicen.</td></tr><tr><td>Tijeras afiladas y resistentes&nbsp;</td><td>cualquier empresa de suministros</td><td>de costura similar a Fiskars 175800-1002</td><td>para cortar placas TLC. También se puede usar un cortador de papel con una cuchilla afilada. No inhale polvo de sílice.</td></tr><tr><td>Horno de secado a 100 & grados; C (convección mecánica)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR305225M</td><td>Quincy Lab, Inc., Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td></tr><tr><td>Cámara TLC</td><td>Kimble Chase</td><td>416180-0000</td><td>Fuentes alternativas:&nbsp; Aldrich. Los vasos de precipitados o tarros de conserva Pyrex se pueden utilizar para platos pequeños (por ejemplo, de 5 cm x 10 cm).&nbsp; Cubra con papel de aluminio (las tapas de los frascos pueden contener material extraíble por vapores de solventes).</td></tr><tr><td>50 y micro; l Jeringa con punta de aguja plana</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td>Para cargar cantidades de patrón o muestra superiores a 5-10 &micro;l.&nbsp; Las fuentes alternativas son equivalentes.</td></tr><tr><td>Micropipetas</td><td>Drummond</td><td>2-000-001</td><td>Para cargar pequeñas cantidades de patrones o muestras. Fuentes alternativas:&nbsp; VWR.&nbsp; Además, las pipetas Pasteur se pueden estirar hasta un diámetro más delgado con un soplete de butano. &nbsp;</td></tr><tr><td>Papel de filtro (grado #1)</td><td>Whatman</td><td>1001 917</td><td>Sirve como mecha de cámara. Otros grados de papel de filtro están bien. Este tamaño se puede recortar para las cámaras que contienen placas de 20 cm x 20 cm. &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzas para vasos de precipitados</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-186</td><td>Para colocar placas dentro y fuera de una cámara TLC grande. Fuentes alternativas: VWR&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinzas de borde plano</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td>Para colocar placas dentro y fuera de una cámara pequeña. Fuentes alternativas: VWR </td></tr><tr><td>Pequeña lámpara UV portátil con bombillas de 4 W o 6 W para la iluminación con luz UV de onda corta y larga (254 y 365 nm, respectivamente)</td><td>Productos ultravioleta</td><td>95-0271-01</td><td>Fuentes alternativas: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td></tr><tr><td>Gabinete de visualización para uso con lámpara UV de mano</td><td>Productos ultravioleta</td><td>Chromato-Vue C-10E</td><td>Las bandas activas a los rayos UV se enmarcan más fácilmente en un círculo si las placas se pueden colocar aquí. Fuentes alternativas: Spectronics Corporation.</td></tr><tr><td>Sistema de fotodocumentación con lámpara UV de techo y lámpara visible</td><td>Kodak</td><td>Gel Logic 200</td><td>&nbsp; Fuentes alternativas: Productos ultravioleta (www.uvp.com).&nbsp; Consulte el protocolo para la alternativa casera.</td></tr><tr><td>Cámara Anaeróbica, Tipo A, Vinilo</td><td>Coy</td><td>7150000</td><td>Esta cámara es apropiada para bacterias anaeróbicas, como Clostridium sticklandii, como se describe. Sin embargo, las condiciones de crecimiento deben adaptarse al organismo utilizado en el ensayo. Se debe tomar una cabina de bioseguridad y otras precauciones si se utilizan organismos patógenos. Fuentes alternativas: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, otros&nbsp;</td></tr><tr><td>Tetrazolio rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td>Fuentes alternativas: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td></tr><tr><td colspan="4">Ingredients for HAB media</td></tr><tr><td>Pyridoxamine &middot; 2HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9380</td><td>Para esto y para todos los demás reactivos de esta tabla, las fuentes alternativas son equivalentes.</td></tr><tr><td>Riboflavina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3902</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3376</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantotenato de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>Ácido lipoico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5625</td><td></td></tr><tr><td>ácido p-aminobenzoico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9878</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8798</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Cobalamina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3607</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9130</td><td></td></tr><tr><td>Piridoxina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de hierro &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinc &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso &middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobre &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>459097</tr><tr><td>Cloruro de níquel &middot; 6H2</td><td>O Sigma-Aldrich</td><td>203866</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de sodio &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>Tripticasa (digestión pancreática de la caseína)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B11921</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico anhidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio &middot; H2O&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>S636</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Thermo Fisher</td><td>50841063</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio &middot; 6H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio &middot; 2H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína HCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>19464780</td><td></td></tr><tr><td>Potasio fosfato dibásico anhidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>P290</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr></tbody></table>

cromatográfico en capa fina (tlc) separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Una pantalla común para los compuestos antimicrobianos de plantas consiste en la separación de extractos de plantas por papel o cromatografía en capa fina (PC o TLC), la exposición de los cromatogramas a las suspensiones microbianas (por ejemplo hongos o bacterias en caldo o agar), dejando tiempo para que los microbios para crecer en un ambiente húmedo, y la visualización de zonas sin crecimiento microbiano. La eficacia de este método de detección, conocido como bioautografía, depende tanto de la calidad de la separación cromatográfica y el cuidado con las condiciones de cultivo microbianos. Este artículo describe los protocolos estándar para TLC y el contacto bioautografía con una novedosa aplicación a los amino ácidos bacterias que fermentan. El extracto se separa en (aluminio con respaldo) placas de TLC de sílice flexibles, y las bandas se visualizaron bajo luz ultravioleta (UV). Las zonas se cortaron y se incubaron boca abajo en agar inoculado con el microorganismo de ensayo. Bandas inhibidoras se visualizaron por tinción de la placa de agars con tetrazolio rojo. El método se aplica a la separación de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) compuestos fenólicos y su programación para la actividad contra Clostridium sticklandii, una bacteria productora de amoníaco hiper (HAB) que es nativa al rumen bovino. Los métodos de TLC se aplican a muchos tipos de extractos de plantas y otras especies bacterianas (aeróbicas o anaeróbicas), así como hongos, pueden ser utilizados como organismos de prueba si las condiciones de cultivo se modifican para adaptarse a los requisitos de crecimiento de las especies.

Representante separaciones TLC de sílice de trébol rojo (Trifolium pratense cv. Kenland) extractos, que contienen compuestos fenólicos, se muestran en la Figura 2. Separación de extracto de trébol rojo en acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), más de 8,5 cm, dio lugar a cinco bandas, una forma incompleta resuelto desde el origen (Figura 2A). Sin embargo, la Figura 2B demuestra que alrededor del doble de las bandas fueron reveladas cuando una muestra diferente de...

Se describen procedimientos para cromatografía en capa fina (TLC) separación de extractos de plantas y el contacto bioautografía para identificar metabolitos antibacterianos. Los métodos se aplican a la selección de compuestos fenólicos de trébol rojo que inhiben las bacterias productoras de amoniaco hiper (HAB) nativas para el rumen bovino.

Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar metabolitos vegetales que sean antimicrobianos frente a bacterias anaerobias. Esto se logra primero separando un extracto vegetal mediante cromatografía en capa fina o TLC. A continuación, el cromatograma se corta en zonas que comprenden uno o más compuestos.Luego, las zonas se colocan sobre agar inoculado con bacterias anaerobias y se incuban. Tras la incubación, se retiran las zonas y las placas se tiñen para identificar los compuestos que inhiben el crecimiento bacteriano. Los datos resultantes revelan la presencia o ausencia de metabolitos vegetales antimicrobianos.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nutrición de rumiantes, como cuáles son los efectos de los metabolitos secundarios de las plantas sobre la utilización de nutrientes por microorganismos específicos. Aunque este método revela compuestos vegetales que son inhibitorios para bacterias ruminales, también puede aplicarse para identificar compuestos inhibitorios frente a otras bacterias o hongos.En este protocolo, se utilizarán compuestos fenólicos del trébol rojo para demostrar la identificación de compuestos antimicrobianos mediante biografía por contacto. Comience por limpiar las placas de cromatografía en capa fina o placas CCF trabajando en una campana extractora. Prepare suficiente disolvente de limpieza para cubrir el fondo de la cámara de desarrollo de CCF, así como el borde inferior de una placa CCF.Cuando se coloca dentro de la cámara aquí, se prepara acetato de etilo y metanol en una proporción de dos a uno. A continuación, usando guantes y trabajando en una campana extractora, use tijeras para cortar placas de sílice flexibles con respaldo de aluminio o plástico, de modo que se ajusten a la cámara de elución.Introduzca las placas en la cámara con las tapas apoyadas contra las paredes de la cámara. Las placas no deben tocarse entre sí. Tape la cámara y deje que el disolvente ascienda por las placas mediante acción capilar.Cuando el disolvente haya alcanzado la parte superior de las placas, retírelas de la cámara y colóquelas en posición vertical en la campana extractora hasta que el disolvente se haya evaporado. Una vez que las placas estén secas, verifique si las impurezas han migrado cerca del extremo superior de las placas de CCF. Estas aparecerán como una banda amarilla a la luz visible o como una banda fluorescente bajo luz ultravioleta.Si la mayor parte de la placa aún tiene un tono amarillento, repita el proceso de limpieza en la misma cámara de CCF utilizando el mismo disolvente. Después de retirar las placas de CCF de la cámara, deseche el disolvente. Deje que el disolvente residual evapore completamente antes de usar la cámara para la siguiente parte del protocolo.A continuación, para eliminar la humedad residual que puede afectar la migración de los compuestos en la sílice, coloque las placas en posición vertical en una estufa de secado a 100 grados Celsius durante 10 a 15 minutos para placas de 20 por 20 centímetros, y durante cinco minutos para placas de 7 por 10 centímetros. Una vez que las placas estén secas, déjelas enfriar a temperatura ambiente antes de cargarlas con los extractos. Para preparar las cámaras para la separación de extractos, use tijeras para cortar un trozo de papel de filtro ligeramente inferior a la altura de la cámara y de un ancho aproximado a la mitad del perímetro de la cámara.Este papel actuará como una mecha para ascender los disolventes por la pared de la cámara y saturarla con papeles de disolvente, mejorando así la reproducibilidad de las separaciones. En una campana extractora, mezcle aquí los disolventes. Los disolventes utilizados son acetato de etilo y metanol en una proporción de cuatro a uno (volumen por volumen). Vierta la mezcla de disolventes en la cámara y tápela.Utilice un lápiz para marcar ligeramente el origen en un punto de la placa de TLC que quedará por encima de la superficie del disolvente de desarrollo en la cámara. Si el material absorbente de la placa de TLC es blando y se daña fácilmente, realice marcas en los bordes como se muestra aquí. A continuación, disuelva los extractos en suficiente disolvente orgánico para obtener una solución concentrada en lugar de una suspensión turbia.Aquí el disolvente utilizado es metanol. Mediante micropipetas capilares o una jeringa de microlitros, cargue los patrones y las muestras como bandas estrechas, dejando un margen de un centímetro en los lados de la placa; permita que las bandas sequen, agitando la placa o colocándola en una campana extractora, lo cual ayuda a acelerar el secado. Una vez que las bandas hayan secado, cargue nuevamente las muestras en el mismo lugar o sobre el mismo punto.Si se necesita una mayor concentración de muestra en la placa, repita según sea necesario en la cámara de CCF. Asegúrese de que la mecha completa se haya saturado con disolvente. Luego, con pinzas o tenazas, coloque las placas dentro de la cámara de CCF.Las placas no deben tocar la mecha. Cubra la cámara y deje que las placas se desarrollen antes de que el frente del disolvente alcance la parte superior de la placa. Retire las placas del tanque de CCF y marque con un lápiz la altura del frente del disolvente.Deje secar la placa. En una campana extractora, revele las placas TLC restantes en la misma cámara TLC, que generalmente puede utilizarse durante todo un día si se mantiene cerrada. Si la cantidad de disolvente en la cámara disminuye notablemente, prepare más mezcla de disolvente después de que las placas estén secas.Visualice las bandas bajo luz visible o UV. Una cámara de visualización con una lámpara UV portátil es práctica, especialmente si la lámpara puede detectar compuestos tanto en luz UV de onda corta de 254 nanómetros como en luz UV de onda larga de 365 nanómetros. Utilice un lápiz para delimitar las bandas y obtenga imágenes de las placas usando un sistema de documentación fotográfica de geles equipado con luces superiores, UV y/o luz visible.Finalmente, para ayudar a caracterizar las bandas, calcule el factor de retención o valores RF midiendo primero la distancia recorrida por el compuesto, luego midiendo la distancia recorrida por el disolvente y dividiendo la primera por la del disolvente. Una vez que se hayan marcado las posiciones de las bandas, las placas pueden almacenarse para su uso posterior. Utilícelas en el bioensayo.Envuelva las placas en plástico y cúbralas con papel de aluminio. Almacene las placas a menos 20 grados Celsius. El tiempo máximo de almacenamiento depende de la estabilidad del compuesto, ya que la sílice no es neutra.Algunos compuestos pueden degradarse mientras están en la placa de CCF. En preparación para el ensayo de biografía por contacto, prepare e inocule bacterias productoras de amoníaco en exceso o medio HAB bajo condiciones anaeróbicas. La cepa utilizada en este caso es Clostridium sticklandii cepa sr.Cultive la muestra hasta la fase exponencial o estacionaria a 39 grados Celsius. Utilice técnicas estériles anaeróbicas al trabajar con microorganismos anaerobios. Prepare al 0,75 % peso por volumen.Agar en el mismo medio utilizado para cultivar las bacterias una vez que la temperatura del agar haya disminuido a menos de 60 grados Celsius. Inocular el agar fundido con 1% en volumen por volumen del cultivo y mezclar suavemente; colocarlo inmediatamente en una cámara anaeróbica y verterlo en placas de Petri plásticas de 15 por 100 milímetros con tijeras. Cortar la placa de capa fina (TLC) en zonas que contengan la banda o bandas de interés.Utilizando un rotulador, marque los lados posteriores de las placas. Coloque una tira de CCF no utilizada sobre la placa de agar como control. Luego, coloque las bandas con la cara hacia abajo sobre las placas de agar.Incubar las placas con el lado del agar hacia abajo en la cámara anaeróbica del incubador durante 24 horas a 39 grados Celsius con pinzas. Retirar las bandas de TLC de las placas de agar mientras estas se encuentran en la cámara anaeróbica.Añada tetra oleum rojo gota a gota sobre las superficies de las placas de agar. Deje que el color se desarrolle durante al menos 20 minutos. Cuando la placa control se vuelva completamente roja, retire las placas de la cámara anaeróbica.Clostridium stick Landi es una bacteria anaerobia, por lo que comenzará a perder viabilidad inmediatamente después de su extracción de la cámara anaerobia, aunque el color permanece estable durante más de 24 horas. Fotografíe las placas con una cámara digital bajo luz visible, utilizando un fondo que proporcione contraste suficiente. Se observará un color rojo brillante cuando las células vivas estén teñidas.Las células muertas no se tiñen. Aquí se muestran separaciones representativas por sílice, cromatografía en capa fina, de extractos de trébol rojo que contienen compuestos fenólicos. La separación en acetato de etilo y hexano en una proporción de nueve a uno a lo largo de 8,5 centímetros dio lugar a cinco bandas, una de las cuales se resolvió completamente desde el origen.Los patrones cargados fueron Formin Bio Canon A y Genine. Se aplicaron cuatro bandas de esta placa a cultivos con Clostridium stick Landi, una bacteria ruminal productora de amoníaco en exceso, durante 24 horas, y se tiñeron con rojo tetra oleína según se describe aquí. La incubación con la banda uno Bio Canon A y parte de la banda dos cuatro Monon nein en agar sembrado con bacterias dio como resultado una zona bien definida de inhibición.Sin embargo, la incubación del resto de la banda dos, junto con las bandas tres y cuatro, no inhibió el crecimiento bacteriano. Estos resultados demostraron que el bio Canon A fue inhibitorio para el crecimiento de see stickland eye, pero la forma aone Nein no lo fue. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la técnica es flexible.Pueden utilizarse otros microorganismos de prueba siempre que se seleccionen medios adecuados e incluyan controles para asegurar que la química de separación y el método de detección sean compatibles siguiendo este procedimiento. Otras técnicas como la cromatografía líquida de alta eficacia y la espectrometría de masas pueden emplearse para ayudar a caracterizar los compuestos antimicrobianos identificados en un bioensayo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Composición de los extractos de lípidos polares y la composición de ácidos grasos de glicerolípidos individuales están determinados en un experimento de lípidos perfil simple y robusto. Para ello, glicerolípidos están aislados por cromatografía en capa fina y se somete a transmetilación de sus grupos acilo. Grasos methylesters acilo son cuantificados por cromatografía de gases.

Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

Los productos naturales representan prometedores puntos de partida para el desarrollo de nuevos fármacos y agentes terapéuticos. Sin embargo, debido a la alta diversidad química, encontrar nuevos compuestos terapéuticos de las plantas es una tarea difícil y que consume mucho tiempo. Describimos un enfoque simplificado para identificar moléculas antimicrobianas y antibiócidas a partir de extractos y fracciones vegetales.

Enfoque sistemático para identificar nuevas moléculas antimicrobianas y antibiócidas de extractos y fracciones de plantas para prevenir caries dentales

El presente protocolo desarrolló un método para estimar el rendimiento de compuestos en la placa TLC utilizando la técnica de iluminación azul-LED. Las ventajas de este enfoque son que es seguro, efectivo, económico y permite al investigador medir múltiples muestras simultáneamente.

Estimación del rendimiento de compuestos en la placa TLC mediante la técnica de iluminación Blue-LED

Describimos el uso de cromatografía en capa fina, ensayo de bioautografía directa y cromatografía líquida-espectrometría de masas para identificar productos naturales microbianos que muestran antagonismo contra patógenos fúngicos utilizando el patógeno Sclerotinia sclerotiorum y aislados bioplaguicidas de Bacillus como sistema modelo.

Identificación guiada por bioensayos de productos naturales para el biocontrol mediante cromatografía en capa fina-Bioautografía directa

Este estudio desarrolló una cromatografía líquida de alta potencia junto con el método de espectrometría de masas triple cuadrupolar (HPLC-QQQ-MS) para identificar y cuantificar alcaloides tropanos (hiosciamina, anisodamina, escopolamina) en Anisodus tanguticus. El método resultó rápido, preciso y fiable para el análisis de alto rendimiento de plantas medicinales.

Un método eficiente y rápido HPLC-QQQ-MS para la cuantificación de alcaloides tropanos en plantas medicinales

Tegumento de los mamíferos contiene lípidos extraíbles con disolventes que pueden proporcionar composiciones química característica de las especies individuales. Este trabajo presenta un método de rutina para separar grandes clases de lípidos aislados de tejidos tegumentarios utilizando cromatografía en capa fina y la determinación del perfil triacilglicérido por láser de desorción / ionización por espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz.

Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas

Se describen dos métodos para asignar las señales de resonancia magnética nuclear de α y ε-dimetilamina de una lisina N-terminal reductivamente metilada con 13C. Un método utiliza la selectividad inducida por el pH de la reacción de metilación reductora, y el otro utiliza la aminopeptidasa para eliminar selectivamente la lisina N-terminal.

Métodos para identificar las resonancias de RMN de la amina 13C-dimetilN-terminal en proteínas metiladas reductivamente

Este video presenta un protocolo para el análisis spectrometrical masa de compuestos volátiles y sensibles de oxidación utilizando ionización por impacto de electrones. La técnica presentada es especialmente de interés para los químicos inorgánicos, trabajando con organilos de metal, silanos, o fosfanos que tienen que ser manejados usando condiciones inertes, tales como la técnica de Schlenk.

Análisis de compuestos volátiles y sensibles oxidación usando un sistema de entrada de frío y de Impacto electrónico Espectrometría de Masas

Este protocolo describe las técnicas específicas utilizadas para la caracterización estructural de las secuencias reductoras de glicosil extremo (RE) e interno de los heteroxilanos mediante el marcaje del RE con 2 aminobenzamida antes de la hidrólisis enzimática (endoxilanasa) y luego el análisis de los oligosacáridos resultantes mediante espectrometría de masas (MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

Un método de combinación de cromatografía de gas integral de dos dimensiones con detección de quimioluminiscencia de nitrógeno ha sido desarrollado y aplicado a análisis en línea de los compuestos que contienen nitrógeno en una matriz compleja de hidrocarburos.

Análisis on-line de compuestos que contienen nitrógeno en matrices complejas de hidrocarburos

Aprende a identificar metabolitos antimicrobianos en plantas mediante cromatografía en capa fina y bioautografía de contacto. Este método permite detectar compuestos fenólicos del trébol rojo con actividad antibacteriana contra bacterias anaerobias del rumen bovino.

Cromatográfico en capa fina (TLC) Separaciones y bioensayos de extractos vegetales para identificar compuestos antimicrobianos

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