Name: Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de Drosophila Los tejidos para análisis de expresión génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Aprende el aislamiento de núcleos etiquetados de tejidos de Drosophila mediante afinidad para análisis de expresión génica. Este método permite estudiar perfiles de ARN en tipos celulares específicos.

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Damos las gracias a Janice Fischer para proporcionar el plásmido UAS-EGFP :: Msp-300 KASH. El anticuerpo mAB24B10 se obtuvo del Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Biología. El stock de repo-GAL4 (BL7415) se obtuvo del Stock Center Bloomington en Indiana University. El apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer Institucional Investigación Grant (IRG # 58-006-53) al Centro de la Universidad de Purdue para la Investigación del Cáncer se agradece. Jingqun Ma se apoya en una Investigación Agrícola de Purdue ayudantía en la Agricultura y la Alimentación de la Universidad de Purdue.

1. Generación y caracterización de EGFP :: KASH de Drosophila <ol><li> Controlador Cruz Gal4 vuela a UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vuela. Alternativamente, moscas recombinantes que llevan tanto el conductor de Gal4 y el transgén UAS-EGFP :: MSP-300 KASH se pueden generar usando técnicas genéticas estándar. Este segundo enfoque es ventajoso si se requieren un gran número de progenie. </li><li> Caracterizar la expresión del marcador EGFP :: KASH usando técnicas de microscopía estándar. Nota: EGFP expresión se puede observar mediante técnicas de microscopía estándar en los tejidos de Drosophila disecadas, fijas o en larvas de conjunto, y no requiere el uso de un anticuerpo. <ol><li> Determinar el patrón de expresión de la EGFP :: KASH marcador en todo el organismo bajo un microscopio de fluorescencia de disección (véase Materiales PDF). Nota: Muchos conductores Gal4, incluido el conductor repo-GAL4 se muestra en la Figura 1, Anexo Npatrones onspecific de expresión en otros tejidos larvarios, como las glándulas salivales (ver resultados). </li><li> Analizar el patrón de expresión de EGFP :: KASH en el tejido diseccionado de interés utilizando microscopía confocal. <ol><li> Fijar el tejido de interés el uso de formaldehído a una concentración final de 4%, y ADN de manchas usando DAPI a una concentración final de 0,1 mg / ml para visualizar la localización de la EGFP :: KASH etiqueta con respecto a ADN. </li><li> Adquirir imágenes usando ya sea un objetivo de 40X / 1,30 aceite de inmersión o un objetivo de 20x / 0,75 de inmersión en aceite, dependiendo del tamaño del tejido de interés. Las siguientes condiciones de excitación / emisión pueden ser utilizados para la adquisición de imágenes: 408 nm/425-475 nm (DAPI); 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Aislar Núcleos de Drosophila larvas tejidos <ol><li> Prepare el equipo para la disección de tejidos de las larvas y el posterior aislamiento de núcleos. Tenga en cuenta quedechorionated embriones enteros también podrían ser utilizados como material de partida, si se desea. Se recomienda el uso de tejidos de larvas parcialmente disecados en lugar de larvas todo si el tipo de célula de interés está presente en un tejido específico tal como el disco imaginal. Esto reduce la unión no específica, y también elimina los problemas que pueden ser causados ​​por la expresión de algunos controladores de Gal4 en células no diana. <ol><li> Prepare dos pares de pinzas cortantes (ver Materiales PDF), una placa de vidrio 9-así siliconado (ver Materiales PDF), y PBT (PBS 1x, pH 7,4; 0,1% de Tween-20). </li><li> Prebind la GFP de anticuerpos a las perlas magnéticas. Este paso se debe iniciar antes de comenzar la disección. Añadir 10 l de las perlas magnéticas (Invitrogen, ver Materiales PDF) y 2 g de GFP de anticuerpos (Roche, ver Materiales PDF) a 400 l de tampón de lavado (PBS 1x, pH 7,4; 2,5 mM de MgCl 2) en un tubo de 1,5 ml . La cantidad de perlas y anticuerpo utilizado se puede optimizar si es necesario sobre la base de la cantidad de diana en el Samplo y la afinidad de unión del anticuerpo a las perlas. </li><li> Incubar las perlas y el anticuerpo con rotación durante al menos 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Colocar el tubo de 1,5 ml que contiene las perlas y el anticuerpo en la gradilla magnética (ver Materiales PDF) y permiten que las perlas se unan a la magnética durante aproximadamente 1-2 minutos. Eliminar el sobrenadante que contiene el anticuerpo no unido y tampón de lavado utilizando una pipeta de 1 ml. Las cuentas se mantendrán atados a la pared del tubo de 1,5 ml en el lado adyacente al imán. </li><li> Enjuague las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lavado cada vez que se describe en la sección 2.1.4. Retire el tubo de 1,5 ml de la rejilla magnética y se invierte brevemente para mezclar los granos y tampón de lavado en cada paso de lavado. </li><li> Guarde las perlas de anticuerpo unido en tampón de lavado hasta que esté listo para continuar con el paso 2.7. Las perlas no se debe permitir que se seque en cualquier etapa del protocolo. </li></ol></li><li> Diseccionar los tejidos larvarios en la valoración PBT y transferir los tejidos disecados aun pocillo de la placa de 9 hoyos. Por lo general, la disección del lóbulo óptico y el ojo disco imaginal de 100 larvas de tercer instar proporciona material suficiente para el análisis de la expresión génica aguas abajo después del aislamiento de núcleos. </li><li> Enjuague el tejido aislado en tampón de extracción nuclear (10 mM de HEPES-KOH, pH 7,5; 2,5 mM de MgCl 2; KCl 10 mM) en un tubo de 1,5 ml. Transferir los tejidos aislados de larvas a un 1 ml de homogeneizador Dounce (ver Materiales PDF) en hielo que contiene 1 ml de tampón de extracción nuclear fresco. Incubar en hielo durante 5 min. No es necesario añadir inhibidores de la proteasa si es ARN que ser extraído después del aislamiento núcleos. </li><li> Interrumpir el tejido por 20 golpes con la mano del mortero suelto y luego incubar la muestra en hielo durante 10 min para permitir que las células se hinchen. Extracto de los núcleos de las células usando 15 golpes con la mano del mortero apretado. El número de golpes con las manos de mortero flojo y apretado debe ser optimizado para diferentes tejidos y tipos de células; exceso de homogeneización puede resultar ennúcleos esquilada, mientras homogeneización insuficiente no extraerá todos los núcleos de los tejidos. </li><li> Filtrar el homogenato, que contiene los núcleos y restos celulares, a través de un filtro de tamaño de poro de 40 micras (ver Materiales PDF) que ha sido prerinsed con tampón de homogeneización nuclear. Recoger el homogeneizado filtrado en un tubo nuevo. </li><li> Recoger muestras de pre-aislamiento para el análisis posterior para determinar el rendimiento núcleos, la integridad de los núcleos, y para determinar los niveles de transcripción de genes diana anteriores a los núcleos de aislamiento. <ol><li> Transferencia de 50 l de la homogeneizado filtrado a un tubo de 1,5 ml fresco con una pipeta. Esta es la muestra de pre-aislamiento. Añadir 500 l de reactivo Trizol (ver PDF Materiales, PRECAUCIÓN), invertir para mezclar y almacenar a -20 ° C para el aislamiento de ARN posterior (paso 3.1). </li><li> Transferencia de 20 l de la homogeneizado filtrado a un tubo nuevo 1,5 ml. <ol><li> Añadir DAPI a una concentración final de 0,1 g / ml, y IncUbate muestra en hielo durante 10 min. </li><li> Traslado núcleos teñidos con DAPI a un cubreobjetos recubiertos de poli-lisina, y colocar en un portaobjetos de microscopio. Sellar el cubreobjetos utilizando el esmalte de uñas transparente. </li><li> Compruebe la integridad núcleos, y la presencia de núcleos de GFP-etiquetados de interés utilizando microscopio de fluorescencia. Nota: No es necesario fijar los núcleos, o para teñir de GFP si estas diapositivas se analizan razonablemente rápido después de la preparación (a menos de 24 horas). </li></ol></li><li> Transferencia de 10 l de la homogeneizado filtrado a un tubo nuevo 1,5 ml y añadir 90 l de tampón de lavado (PBS 1x, pH 7,4; 2,5 mM de MgCl 2). Añadir DAPI a una concentración final de 0,1 g / ml, y se incuba en hielo durante 10 min. Determinar el rendimiento núcleos en la muestra pre-aislamiento usando un hemocitómetro para contar los núcleos con DAPI positiva utilizando epifluorescencia bajo un objetivo de aire 10 veces. </li></ol></li><li> Coloque el tubo de 1,5 ml que contiene las perlas de anticuerpo unido (preparadas en la sección 2.1.6) en un bastidor magnético,y permitir que las perlas magnéticas se unan al imán durante al menos 2 minutos como se describe en la sección 2.1.4. Retirar el tampón de lavado de las perlas de anticuerpo unido utilizando una pipeta de 1 ml, y añadir el homogeneizado filtrado desde el paso 2.5 al tubo de 1.5 ml con una pipeta de 1 ml. </li><li> Invertir suavemente el tubo varias veces para mezclar, y se incuba a 4 ° C durante 30 min con el extremo de extremo a agitación. Evitar burbujas en el tubo, si es posible ya que éstos pueden resultar en la formación de grumos de los núcleos. </li><li> Coloque el tubo de 1,5 ml que contiene las perlas de anticuerpo unido y homogeneizado en un estante magnético, y permitir que las perlas magnéticas se unan al imán durante al menos 2 minutos como se describe en la sección 2.1.4. Retire el homogeneizado que contiene la fracción de núcleos no unido usando una pipeta de 1 ml. </li><li> Lavar la muestra 3x con 1 ml de tampón de lavado en cada ocasión. Retire el tubo de 1,5 ml que contiene los granos, los núcleos unidos y tampón de lavado del bastidor e invierta para mezclar varias veces, y luego colocar el tubo en el soporte magnético como se describeen el paso 2.9 y eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta de 1 ml. </li><li> Añadir 150 l de tampón de lavado a las perlas, que deben ser enlazados a los núcleos blanco. Esta es la muestra post-aislamiento. Preparar las muestras para el análisis de microscopía y posterior extracción de RNA. <ol><li> Transferencia de 20 l de la muestra después de la aislamiento a un tubo de 1,5 ml fresco y tinción con DAPI y analizar como se describe en el apartado 2.6.2. Contar el GFP + / DAPI + y + GFP-/DAPI núcleos capturados por perlas magnéticas para determinar la pureza de la GFP enriquecido + núcleos en la muestra de post-aislamiento. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo Trizol al resto de la muestra después de la aislamiento, invierta para mezclar y almacenar a -20 ° C para el aislamiento de ARN posterior (paso 3.1). Nota: Las muestras en Trizol se pueden almacenar durante varias semanas si es necesario a -20 º C. No es necesario para eluir los núcleos de las perlas magnéticas antes de la extracción de ARN usando reactivo Trizol, pues dee las perlas no interfieran con el aislamiento de ARN posterior. </li></ol></li></ol> 3. Determinar niveles de transcripción en núcleos aislados de larvas tejidos <ol><li> Aislar el ARN de las muestras de pre-y post-de aislamiento de aislamiento preparados en las secciones 2.6.1 y 2.11.2 utilizando el protocolo estándar descrito para la extracción de ARN a base de Trizol (ver Materiales PDF) con las siguientes modificaciones: <ol><li> Después de la precipitación del sedimento de RNA, añadir 19,2 l de agua libre de RNasa y 0,8 l de reactivo RNASecure (ver Materiales PDF) al sedimento y se incuba a 60 ° C durante 20 minutos para inactivar RNAsas. </li></ol></li><li> Determinar la concentración de ARN con un colorante fluorescente de unión a ARN tales como el kit de ensayo de ARN Qubit (ver Materiales PDF) usando el fluorómetro 2,0 QubitR siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Sintetizar cDNA utilizando una transcriptasa inversa tal como la amplificación de la EpiScript kit de transcriptasa inversa y cebadores oligodT siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Típicamente, 50 a 100 ng de ARN genera suficiente ADNc para llevar a cabo los análisis de la expresión de múltiples genes. Cantidades equivalentes de pre-ARN aislamiento y de post-aislamiento se deben utilizar para generar ADNc. </li><li> Añadir 180 l de agua libre de nucleasa a la muestra de cDNA 20 l para diluir este antes de la PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) el análisis de 10 veces. Esta dilución es un paso importante, ya que las muestras de cDNA sin diluir pueden inhibir la qPCR. </li><li> Preparar una mezcla maestra de qPCR con polimerasa y dNTPs, 4 pmoles de cada uno de adelante y cebador inverso, compuesto con agua estéril para que el volumen final de reacción de 20 l. <ol><li> Diseñar cebadores de qPCR a sus genes diana que se espera que se exprese en el tipo celular de interés, y en la etapa de desarrollo en la que se recoge el tejido. Diseño de cebadores abarcar un intrón, si es posible, de manera que genómico yproductos de PCR de ADNc se pueden distinguir. Nota: Si no se conoce el perfil de expresión de genes del tipo de célula diana, cebadores contra eGFP, que debe ser expresada específicamente en la población de núcleos marcados, se pueden usar para optimizar el protocolo para un tipo de célula particular y el tejido (Tabla 1). </li></ol></li><li> Determinar los niveles de transcripción relativos de cada gen de interés en las muestras de pre-y post-de aislamiento de aislamiento por comparación con una serie de dilución de ADNc preparada a partir de todo el tejido. Los niveles de transcripción de los genes diana deberían normalizarse a un gen de referencia, como RPL32 (o preferiblemente varios genes de referencia). </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se puede utilizar para aislar o enriquecer altamente específicamente etiquetados núcleos de poblaciones de células mixtas en embriones de Drosophila o tejidos de larvas. Usando este protocolo, los núcleos se pueden aislar a partir de tejidos disecados en aproximadamente 1 hora. La pureza y el rendimiento de los núcleos aislados deben determinarse experimentalmente para cada tipo de célula. Puede ser difícil de cuantificar los núcleos de talón unida en la etapa de post-aislamiento del protocolo us...

Tejidos de Drosophila tales como el sistema nervioso central contienen una mezcla compleja de tipos de células. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, es primero necesario aislar una población homogénea de células específicas en cantidades suficientes para permitir que las aplicaciones posteriores. Métodos para aislar células de tejidos intactos incluyen microdisección por láser, y de células activadas por fluorescencia (FACS) de células enteras. Mientras FACS se ha utilizado para aislar las células y los núcleos de embriones de Drosophila y de Caenorhabditis elegans para la expresión génica y la cromatina de perfiles de 1-3, FACS y microdisección por láser puede ser difícil de realizar con éxito en los tejidos que contienen tipos de células altamente mezclados o que las células con contener morfología irregular, tales como neuronas. Para superar esta dificultad, los núcleos en lugar de las células se pueden aislar a partir de tipos de células específicos y se utilizan para la posterior generaciónde perfiles de expresión de correo. Es importante destacar que el análisis de la expresión de mRNA microarrays basado en el uso de muestras de ARN nucleares muestra resultados generalmente comparables con la realizada utilizando ARN total 4, 5. Por otra parte, el análisis de la expresión génica usando ARN nuclear ha sido utilizado con éxito para estudiar la expresión génica en varios organismos, incluyendo C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, y los seres humanos 4, 5 2, 3. Varios enfoques han sido recientemente descrita para el aislamiento de poblaciones específicas de núcleos marcados de tejidos de Drosophila que son adecuados para el análisis de la expresión génica y / o la inmunoprecipitación de la cromatina. El aislamiento lote de cromatina específica de tejido para el método de inmunoprecipitación (BITS-CHIP) utiliza FACS para aislar los núcleos fijos sobre la base de la expresión específica de tipo celular de GFP-nuclear localizada 2. Este enfoque ha sido doccessfully utilizado para analizar la distribución de las modificaciones de histonas y los factores de transcripción de la cromatina utilizando inmunoprecipitación de núcleos aislados a partir del mesodermo de Drosophila embriones 2. Sin embargo, los enfoques basados ​​en FACS pueden ser menos adecuado para el aislamiento de núcleos marcados que constituyen sólo una pequeña proporción de una población mixta debido al aumento del tiempo de tipo necesario para obtener números adecuados para aplicaciones posteriores. Para superar estas limitaciones, varios grupos han utilizado técnicas de aislamiento basados ​​en afinidad para purificar los núcleos que están etiquetados con un epítopo específico de un tipo de célula particular. El aislamiento de los núcleos marcados en tipos de células específicos de método (INTACTO) desarrollados para su uso en Arabidopsis thaliana 6, 7 ha sido recientemente adaptado para su uso en Drosophila 8. En este método, una proteína de fusión envoltura nuclear que es un sustrato para la biotinilación en vivo es coexpressed con la Escherichia coli biotina ligasa BirA en tipos celulares específicos. Núcleos marcados con biotina pueden ser posteriormente purificados a partir de poblaciones mixtas que utilizan el aislamiento de afinidad basada-estreptavidina. El uso de este enfoque, los núcleos fueron etiquetados con éxito y aislados del mesodermo de embriones de Drosophila en la que una proteína de fusión envoltura nuclear se expresó bajo el control de un promotor-mesodermo específica 8. Los autores también generaron proteínas de fusión de la envoltura nuclear que se pueden expresar en cualquier tipo de célula bajo el control de la secuencia reguladora de Gal4, UAS 9. Este enfoque es capaz de subconjuntos de núcleos marcados de poblaciones mixtas aislar rápidamente, pero requiere tres construcciones transgénicas independientes y por lo tanto puede ser inadecuado para aplicaciones particulares genéticos. Recientemente, un enfoque ha sido descrito en el que dom (S AD1 y de la ONU C-84), las proteínas que contienen el dominio que se localizan en la membrana interna de la envoltura nuclear fueron etiquetados conproteínas fluorescentes y expresado bajo el control del sistema de Gal4/UAS 10. Los núcleos se aislaron en presencia de detergente no iónico para eliminar la membrana externa de la envoltura nuclear, y se purificó por afinidad usando perlas magnéticas acopladas a anticuerpos anti-GFP. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para aislar las poblaciones pequeñas de núcleos marcados de subtipos neuronales específicos en el cerebro adulto de Drosophila 10. Aquí, se describe un protocolo para el aislamiento de núcleos marcados de una población mixta de células de tejido de larvas de Drosophila. Este método fue desarrollado de forma independiente, pero es similar al enfoque descrito por Henry et al. 10 En primer lugar, los núcleos fueron marcadas con una etiqueta fluorescente que se expresa sólo en tipos de células específicos en Drosophila melanogaster para facilitar el posterior aislamiento de los núcleos etiquetados de poblaciones mixtas utilizando un enfoque basado en la afinidad. Para etiquetar núcleos,Se utilizó el dominio KASH (K larsicht / A nc-1 / S ino h omology). El dominio KASH es un dominio transmembrana que se localiza en la membrana externa de la envoltura nuclear, en parte a través de interacciones con proteínas que contienen el dominio dom dentro del espacio perinuclear 11. El dominio KASH C-terminal de las proteínas tales como Drosophila MSP-300 y Klarsicht ancla estas proteínas a la membrana nuclear externa, mientras que sus dominios N-terminal de interactuar con las proteínas del citoesqueleto, tales como actina o los microtúbulos en el citoplasma 12-14. Las construcciones se generaron en el que el dominio KASH de Drosophila MSP-300 se fusiona al C-terminal de EGFP, bajo el control de la secuencia reguladora de Gal4, UAS en el vector pUAST-attB 15, 16. Uso de integración específica de sitio phiC31, se generaron moscas transgénicas en las que los UAS-EGFP :: MSP-300 KASH transgén se inserta en los loci en el cromosoma attP23L 17. La UAS-EGFP :: MSP-300 KASH moscas pueden ser cruzado con moscas que expresan el controlador de Gal4 en un tipo de célula particular, que resulta en la expresión dirigida de EGFP en la membrana nuclear externa en el tipo celular de interés. Núcleos marcado puede entonces purificarse a partir de poblaciones de células mixtas usando anticuerpos frente a GFP acoplados a perlas magnéticas. En este enfoque, no se requiere el uso de detergente no iónico porque la etiqueta EGFP se localiza en el lado citoplásmico de la membrana nuclear externa, y por lo tanto es accesible a los anticuerpos. El protocolo descrito a continuación se puede utilizar para aislar / enriquecer núcleos EGFP marcado de tipos de células específicas en los tejidos de las larvas de Drosophila, para cuantificar la pureza y el rendimiento de núcleos aislados, y para extraer ARN nuclear adecuado para la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QRT -PCR), análisis de la expresión génica. El aislamiento y la purificación por afinidad de los núcleos (excluyendo tissue disección) se puede realizar en menos de una hora. Los resultados se presentan mostrando que los núcleos gliales se pueden aislar con éxito desde el lóbulo óptico de las larvas y el ojo disco imaginal, y se utilizaron para el análisis de la expresión génica posterior. Se prevé que este enfoque será útil para el aislamiento / enriquecimiento de núcleos marcados a partir de tejidos de embriones y larvas en el que las células diana constituyen menos del 5% de la población general. Todas las poblaciones de Drosophila y plásmidos generados en este estudio están disponibles a partir de los autores que lo soliciten.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-chaoptina (monoclonal de ratón)</td><td>Estudios del desarrollo Banco de hibridomas</td><td>mAB24B10</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP (monoclonal de ratón)</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>Este anticuerpo específico se recomienda para este protocolo. Sin embargo, también se podrían utilizar anticuerpos alternativos.</td></tr><tr><td>2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix con ROX</td><td>MidSci</td><td>BEQPCR-R</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, sal de diclorhidrato)</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de onzas (1 ml)</td><td>VWR</td><td>62400-595</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas, 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G para inmunoprecipitación</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Esta marca específica de perlas magnéticas está recomendada para este protocolo.</td></tr><tr><td>EpiScript Transcriptasa Inversa</td><td>Epicentre</td><td>ERT12910K</td><td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td></tr><tr><td>Filtros de células Falcon, 40 &mu; m tamaño de poro</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Se pueden utilizar tamaños de poro alternativos, dependiendo del tamaño de los núcleos de las células objetivo.</td></tr><tr><td>Soporte magnético (8 tubos de 1,5 ml)</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini rotador de tubos</td><td>Genemate</td><td>H-6700</td><td></td></tr><tr><td>Qubit kit de inicio</td><td>Life Technologies</td><td>Q32871</td><td>Se podrían utilizar métodos similares basados en fluorescencia para cuantificar el rendimiento de ARN. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td></tr><tr><td>RNAsecure (Ambion)</td><td>Life Technologies</td><td>AM7010</td><td>El uso de este reactivo para inactivar ARNasas es opcional.</td></tr><tr><td>Máquina RT-PCR Termociclador</td><td>BioRad</td><td>CFX Connect Termociclador</td><td></td></tr><tr><td>Placa de vidrio siliconada de 9 pocillos</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscopio Adaptador de fluorescencia (Royal Blue (440-460 nm) excitación + barrera amarilla</td><td>Nightsea</td><td></td><td>Este adaptador permite examinar la fluorescencia GFP utilizando un microscopio de disección típico (por ejemplo, Nikon)</td></tr><tr><td>Microscopio StereoZoom 83604 Set con oculares de campo amplio 10X y soporte de brazo universal</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Trizol</td> Life <td>Technologies 15596018</td><td></td><td>PRECAUCIÓN; Se pueden utilizar métodos alternativos de extracción de ARN. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento a base de afinidad de tagged núcleos de<em&gt; drosophila</em&gt; los tejidos para análisis de expresión génica

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Tejidos de embriones y larvas de Drosophila melanogaster a menudo contienen una mezcla altamente heterogénea de tipos de células, lo que puede complicar el análisis de la expresión génica en estos tejidos. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, puede ser necesario aislar los tipos de células específicas con alta pureza y con rendimientos suficientes para aplicaciones posteriores tales como el perfil transcripcional y de inmunoprecipitación de la cromatina. Sin embargo, la morfología celular irregular en tejidos tales como el sistema nervioso central, junto con la población rara de tipos específicos de células en estos tejidos, puede plantear problemas para los métodos tradicionales de aislamiento de células, tales como la microdisección láser y de células activadas por fluorescencia (FACS) . Aquí, un enfoque alternativo para la caracterización de los perfiles de expresión de genes específicos de células usando el aislamiento basado en la afinidad de los núcleos marcados, en lugar de células completas, se describe. Núcleos de la c específicaTipo de interés ell están etiquetados genéticamente con un sobre-localizada etiqueta EGFP nuclear utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS. Estos núcleos EGFP-etiquetados se pueden aislar utilizando anticuerpos contra la GFP que están acoplados a perlas magnéticas. El enfoque descrito en este protocolo permite el aislamiento consistente de los núcleos de tipos de células específicas en el sistema nervioso central de Drosophila larvas en alta pureza y en niveles suficientes para el análisis de expresión, incluso cuando estos tipos de células comprenden menos del 2% de la población total de células en el tejido. Este enfoque se puede utilizar para aislar los núcleos a partir de una amplia variedad de Drosophila embrionario y tipos de células de larvas utilizando controladores específicos Gal4, y puede ser útil para el aislamiento de núcleos de tipos de células que no son adecuados para FACS o microdisección por láser.

El conductor repo-GAL4 (Bloomington código RS 7415) se expresa específicamente en las células gliales en el sistema nervioso de Drosophila en múltiples etapas de desarrollo 18. Las moscas se generaron que expresa de manera estable UAS-EGFP :: MSP-300 KASH bajo el control del controlador de repo-GAL4 utilizando técnicas genéticas estándar. Para caracterizar el patrón de expresión de la EGFP :: KASH transgén en estas moscas, se examinó el patrón de expresión de GFP...

Tejidos de Drosophila a menudo contienen una mezcla heterogénea de tipos celulares. Para examinar la expresión génica en tipos de células específicas de un tejido particular, los núcleos pueden ser etiquetados genéticamente y aislados posteriormente utilizando un enfoque basado en la afinidad. Núcleos aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores tales como análisis de la expresión génica y la inmunoprecipitación de la cromatina.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

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Biología

Drosophila melanogaster testículos puede ser rápida y eficazmente aisladas de los machos adultos el uso de agujas de disección. Con la práctica, uno puede fácilmente aislado en uno o dos días una cantidad de testículos suficiente para el análisis de ADN o ARN mediante la secuenciación de alto rendimiento o los métodos moleculares más tradicionales de biología o de la proteína para los ensayos de anticuerpos o enzimas base.

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Aquí se describe un fluorescente de todo el...

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.

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Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Este protocolo tiene como objetivo visualizar agregados de heterocromatina en células de Politeno de Drosophila.

Tinción Inmunofluorescente Para La Visualización De Proteínas Asociadas A La Heterocromatina En Las Glándulas Salivales Drosophila

Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.

Aislamiento de núcleos de células progenitoras cardíacas de ratón para epigenoma y perfil de expresión génica a resolución de una sola célula

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

El protocolo describe el método de hibridación in situ de fluorescencia sensible a polimorfismos de un solo nucleótido (SNP-FISH) para distinguir las transcripciones de ARN ribosómico derivadas del locus de ADN ribosómico del cromosoma X o Y en Drosophila melanogaster.

Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster

Este protocolo describe los pasos necesarios para realizar la hibridación de hibridación fluorescente fluorescente in situ (HCR-FISH) en los lóbulos ópticos larvales de Drosophila melanogaster . Se detallan procedimientos para el diseño de la sonda, hibridación, amplificación y montaje de tejidos para facilitar la visualización del lóbulo óptico en desarrollo.

Reacción en cadena de hibridación FISH en el lóbulo óptico en desarrollo de Drosophila

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