Name: Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprende a analizar la síntesis global de RNA en células individuales bajo hipoxia mediante química click y microscopía de fluorescencia. Este método permite visualizar directamente la producción de RNA y estudiar respuestas celulares a bajo oxígeno.

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JB es un miembro clínico CRUK, AS es un estudiante de doctorado Wellcome Trust, el laboratorio de SR es financiado por una Beca de Investigación Superior CRUK (C99667/A12918). Este trabajo fue apoyado por dos premios Strategic Wellcome Trust (097945/B/11/Z y 095931/Z/11/Z).

1. Cultivos Celulares y Tratamiento <ol><li> Reúna los reactivos y equipos que figuran en la Tabla 1 para las células (U2OS osteosarcoma) la cultura humana. Preparar todos los reactivos y llevar a cabo todas las técnicas de cultivo de tejidos en la campana de flujo laminar de aire para asegurar la esterilidad </li><li> Preparar el medio de cultivo como sigue: Añadir 50 ml de FCS, 5 ml L-glutamina y 5 ml de penicilina / estreptomicina al DMEM para lograr concentraciones finales de 10% (FCS), 2 mM (L-glutamina), 50 U / ml ( la penicilina) y 50 U / ml (estreptomicina). Calentar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Preparar las células para el tratamiento de: <ol><li> Esterilizar varios cubreobjetos en etanol al 70%, dejar secar al aire y colocar uno en la parte inferior de seis 3,5 cm placas. </li><li> Sumergir el cubreobjetos en 2 ml de DMEM completo se calentaron (37 ° C), presionando hacia abajo con los fórceps cubreobjetos para asegurarse de que permanecen adheridos a la parte inferior de los pozos. </li><li> Separe las células U2OS de su culto tejidoUre placa por lavado una vez con 3 ml de PBS, la aplicación de 4 ml se calentó 0,05% de tripsina-EDTA (1%) e incubando a 37 º C durante 7 min. </li><li> Resuspender las células en 6 ml calentado DMEM completo para inactivar la tripsina-EDTA y contar utilizando un hemocitómetro. </li><li> Plate 2 x 10 5 células a cada uno de los 3,5 cm platos preparados en el punto 1.3.1. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución celular, incluso. Permitir que las células se adhieran durante la noche antes del tratamiento. </li></ol></li><li> Tratar las células mediante la colocación de cuatro placas de 3,5 cm en la estación de trabajo hipoxia y dejar los otros dos 3,5 cm placas en la incubadora a 37 ° C en condiciones normales de oxígeno. Esté listo para comenzar el ensayo de ARN etiquetado en condiciones tratadas (en la cámara de hipoxia para las células tratadas hipoxia) 1 hora antes de que termine el tratamiento de hipoxia. </li><li> Exponer las células a la hipoxia durante 1 h 15 min, 1 h 30 min, 2 h, y 24 h. Estos momentos son flexibles y determinada por el usuario. </li><li> Utilice un normoxic 3,5 cm placa como control positivo y un 3,5 cm placa normóxico tratados con actinomicina D (/ ml concentración final de 10 mg) durante 4 horas como control negativo. Actinomicina D es un inhibidor de la síntesis de ARN mundial. </li></ol> Precauciones: Hoechst 33342 es un mutágeno conocido. DMSO es conocido para facilitar la entrada de moléculas orgánicas en los tejidos. NaOH es corrosivo. HCl es corrosivo. El paraformaldehido es altamente tóxico para los animales y puede causar la muerte en los seres humanos. Triton X-100 puede causar irritación de la piel por contacto directo. Actinomicina D es tóxico cuando está en contacto con la piel o por ingestión. Tome las debidas precauciones al manejar todos los productos químicos peligrosos. 2. Haga clic-iT Ensayo <ol><li> Reúna los siguientes reactivos que se requieren, además del kit de ensayo de Click-iT: tampón fosfato salino (PBS) de pH 7.2 a 7.6, 3.7% de paraformaldehído (PFA) en PBS, 1% Tritón X-100 En PBS, agua desionizada (dH2O), dimetil sulfóxido (DMSO), 10 M de hidróxido de sodio (NaOH), y ácido clorhídrico al 37% (HCl); Tiras indicadoras de pH - Opcional. </li><li> Prepare una solución fresca stock PFA antes de realizar la reacción de Click-iT de la siguiente manera: <ol><li> Poner 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O y 10 l de10 M NaOH en un tubo Falcon de 50 ml. Hervir 300-400 ml de H2O en un gran vaso de precipitados en el microondas para hacer un baño de agua y soportar esto en una campana de humos. </li><li> Coloque el Falcon de 50 ml en el baño de agua y agitar suavemente durante 10 minutos, liberando periódicamente la tapa hasta que el PFA se ha disuelto. </li><li> La jeringa la solución de PFA a través de un filtro de 0,2 micras en otro tubo Falcon de 50 ml, resultando en una solución al 37%. </li><li> Diluir esta 10x añadiendo PBS y llevar el pH a 6,8 mediante la adición de aproximadamente 12 l de HCl concentrado. Opción: Confirmar el pH correcto con las tiras indicadoras en la campana de humos. </li><li> Utilizar inmediatamente o almacenar overnight a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar las soluciones madre de el kit de imagen de ARN de la siguiente manera: <ol><li> Añadir 373 l dH 2 O para el componente A que resulta en una solución madre de 100 mM de la UE. Almacenar a -20 ° C durante un máximo de un mes. </li><li> Añadir 85 l de DMSO al componente B (Alexa Fluor 594) y mezclar mediante pipeteo o vórtex. Guarde tanto a -20 ° C durante un máximo de un año. </li><li> Añadir 2 ml de dH2O para el componente E para crear una solución de 10 veces del aditivo tampón de reacción kit de imagen de ARN. Almacenar a -20 ° C durante un máximo de un año, cuando deseche la solución se torna de color marrón. </li></ol></li><li> Etiquetado de las células con la UE: Prepare una solución de trabajo de 2X de la UE de la madre 100 mM preparada en la etapa 2.3 en medio completo precalentado (37 ° C) Realizar el resto de este paso y paso de 2.5 en la cámara de hipoxia de las células tratadas con la hipoxia. . Diluir a 1X mediante la adición de un volumen igual de esta solución de trabajo 2X a la CONT mediosaining células. Incubar durante 1 h bajo tratamiento de condiciones de cultivo celular. </li><li> La fijación de la célula: Lavar cada pocillo una vez con PBS y añadir 1 ml de la PFA de stock 3,7% preparados en la etapa 2.2 en condiciones de tratamiento. Incubar durante 15 min bajo condiciones de tratamiento. Las muestras tratadas con la hipoxia pueden ser removidos de la cámara de la hipoxia en este punto. Quite el fijador y lavar cada pocillo una vez con PBS (Tenga cuidado de eliminar los residuos de forma responsable PFA). Lleve a cabo los siguientes pasos a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilización: Retire la solución de lavado y añadir 1 ml de 1% de Triton X-100 en PBS a cada pocillo. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. Retire la permeabilización de amortiguación y lavarla una vez con PBS. </li><li> Detección de ARN marcado: <ol><li> Preparar una solución de trabajo 1X fresca de aditivo tampón de reacción kit de imagen de ARN mediante la dilución de la solución 10 veces (preparado en el paso 2.3) 01:10 en dH 2 O. </li><li> Prepare el kit de imagen RNAcóctel de reacción de acuerdo con la Tabla 2 para su uso inmediatamente después de su preparación. </li><li> Quitar la solución de lavado y añadir 500 l de cóctel de formación de imágenes ARN kit de reacción para cada muestra. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. </li><li> Retire la imagen RNA cóctel reacción kit y lavar una vez con 1 ml de tampón de lavado de imagen de ARN reacción kit (componente F), a continuación, eliminar el tampón de enjuague reacción RNA kit de imagen. </li></ol></li><li> Reacción múltiplex Opcional: Realice etiquetado anticuerpo adicional de las muestras en este punto de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> ADN de tinción: Lávese las muestras con PBS y luego eliminar la solución de lavado. Diluir el Hoechst 33342 (componente G) 1:1000 en PBS. Añadir 1 ml de Hoechst 33342 diluido a cada pocillo y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Eliminar la solución de Hoechst 33342 y se lavan las células dos veces con PBS. Retire la soluci lavadon y proceder a la microscopía de luz. </li></ol> 3. Microscopía de Luz <ol><li> Mount Cubreobjetos: <ol><li> Coloque 10 l de medio de montaje en el centro de un portaobjetos de microscopio estándar. </li><li> Coloque el cubreobjetos con la célula hacia abajo en el centro de la platina de microscopio para cubrir la parte alícuota de medio de montaje. Tenga cuidado de evitar la generación de burbujas en el medio de montaje, ya que ocultará la adquisición de imagen posterior. </li><li> Pegue el cubreobjetos al portaobjetos mediante la aplicación de barniz de uñas transparente a su perímetro. Deje que se seque durante 5 minutos a temperatura ambiente. Proteger de la luz. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C después de montaje. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes: Adquirir imágenes utilizando un microscopio de campo amplio capaz de detección de fluorescencia. Aproximado de fluorescencia / de excitación máximo de emisión para el colorante Alexa Fluor y Hoechst 33342 unido al ADN se muestran en la Tabla 3. </li><li> Perform Imaging utilizando una lente de inmersión en aceite 40X/1.30 NA y capturar imágenes con una cámara CCD enfriado. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Imágenes deconvoluir utilizando el software de procesamiento de imágenes (ver la tabla de Materiales) antes de importar al cliente OMERO. Normalizar la prestación de los ajustes para todas las imágenes en el mismo experimento en el software de microscopio de imagen de visualización y análisis mediante la aplicación de los ajustes de renderizado de células normoxic control para todas las demás condiciones. </li><li> Utilice la región de interés (ROI) en la herramienta de software de microscopio de imagen de visualización y análisis (véase la tabla de Materiales) para seleccionar los núcleos de cada imagen. Obtener intensidades medias para cada ROI y calcular el promedio y la desviación estándar para cada condición por la elección de la opción de análisis de intensidad, incluyendo un número de entre 30 a 50 células. </li><li> Construir diagramas de dispersión usando un software de gráficos de datos (véase el cuadro Materiales) por el trazado de todos los valores de intensidad media individual obtenida en el paso 4.2 to reflejar la variabilidad entre las células en cada condición. Alternativamente construir gráficos de barras para representar la intensidad media media más desviación estándar de ARN naciente. </li></ol>

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<li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1%2C+PHD2%2C+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li>
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</ol>

JRS es Fundador de Glencoe Software, Inc., una empresa comercial con sede en EE.UU. de código abierto que contribuye a OMERO.

Hemos descrito el uso de un kit de imagen de ARN para examinar los efectos de la hipoxia en la síntesis de ARN en células U2OS (osteosarcoma). Esta técnica es relativamente sencillo y proporciona datos acerca de la transcripción global a un nivel de células individuales. Hemos modificado el protocolo convencional para este kit para incorporar el etiquetado en una cámara de hipoxia. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe del uso de esta técnica para medir los cambios en la síntesis de ARN en la hipoxia. El kit de imagen RNA se utilizó es adecuado para la experimentación en la hipoxia, ya que no requiere de isótopos radiactivos y es técnicamente compatibles con las limitaciones de trabajar en una estación de trabajo de atmósfera controlada. Problemas comunes con esta técnica preocupación fijación y el etiquetado de la muestra eficiente. Es extremadamente importante que la PFA utiliza para fijar la muestra es fresca y las etapas de lavado que siguen la reacción &quot;clic&quot; se realizó como se describió para asegurar bajo la tinción de fondo de la muestra. Si background fluorescencia se convierte en un problema, se recomienda lavar una vez más con las imágenes de ARN 1 ml de tampón de lavado reacción kit después de la etapa 2.7.4. El kit de imagen ARN mencionado aquí representa un avance significativo en la tecnología de imágenes de ARN en términos de facilidad de uso y especificidad y la velocidad de reacción. Esta técnica está limitada principalmente por el tiempo que toma para etiquetar la muestra. El kit de imagen ARN requiere de un período de marcado 1 hr que impide el examen de los rápidos cambios en el ARN mundial que suele ocurrir dentro de este plazo. Es por esta razón nuestro punto primera vez que se limita a 1 h y 15 min. La técnica está asociado con algunas otras limitaciones que se relacionan en gran medida el agente reactivo, la compatibilidad con otros marcadores fluorescentes, por ejemplo, este kit de imagen de ARN no es compatible con tinción faloidina. Todos los enfoques existentes de estudio de la síntesis de ARN en las células se basan en la incorporación de nucleósidos modificados en laARN naciente y la detección de etiquetas incorporadas por diferentes medios. El enfoque innovador se basa en el uso de precursores de ARN marcadas radiactivamente seguido por la detección con autorradiografía. Este método dio lugar a un descubrimiento de las fases del ciclo celular y otros hallazgos importantes; sin embargo, tiene una gran cantidad de inconvenientes tales como la lentitud de los trabajos radiactividad, largos tiempos de exposición y las imágenes de baja resolución de autorradiografía 6. El siguiente avance en el campo explotado medio de inmunoquímica para eliminar la necesidad de radiactividad. ARN se marcó mediante la incorporación de BrU seguido de la detección inmunoquímica. Sin embargo, el anticuerpo unión eficiente requiere la desnaturalización de ácido nucleico para mejorar el acceso a ADN o ARN que causó la pérdida de la morfología celular y daña los epítopos de muchas proteínas, la prevención de su aún más la detección con anticuerpos marcados con fluorescencia 13. La introducción de la tecnología &quot;click química &#39;simplifica la etapa de detección y tl procedimiento en comparación con autorradiografía e inmunoquímica. La tecnología se basa en azida-alquino reacción de cicloadición de Huisgen donde alquino terminal de 5-ethyniluridine se une con azida conjugado con el fluoróforo en presencia de Cu (I). La reacción es específica, rápida, no requiere ningún paso adicional, y es fácilmente compatible con la detección inmunoquímica de otros constituyentes celulares. Utilizando esta tecnología de formación de imágenes de ARN que mostraron que las células, en la misma población monocapa, tienen diferentes niveles de la síntesis de ARN en respuesta a la hipoxia. Hemos restringido nuestro experimento para examinar el efecto de la única producción de ARN; Sin embargo, es totalmente posible con este kit de imagen de ARN para realizar modificados, reacciones múltiplex adicionales que permiten un análisis más complejo de la producción de ARN. Por ejemplo, la tinción secundaria usando un anticuerpo específico para los marcadores de la transcripción activa tales como los niveles de fosforilados ARN polimerasa II o incluso componentes de la tramaquinaria ción para dar una indicación de la cantidad de este ARN recién producido que se convierte en proteína son posibles. Proteínas adicionales, tales como actina, una proteína que no debe cambiar significativamente con la hipoxia, podrían probarse como un control adicional. Además, diferentes tipos de células podrían ser probados, ya que es muy probable que diferentes células tienen diferentes tasas de síntesis de ARN e incluso respuestas diferentes a la hipoxia. El uso de este kit de imagen de ARN es bastante sencillo siempre que los pasos se realizaron como se describe. Los pasos críticos en el protocolo implican chapado celular, la fijación de células y la tinción y la adquisición de imágenes. Es importante a la placa las células a la densidad descrito para prevenir la sobre o debajo de confluencia en la experimentación que afectará de manera significativa el resultado. También es importante usar fijador fresco, lo que garantiza el mejor &quot;instantánea&quot; de la celda se toma y tener cuidado al lavado de las células después de la tinción de reducir la tasa de alcoholemiakground a un nivel que es aceptable para el análisis eficiente. Por último, el método de adquisición de la imagen es de vital importancia para lograr imágenes que son de una buena calidad suficiente para su posterior análisis. Le recomendamos que utilice el mejor microscopio de luz disponible para examinar muestras ópticamente como el microscopio usado en este protocolo que está disponible en la mayoría de los centros de investigación intensiva a nivel mundial.

La hipoxia (bajas tensiones de oxígeno) ocurre cuando se altera el normal abastecimiento de oxígeno a un tejido. Oxígeno ambiental es tanto un nutriente y una molécula de señalización, proporcionando señales importantes para muchos tipos de células. Los cambios en oxígeno del medio ambiente son detectadas por un grupo de dioxigenasas que controlan la actividad de una familia de factores de transcripción esencial conocido como los factores inducibles por hipoxia (HIF). Los HIF están compuestos de dos subunidades, α y β. Hay tres isoformas conocidas de HIF-α (1, 2, y 3) y múltiples variantes de empalme de HIF-1β. HIF-1β se expresa constitutivamente y no regulada por los niveles de oxígeno del medio ambiente 1. Los miembros de la familia HIF-α se regulan dinámicamente por una clase de prolil-hidroxilasas (doctores) y el factor de inhibición de HIF (FIH); ambos de los cuales requieren oxígeno como un co-factor para catalizar la hidroxilación de HIF-α 2,3. En normoxia los miembros de la familia HIF-α son hidroxilados y etiquetados para proteosomAl degradación por la E3-ligasa, de von Hippel Lindau (VHL). En la hipoxia los doctores y FIH son inactivos o tienen una actividad reducida. Las isoformas HIF-α se estabilizan, forman un heterodímero con HIF-1β, y efectuar la transcripción de genes que proporcionan la respuesta celular al entorno hipóxico (Figura 1A) 4. Las técnicas actuales para el análisis de ARN se centran en la cuantificación de los valores promediados a través de una población de células dada. Las células responden a un estímulo hipóxico mediante el inicio de la transcripción de un gran número de genes que les permiten adaptarse a su ambiente hostil 5. Sin embargo, la hipoxia menudo existe como un gradiente, y las células en un ambiente hipóxico no están sujetos a un estímulo hipóxico uniforme. Se describe una implementación de los kits de imagen RNA Click-iT en una estación de trabajo de oxígeno controlado para examinar la síntesis del ARN mundial a nivel de células individuales en la hipoxia. El kit de imagen utiliza un ARN de unanucleósido lkyne modificado-, 5-etinil uridina (UE) y la ligadura quimioselectiva para permitir la detección de la síntesis del ARN mundial temporal y espacialmente en las células y tejidos 6. Brevemente, las células se tratan con la hipoxia y se cultivaron en la presencia de la UE. A continuación se fijan y se permeabilizaron y la incorporación de la UE en el ARN naciente se detecta mediante ligación quimioselectiva de la UE con un colorante que contiene azida. Un flujo de trabajo típico para esta reacción se muestra en la Figura 1B. Se utilizó el kit de imagen de ARN para examinar la síntesis de ARN en el nivel de células individuales que resultó de tratamiento con la hipoxia. El pequeño tamaño de la etiqueta alquino permite la incorporación eficiente de la nucleósido modificado en ARN específicamente. La ligadura quimioselectiva o &quot;clic&quot; reacción es altamente eficiente, rápida y específica 7-10. Todos los componentes de la reacción son bioinerte y la reacción no requiere de temperaturas extremas o disolventes. La reacción click niegael requisito para el marcado radiactivo convencional y permite la visualización directa de los resultados ya que la salida es la luz. Además, la molécula de detección puede penetrar fácilmente en muestras complejas que permiten para el análisis múltiplex incluyendo anticuerpos para la detección de proteínas de ARN-interactivo. Este ensayo de formación de imágenes de ARN es compatible con colorantes orgánicos incluyendo Alexa Fluor y de fluoresceína (FITC). Se midió el cambio en la síntesis de ARN después del tratamiento de las células usando una implementación del medio ambiente microscopía abierto para objetos remotos (OMERO). OMERO es un software de código abierto, disponible en <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . Este software microscopio de imagen de visualización y análisis permite el acceso a, y el uso de una amplia gama de datos biológicos, incluida la gestión de bases de datos heterogéneas, multidimensionales. La aplicación cliente permite la visualización y el análisis de datos de imágenes biológicas complejas 11 a distancia;lo usamos para cuantificar los cambios visuales en la síntesis global y única de ARN celular. Estos datos y los pasos necesarios para analizar nuestro experimento de formación de imágenes de ARN usando este microscopio imagen software de visualización y análisis se muestran a continuación. Nos fijamos en los cambios en la síntesis de ARN mundial después del tratamiento del osteosarcoma humano U2OS células (hipoxia), con capacidad para 24 hr. En todas las condiciones, se detectó la variación de célula a célula en el nivel de producción de ARN. Tiempos cortos de exposición a la hipoxia no dio lugar a cambios significativos en el nivel de ARN naciente en las células. Sin embargo, la exposición a 24 h de hipoxia resultó en un aumento significativo en la cantidad de ARN producido en las células. La mayoría de las respuestas celulares a la hipoxia se miden después de períodos prolongados de exposición, tales como 4 a 24 horas. Sin embargo, algunos mecanismos se ponen en marcha mucho antes, por ejemplo; La activación de NF-kB se produce dentro de 5-15 minutos de exposición a la hipoxia 12. La investigación de hipo más cortoPor lo tanto, los tiempos de exposición xia está garantizado y podría menoscabar las respuestas más complicados como el ciclo celular y la apoptosis.

<table><tbody><tr><td>Células primarias U2OS</td><td>Colección europea de cultivos celulares</td><td>92022711</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>DE17-603E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA (1%)</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hipoxia</td><td>Ruskinn</td><td>InVivo2 300</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo Click-iT</td><td>Invitrogen</td><td>C-10329/C10330</td><td></td></tr><tr><td>pFA</td><td>Sigma</td><td>76240</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>37% HCl</td><td>VWR</td><td>20252.335</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Medio de montaje</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina D</td><td>Sigma</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Deltavision Microscopio</td> central <td>Precisión aplicada</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>softWoRx</td><td>Precisión aplicada</td><td>N/A</td><td>Referido en texto como software de procesamiento de imágenes.</td></tr><tr><td>Cámara CCD CoolSnap HQ2</td><td>Fotometría</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Entorno de Microscopía Abierta para Objetos Remotos (OMERO)</td><td>OME</td><td>N/A</td><td>Referido en el texto como software de visualización y análisis de imágenes de microscopio.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v12.0</td><td>Systat Software Inc.</td><td>N/A</td><td>Se denomina en el texto software de gráficos de datos.</td></tr></tbody></table>

análisis de rna global síntesis en el nivel de células individuales siguiente hipoxia

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

La hipoxia o disminución de la disponibilidad de oxígeno está involucrado en muchos procesos fisiológicos y patológicos. A nivel molecular, las células inician un programa transcripcional particular, con el fin de montar una respuesta celular apropiada y coordinada. La célula posee varias enzimas sensor de oxígeno que requieren oxígeno molecular como cofactor para su actividad. Estos van desde prolil-hidroxilasas a desmetilasas histonas. La mayoría de los estudios de análisis de las respuestas celulares a la hipoxia se basan en poblaciones celulares y estudios medios, y, como tal, el análisis de células individuales de células hipóxicas se realiza rara vez. Aquí se describe un método de análisis de la síntesis del ARN mundial a nivel de célula única en la hipoxia mediante el uso de kits de imagen RNA Click-iT en una estación de trabajo de oxígeno controlado, seguido por análisis de microscopía y cuantificación. El uso de células cancerosas expuestas a hipoxia durante diferentes periodos de tiempo, el ARN se marca y se mide en cada célula. Este análisis permitela visualización de los cambios temporales y de célula a célula en la síntesis de ARN mundial siguientes estrés hipóxico.

Un esquema de la reacción kit de imagen de ARN se muestra en la Figura 1B. Utilizamos esta reacción para determinar cuantitativamente la síntesis de ARN total en células U2OS después del tratamiento con hipoxia tanto individuales (una sola célula) y mundial (con una población de las células). Las células fueron tratadas con la hipoxia y se cultivaron en la presencia de la UE. Ellos fueron fijadas y permeabilized y la incorporación de la UE se detectó mediante ligadura quimioselectiva de la UE con un colorante que contiene azida. Este &quot;clic&quot; reacción da como resultado una emisión de fluorescencia que puede ser detectado y cuantificado usando microscopía de luz de fluorescencia. Figura 2A muestra un resultado típico de este experimento. Células marcadas con fluorescencia se pseudocoloreada rojo y la imagen se ha abierto en el entorno de la microscopía abierto para objetos remotos (OMERO). Este software microscopio de imagen de visualización y análisis tiene una herramienta integrada de retorno de la inversión que se puede utilizar para seleccionar estructuras subcelulares individualesturas y cuantitativamente analizar intensidad de la imagen dentro de la región elegida. Un ejemplo típico de la salida de datos tras el uso de esta herramienta en el programa de cliente se puede ver en la Figura 2B; intensidades de células individuales se muestran junto a una imagen representativa del experimento que sirve como un control visual para asegurar la validez de los datos. Las intensidades de fluorescencia de células individuales se pueden representar como un gráfico de dispersión para mostrar la distribución de las intensidades celulares individuales dentro de la población de células tratadas. Un ejemplo de este tipo de gráfico se ve en la Figura 2C. Trazado de los datos de intensidad de esta manera es útil porque permite una rápida comparación de los resultados del tratamiento y demuestra claramente la heterogeneidad significativa dentro de una población de células de tratamiento que está oscurecida de otro modo el uso de la representación de datos estándar. La heterogeneidad de respuesta es interesante en este experimento porque a pesar de un estímulo hipóxico uniforme era unpplied a las células, es evidente que todas las células de la misma población monocapa responde de manera diferente a este estímulo. La figura 2D muestra el resultado global de nuestro experimento. Intensidades de fluorescencia de todas las células dentro de una población de tratamiento se promediaron y luego trazan en este gráfico de barras. T-test de un estudiante se ha utilizado para el cálculo de la probabilidad estadística de cada grupo de tratamiento que difieren significativamente del control. Curiosamente, estos datos muestran que hay un aumento estadísticamente significativo en la síntesis de ARN mundial con el tiempo cuando las células U2OS se tratan con hipoxia (a veces mayor que 1 h 30 min * p &lt;0,01;. ** P &lt;0,05 y *** p &lt;0.001 y n&gt; 30). Estos datos muestran que después de períodos de tratamiento más largos hipoxia, la célula se centra sus esfuerzos en la producción de ARN incluso en este entorno hipóxico hostil. Actinomicina D tratamiento extirpa completamente la intensidad de fluorescencia como se esperaba.<img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema A. El HIF responde a los cambios de oxígeno celular. En este hipoxia esquemática simplificada estabiliza el heterodímero HIF mediante la prevención de HIF-α hidroxilación (-OH) por las enzimas prolil hidroxilasa (doctores) y su posterior polyubquitination por von Hippel-Lindau proteína (VHL). Resultados de estabilización de HIF en la miríada de activación de genes que ayudan a la célula responder a la hipoxia celular B. síntesis de ARN se puede detectar usando el ensayo de Click-TI.; células se marcan con la UE después del tratamiento la reacción Click detecta la síntesis de ARN que se puede cuantificar por la intensidad de fluorescencia y microscopía de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para conocer el vers grandes</a>ión de esta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> Figura 2. A. Captura de pantalla de OMERO para mostrar la salida típica microscópico después de etiquetado ARN. Este software microscopio de imagen de visualización y análisis se puede extraer datos rápidamente de intensidad en un nivel de células individuales utilizando su innata macro ROI. Una captura de pantalla del resultado de este comando se muestra en la síntesis de B. Global ARN se puede deducir de la intensidad de la celda individual, la gama de los cuales se puede ver en el gráfico de dispersión C. Una representación formal de estos datos agregados puede verse D. * p &lt;0,01; ** P &lt;0,05 y *** p &lt;0.001 y n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <table border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reactivos Cultivo Celular </td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7.2 a 7.6 </td></tr><tr><td> De Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) </td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal (FCS) al filtro esterilizado </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td></tr><tr><td> L-glutamina </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA (1%) </td></tr><tr><td> Etanol 70% </td></tr><tr><td> Actinomicina D (1 mg / l de valores) </td></tr><tr><td> Equipo de Cultivo Celular </td></tr><tr><td> Estéril Pipetas Pasteur </td></tr><tr><td> Una gama de artículos de plástico de cultivo tratados celular adecuado para el mantenimiento y el tratamiento de células en cultivo </td></tr><tr><td> Baño de agua a 37 ° C </td></tr><tr><td> Campana de flujo laminar de aire </td></tr><tr><td> Incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> La hipoxia estación de trabajo fija en 37 ° C, 5% de CO 2, 1% de O 2 </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td></tr><tr><td> pinzas de precisión </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos y equipos necesarios para el cultivo de las células U2OS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> Componentes de la reacción </td><td colspan="6"> Número de Cubreobjetos </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Tampón de reacción RNA Click-iT (Componente C) </td><td> 428 l </td><td> 856 l </td><td> 1,7 ml </td><td> 2,1 ml </td><td> 2,58 ml </td><td> 4,3 ml </td></tr><tr><td> CuSO4 (componente D) </td><td> 20 l </td><td> 40 l </td><td> 80 l </td><td> 100 l </td><td> 120 l </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> Alexa Fluor azida (preparado en la etapa 2.3) </td><td> 1.8 l </td><td> 3.7 l </td><td> 7.4 l </td><td> 9.3 l </td><td> 11.28 l </td><td> 18,8 l </td></tr><tr><td> Click-iT aditivo tampón de reacción (Preparado en el paso 2.3) </td><td> 50 l </td><td> 100 l </td><td> 200 l </td><td> 250 l </td><td> 300 l </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> Aproximado del volumen total </td><td> 500 l </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> . Tabla 2 de formación de imágenes ARN cócteles de reacción kit: tabla de referencia que detalla la relación de los componentes de mezcla maestra para la reacción kit de imagen ARN de acuerdo con el número de cubreobjetos para ser teñidos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fluoróforo </td><td> La excitación (nm) </td><td> Emisión (nm) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342, unido al ADN </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . Tabla 3 Fluorescencia / excitación máximos de emisión: aproximado de fluorescencia / excitación máxima de emisión para el colorante Alexa Fluor y Hoechst 33342 unido al ADN.

Se describe una técnica para el análisis de la síntesis del ARN mundial en la hipoxia utilizando imágenes. Click-química etiquetado de ARN previamente no se ha realizado en condiciones de hipoxia y permite la visualización de los cambios globales en el nivel de ARN de una sola célula. Este enfoque complementa las técnicas de ARN promediados existentes, lo que permite la visualización directa de célula a célula de los cambios en la síntesis de ARN mundial.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar con fluorescencia y cuantificar la cantidad de ARN recién sintetizado producido bajo condiciones de tratamiento, utilizando análisis cuantitativo de imágenes para lograrlo. Las células cultivadas sembradas sobre cubreobjetos se tratan con la base modificada alquino, cinco etal uridina (denominada a partir de ahora cinco EU) e incubadas bajo condiciones hipóxicas.Durante la incubación, se incorpora cinco EU durante la síntesis de ARN sin interrumpir la maquinaria de transcripción celular. A continuación, el cinco EU incorporado se marca fluorescentemente mediante una reacción de clic o cicloadición azida-ino catalizada por cobre. El ARN recién sintetizado marcado fluorescentemente se visualiza entonces por microscopía de fluorescencia y las imágenes resultantes se analizan para comparar la cantidad de ARN generado bajo condiciones de tratamiento y condiciones de control.El análisis estadístico de los datos obtenidos muestra los cambios en la generación de ARN recién sintetizado en respuesta a la hipoxia mediante la cuantificación de la incorporación de EU y su detección por microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la PCR cuantitativa es que permite la visualización directa de la producción de ARN en células a nivel individual. Aunque aquí utilizamos este método para estudiar cómo responden las células al bajo oxígeno, también puede emplearse para investigar las respuestas a fármacos quimioterapéuticos.Nuestras respuestas a estrés adicionales que demuestran un procedimiento serán realizadas por John Leston, un estudiante de posgrado de mi laboratorio con la ayuda de Ish Kova, también estudiante de posgrado, y Humana Druker, una becaria posdoctoral. Finalmente, Gus Ferguson demostrará el uso del software de visualización de imágenes. Comience este experimento sumergiendo varios cubreobjetos en etanol al 70 % para esterilizarlos.Coloque las laminillas en el borde de una placa dentro de la cabina de cultivo celular y déjelas secar al aire bajo flujo laminar. Una vez que las laminillas estén secas, coloque una en cada una de seis placas de 3,5 centímetros. Añada dos mililitros de DMEM completo tibio a cada placa.Presione con la pinza para asegurar que cada cubreobjetos permanezca adherido al fondo de la cavidad. A continuación, para desprender las células U2 OS del recipiente de cultivo de tejidos, lave una vez con tres mililitros de PBS. Luego, agregue cuatro mililitros de tripsina 0.05% caliente, EDTA 1% e incube a 37 grados Celsius durante siete minutos.Después de que hayan transcurrido siete minutos, suspenda las células en seis mililitros de DMEM completo tibio para inactivar la tripsina-EDTA. Cuente las células utilizando un hemocitómetro y siembre cada una de las placas de 3,5 centímetros que contienen laminillas con dos por 10 a la quinta células. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células e incube durante la noche a 37 grados Celsius, 21 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono para permitir que las células se adhieran.Al día siguiente, retire cinco de las placas del incubador. Deje la placa restante sin alterar. Se utilizará como control positivo normóxico.Coloque cuatro de las placas en la estación de trabajo de hipoxia. Exponga las células a condiciones hipóxicas durante 75 minutos, 90 minutos, dos horas y 24 horas. A la otra placa.Añada actinomicina D al medio hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro y colóquelo nuevamente en el incubador a 37 grados bajo condiciones normales de oxígeno durante cuatro horas. Este cultivo sirve como control negativo normóxico. Mientras las células están incubando, prepare y reúna los siguientes reactivos para la preparación del ensayo click it.El kit de ensayo click it contiene PBS con un pH de 7,2 a 7,6, paraformaldehído al 3,7 % en PBS, Triton X-100 al 1 % en PBS, agua desionizada, dimetilsulfóxido, hidróxido de sodio 10 molar, ácido clorhídrico al 37 % y tiras indicadoras de pH. Debe planificar estar listo para comenzar un ensayo etiquetado bajo condiciones no tratadas. Una hora antes de que finalice el tratamiento de hipoxia, para etiquetar las células, prepare una solución de trabajo al doble de EU a partir del stock de 100 milimolar en medio completo precalentado.A continuación, agregue un volumen igual de dos XEU al medio en el recipiente que contiene las células tratadas con actinomicina D, diluyendo así el EU hasta la concentración de trabajo. Luego, en la cámara de hipoxia, agregue el stock de EU a las células tratadas con hipoxia. Incube durante una hora bajo las condiciones de cultivo celular del tratamiento después del tratamiento de hipoxia o durante cuatro horas para los controles.Lave cada placa una vez con PBS y agregue un mililitro del stock de paraformaldehído al 3,7% en las condiciones de tratamiento, incube durante 15 minutos bajo dichas condiciones. Tras la fijación, retire las células de la cámara de hipoxia y colóquelas en la campana extractora. Retire el fijador teniendo cuidado de desechar los residuos de paraformaldehído de forma responsable.Luego, lave las células una vez con PBS. Realice los siguientes pasos a temperatura ambiente, manteniendo todas las soluciones en hielo a dos o seis grados Celsius. A continuación, para permeabilizar las células, retire la solución de lavado y agregue un mililitro de Tritón X-100 al 1% en PBS a cada pozo; incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.Retire el tampón de permeabilización y lave cada pocillo una vez con PBS. Retire la solución de lavado de las células y añada 500 microlitros de la mezcla de reacción recién preparada del kit de imagen de ARN a cada muestra. Proteja las células de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, retire la reacción del kit de imagen de ARN, el cóctel y el lavado. Una vez con un mililitro de la reacción del kit de imagen de ARN, enjuague el tampón; cualquier etiquetado adicional con anticuerpos debe realizarse en este momento. Para teñir el ADN, lave las muestras con PBS y luego diluya el herst 3,3,3,4,2 a uno en 1000.En PBS, agregue un mililitro de la solución de HERC diluida a cada uno. Proteja de la luz e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, elimine la solución de HERC y lave las células dos veces con PBS para montar las laminillas.Coloque 10 microlitros de medio de montaje en el centro de un microscopio estándar. Deslice y coloque el portaobjetos con la cara celular hacia abajo sobre la gota de medio de montaje. Evite generar burbujas, ya que esto dificultará la adquisición posterior de imágenes.Aplique esmalte de uñas transparente alrededor del borde del portaobjetos para fijarlo al portaobjetos del microscopio. Deje secar el esmalte durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las muestras protegidas de la luz pueden almacenarse a veinte grados Celsius bajo cero.Después del montaje, adquiera imágenes utilizando un microscopio de campo amplio capaz de detección de fluorescencia. Realice la adquisición de imágenes utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40 V y 1,30 NA y capture las imágenes con una cámara CCD refrigerada. Un mínimo de 30 células tras la adquisición de imágenes.Utilice un software de procesamiento de imágenes para corregir las imágenes. Esto corregirá la distorsión óptica mediante la aplicación de una fórmula matemática basada en software a las imágenes capturadas. El resultado es una imagen más nítida que garantizará que el análisis posterior se limite únicamente a las celdas imagenadas.A continuación, importe las imágenes al cliente Omer O. Se mostrarán miniaturas de todas las imágenes obtenidas para normalizar los ajustes de representación de todas las imágenes en el mismo experimento. Aplique los ajustes de representación de las células normóxicas de control a todas las demás condiciones utilizando la herramienta de región de interés (ROI) en el software de análisis.Seleccione núcleos de cada imagen en el software. Elija la opción de análisis de intensidad y obtenga las intensidades medias para cada ROI de 30 a 50 células. Guarde los datos y luego calcule el promedio y la desviación estándar para cada condición.Finalmente, utilice software de graficación de datos para construir diagramas de dispersión de todos los valores individuales de intensidad media que reflejen la variabilidad entre las células en cada condición. Representar gráficamente los datos de intensidad de esta manera es útil porque permite una comparación rápida de los resultados de los tratamientos y demuestra claramente la heterogeneidad significativa dentro de una población celular sometida a un tratamiento, que de otro modo quedaría oculta al usar representaciones estándar de los datos. Alternativamente, elabore gráficos de barras para representar la intensidad media promedio más la desviación estándar del ARN recién sintetizado, con el fin de determinar cuantitativamente la síntesis total de ARN. Las células U2 OS tratadas con hipoxia y cultivadas en presencia de al uridina o EU fueron posteriormente procesadas y analizadas.Como se demostró en este video, se promediaron e hicieron gráficos las intensidades de fluorescencia de todas las células dentro de cada población tratada. En este gráfico de barras, se utilizó una prueba T de Student para calcular la probabilidad estadística de que cada grupo de tratamiento difiriera significativamente del control. Curiosamente, estos datos muestran un aumento estadísticamente significativo en la síntesis global de ARN a lo largo del tiempo.Cuando las células U2 OS se tratan con hipoxia durante más de una hora y media, tal como se esperaba, el tratamiento con ACTO micina D elimina completamente la intensidad de fluorescencia. Estos datos sugieren que, tras períodos prolongados de tratamiento con hipoxia, la célula centra sus esfuerzos en la producción de ARN, incluso en este entorno hipóxico hostil. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y cuantificar el ARN recién sintetizado a nivel de célula individual en condiciones de hipoxia y normoxia; una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas siguiendo este procedimiento.Se pueden realizar otros métodos, como la tinción simultánea con anticuerpos para la ARN polimerasa y HIF uno, para determinar si los niveles de ARN polimerasa se alteran y si HIF está activado. No olvide que trabajar con formaldehído puede ser extremadamente peligroso durante este procedimiento. Siempre asegúrese de usar guantes y trabajar en una campana extractora.

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Aprende a analizar la síntesis global de RNA en células individuales bajo hipoxia mediante química click y microscopía de fluorescencia. Este método permite visualizar directamente la producción de RNA y estudiar respuestas celulares a bajo oxígeno.

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