Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar con fluorescencia y cuantificar la cantidad de ARN recién sintetizado producido bajo condiciones de tratamiento, utilizando análisis cuantitativo de imágenes para lograrlo. Las células cultivadas sembradas sobre cubreobjetos se tratan con la base modificada alquino, cinco etal uridina (denominada a partir de ahora cinco EU) e incubadas bajo condiciones hipóxicas.

Durante la incubación, se incorpora cinco EU durante la síntesis de ARN sin interrumpir la maquinaria de transcripción celular. A continuación, el cinco EU incorporado se marca fluorescentemente mediante una reacción de clic o cicloadición azida-ino catalizada por cobre. El ARN recién sintetizado marcado fluorescentemente se visualiza entonces por microscopía de fluorescencia y las imágenes resultantes se analizan para comparar la cantidad de ARN generado bajo condiciones de tratamiento y condiciones de control.

El análisis estadístico de los datos obtenidos muestra los cambios en la generación de ARN recién sintetizado en respuesta a la hipoxia mediante la cuantificación de la incorporación de EU y su detección por microscopía de fluorescencia. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la PCR cuantitativa es que permite la visualización directa de la producción de ARN en células a nivel individual. Aunque aquí utilizamos este método para estudiar cómo responden las células al bajo oxígeno, también puede emplearse para investigar las respuestas a fármacos quimioterapéuticos.

Nuestras respuestas a estrés adicionales que demuestran un procedimiento serán realizadas por John Leston, un estudiante de posgrado de mi laboratorio con la ayuda de Ish Kova, también estudiante de posgrado, y Humana Druker, una becaria posdoctoral. Finalmente, Gus Ferguson demostrará el uso del software de visualización de imágenes. Comience este experimento sumergiendo varios cubreobjetos en etanol al 70 % para esterilizarlos.

Coloque las laminillas en el borde de una placa dentro de la cabina de cultivo celular y déjelas secar al aire bajo flujo laminar. Una vez que las laminillas estén secas, coloque una en cada una de seis placas de 3,5 centímetros. Añada dos mililitros de DMEM completo tibio a cada placa.

Presione con la pinza para asegurar que cada cubreobjetos permanezca adherido al fondo de la cavidad. A continuación, para desprender las células U2 OS del recipiente de cultivo de tejidos, lave una vez con tres mililitros de PBS. Luego, agregue cuatro mililitros de tripsina 0.05% caliente, EDTA 1% e incube a 37 grados Celsius durante siete minutos.

Después de que hayan transcurrido siete minutos, suspenda las células en seis mililitros de DMEM completo tibio para inactivar la tripsina-EDTA. Cuente las células utilizando un hemocitómetro y siembre cada una de las placas de 3,5 centímetros que contienen laminillas con dos por 10 a la quinta células. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las células e incube durante la noche a 37 grados Celsius, 21 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono para permitir que las células se adhieran.

Al día siguiente, retire cinco de las placas del incubador. Deje la placa restante sin alterar. Se utilizará como control positivo normóxico.

Coloque cuatro de las placas en la estación de trabajo de hipoxia. Exponga las células a condiciones hipóxicas durante 75 minutos, 90 minutos, dos horas y 24 horas. A la otra placa.

Añada actinomicina D al medio hasta una concentración final de 10 microgramos por mililitro y colóquelo nuevamente en el incubador a 37 grados bajo condiciones normales de oxígeno durante cuatro horas. Este cultivo sirve como control negativo normóxico. Mientras las células están incubando, prepare y reúna los siguientes reactivos para la preparación del ensayo click it.

El kit de ensayo click it contiene PBS con un pH de 7,2 a 7,6, paraformaldehído al 3,7 % en PBS, Triton X-100 al 1 % en PBS, agua desionizada, dimetilsulfóxido, hidróxido de sodio 10 molar, ácido clorhídrico al 37 % y tiras indicadoras de pH. Debe planificar estar listo para comenzar un ensayo etiquetado bajo condiciones no tratadas. Una hora antes de que finalice el tratamiento de hipoxia, para etiquetar las células, prepare una solución de trabajo al doble de EU a partir del stock de 100 milimolar en medio completo precalentado.

A continuación, agregue un volumen igual de dos XEU al medio en el recipiente que contiene las células tratadas con actinomicina D, diluyendo así el EU hasta la concentración de trabajo. Luego, en la cámara de hipoxia, agregue el stock de EU a las células tratadas con hipoxia. Incube durante una hora bajo las condiciones de cultivo celular del tratamiento después del tratamiento de hipoxia o durante cuatro horas para los controles.

Lave cada placa una vez con PBS y agregue un mililitro del stock de paraformaldehído al 3,7% en las condiciones de tratamiento, incube durante 15 minutos bajo dichas condiciones. Tras la fijación, retire las células de la cámara de hipoxia y colóquelas en la campana extractora. Retire el fijador teniendo cuidado de desechar los residuos de paraformaldehído de forma responsable.

Luego, lave las células una vez con PBS. Realice los siguientes pasos a temperatura ambiente, manteniendo todas las soluciones en hielo a dos o seis grados Celsius. A continuación, para permeabilizar las células, retire la solución de lavado y agregue un mililitro de Tritón X-100 al 1% en PBS a cada pozo; incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Retire el tampón de permeabilización y lave cada pocillo una vez con PBS. Retire la solución de lavado de las células y añada 500 microlitros de la mezcla de reacción recién preparada del kit de imagen de ARN a cada muestra. Proteja las células de la luz e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, retire la reacción del kit de imagen de ARN, el cóctel y el lavado. Una vez con un mililitro de la reacción del kit de imagen de ARN, enjuague el tampón; cualquier etiquetado adicional con anticuerpos debe realizarse en este momento. Para teñir el ADN, lave las muestras con PBS y luego diluya el herst 3,3,3,4,2 a uno en 1000.

En PBS, agregue un mililitro de la solución de HERC diluida a cada uno. Proteja de la luz e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, elimine la solución de HERC y lave las células dos veces con PBS para montar las laminillas.

Coloque 10 microlitros de medio de montaje en el centro de un microscopio estándar. Deslice y coloque el portaobjetos con la cara celular hacia abajo sobre la gota de medio de montaje. Evite generar burbujas, ya que esto dificultará la adquisición posterior de imágenes.

Aplique esmalte de uñas transparente alrededor del borde del portaobjetos para fijarlo al portaobjetos del microscopio. Deje secar el esmalte durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las muestras protegidas de la luz pueden almacenarse a veinte grados Celsius bajo cero.

Después del montaje, adquiera imágenes utilizando un microscopio de campo amplio capaz de detección de fluorescencia. Realice la adquisición de imágenes utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 40 V y 1,30 NA y capture las imágenes con una cámara CCD refrigerada. Un mínimo de 30 células tras la adquisición de imágenes.

Utilice un software de procesamiento de imágenes para corregir las imágenes. Esto corregirá la distorsión óptica mediante la aplicación de una fórmula matemática basada en software a las imágenes capturadas. El resultado es una imagen más nítida que garantizará que el análisis posterior se limite únicamente a las celdas imagenadas.

A continuación, importe las imágenes al cliente Omer O. Se mostrarán miniaturas de todas las imágenes obtenidas para normalizar los ajustes de representación de todas las imágenes en el mismo experimento. Aplique los ajustes de representación de las células normóxicas de control a todas las demás condiciones utilizando la herramienta de región de interés (ROI) en el software de análisis.

Seleccione núcleos de cada imagen en el software. Elija la opción de análisis de intensidad y obtenga las intensidades medias para cada ROI de 30 a 50 células. Guarde los datos y luego calcule el promedio y la desviación estándar para cada condición.

Finalmente, utilice software de graficación de datos para construir diagramas de dispersión de todos los valores individuales de intensidad media que reflejen la variabilidad entre las células en cada condición. Representar gráficamente los datos de intensidad de esta manera es útil porque permite una comparación rápida de los resultados de los tratamientos y demuestra claramente la heterogeneidad significativa dentro de una población celular sometida a un tratamiento, que de otro modo quedaría oculta al usar representaciones estándar de los datos. Alternativamente, elabore gráficos de barras para representar la intensidad media promedio más la desviación estándar del ARN recién sintetizado, con el fin de determinar cuantitativamente la síntesis total de ARN. Las células U2 OS tratadas con hipoxia y cultivadas en presencia de al uridina o EU fueron posteriormente procesadas y analizadas.

Como se demostró en este video, se promediaron e hicieron gráficos las intensidades de fluorescencia de todas las células dentro de cada población tratada. En este gráfico de barras, se utilizó una prueba T de Student para calcular la probabilidad estadística de que cada grupo de tratamiento difiriera significativamente del control. Curiosamente, estos datos muestran un aumento estadísticamente significativo en la síntesis global de ARN a lo largo del tiempo.

Cuando las células U2 OS se tratan con hipoxia durante más de una hora y media, tal como se esperaba, el tratamiento con ACTO micina D elimina completamente la intensidad de fluorescencia. Estos datos sugieren que, tras períodos prolongados de tratamiento con hipoxia, la célula centra sus esfuerzos en la producción de ARN, incluso en este entorno hipóxico hostil. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar y cuantificar el ARN recién sintetizado a nivel de célula individual en condiciones de hipoxia y normoxia; una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas siguiendo este procedimiento.

Se pueden realizar otros métodos, como la tinción simultánea con anticuerpos para la ARN polimerasa y HIF uno, para determinar si los niveles de ARN polimerasa se alteran y si HIF está activado. No olvide que trabajar con formaldehído puede ser extremadamente peligroso durante este procedimiento. Siempre asegúrese de usar guantes y trabajar en una campana extractora.