Name: Longitud de onda única Shadow Imaging de Caenorhabditis elegans Locomotion incluida la fuerza Estimaciones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a medir la velocidad vertical y las fuerzas de nematodos nadadores libres usando radiación monocromática coherente. Esta técnica de imagen de sombra de bajo costo permite cuantificar empuje y arrastre en Caenorhabditis elegans.

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Estamos muy agradecidos por el apoyo del Instituto de Investigación de Pregrado Vassar College Summer (URSI), el Fondo de Investigación Salmon Lucy Maynard, premio NASA No. NX09AU90A, Fundación Nacional de Ciencias Centro de Excelencia de Investigación en Ciencia y Tecnología (NSF-CREST) ​​laudo No 0630388 y la NSF laudo No 1.058.385.

1. C. Preparación elegans <ol><li> Preparar las placas de Petri de joven adulto C. elegans, como se describe en los experimentos anteriores que implican la suspensión de C. elegans en una cubeta llena de líquido 11. </li><li> En el día del análisis de vídeo, recoger nematodos adultos jóvenes en vivo directamente en una cubeta llena con agua destilada desionizada con un pico de platino como se describe en el paso 2. </li><li> Preparar muertos C. elegans con la exposición cloroformo. Continuar siguiendo el procedimiento descrito para recoger nematodos vivos descritos en la etapa 2. </li></ol> 2. Configuración óptica para el análisis de vídeo <ol><li> Montar el montaje experimental para crear imágenes de sombra como se muestra en la Figura 1. La cámara se puede colocar en cualquier distancia de la pantalla el tiempo que es capaz de capturar una vista frontal de la pantalla. Un buen lugar es al lado de la cubeta frente a la pantalla. <ol><li> El uso de al menos dos espejos paradirigir la salida del láser de helio-neón sintonizable en un expansor de haz de Galileo de modo que el haz se expande a un diámetro de 12 mm. </li><li> Coloque uno o dos agujeros de alfiler en la trayectoria del haz de manera que el haz pasa a través de los agujeros de alfiler sin ser obstruido. Utilice los orificios para asegurar la alineación se mantiene. </li><li> Dirigir el haz expandido en una cubeta de cuarzo montado que es 10 mm de ancho, 10 mm de profundidad y 4 cm de altura. </li><li> Ampliar la viga usando una lente plano convexa con una distancia focal positiva de 75 mm. </li><li> Coloque una pantalla de proyección de aproximadamente 120 cm de la lente. Distancias mayores que este producirán una mayor ampliación de la imagen de la sombra. Sin embargo, la calidad de la imagen disminuirá con una intensidad de luz más baja y un aumento de la perceptibilidad de la interferencia de difracción. </li><li> Colocar una cámara de alta velocidad, que es capaz de, al menos, 60 fps, justo al lado de la cubeta frente a la pantalla. </li></ol></li><li> Coloque un microscopio de disección, cerca del conjunto ópticopara la transferencia rápida de los nematodos en la cubeta. </li><li> Fije temporalmente una regla transparente con divisiones mm del centro del soporte de la cubeta perpendicular a la viga ampliado para que los proyectos de haces una imagen ampliada de la regla en la pantalla. Establecer la escala de longitud para el análisis de vídeo. <ol><li> En la pantalla de proyección, marque la distancia escala con una regla transparente fuera del centro de la imagen proyectada para evitar interferir con la proyección. <a href="Video_1_633nm.MOV" target="_blank">Haga clic aquí para el vídeo.</a> </li><li> Anote esta imagen y medir el aumento. Retire el legislador de la configuración. Repita este paso para otras longitudes de onda como el ángulo de refracción de la luz de cada longitud de onda a través de la lente puede variar debido a las aberraciones cromáticas. </li></ol></li><li> Vuelva a colocar la cubeta y llenarlo hasta dentro de 1 mm de la llanta con agua destilada. </li><li> Inicie la grabación mientras que la luz de la sala se encuentra en modo que la distancia escala está incluido en el mismomaterial de archivo como la imagen proyectada. Apague la luz. </li><li> El uso de un fino, aplanado recogida de alambre de platino, mueva adulto joven individuo C. elegans de uno en uno desde la placa de agar en la cubeta tocando la selección a la superficie del agua. El nematodo se hará visible en la columna de agua cuando entra en la viga debido a la luz dispersada. <a href="Video_2_CB678_633nm.mov" target="_blank">Haga clic aquí para el vídeo.</a> </li><li> Filmar las imágenes proyectadas de los gusanos a medida que pasan a través del haz láser expandida. Es importante tener en cuenta que la imagen proyectada se invierte y los gusanos aparecerá a moverse en la dirección opuesta de su movimiento real. Los gusanos que van descendiendo con la gravedad aparecerán a moverse hacia arriba en la pantalla (Figura 2). </li></ol> 3. Preparación de datos de vídeo <ol><li> Importar el vídeo en el programa de análisis de vídeo. </li><li> Ajuste la escala utilizando el factor de magnificación determinado previamente. </li><li> Track el desplazamiento lineal de la cabeza del nematodo sombra con al menos 10 puntos de datos en todo el camino recorrido. </li><li> Encuentre la velocidad en la dirección vertical, tomando derivada (&quot;Y&quot;, &quot;Time&quot;) y dividir este valor por el factor de aumento determinado en el paso 2.2. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Analizar el descenso lineal de un C. elegans: <ol><li> Revise para asegurarse de que los puntos de datos en la posición vertical contra gráfico de tiempo generalmente forman una línea recta. Algunas desviaciones pueden ser ignorados debido al movimiento de la cabeza del nematodo. Si en general los puntos de datos forman una línea recta, continúe con el paso 4.1.2, de lo contrario el descenso no es lineal y el análisis debe continuar usando el paso 5.1 en este protocolo. </li><li> Crear una línea de regresión lineal ajustando una línea recta 12 a los datos desde el menú Análisis. La pendiente de esta línea es entonces la velocidad vertical del C.elegans. La pendiente es el cambio en la posición dividido por el cambio en el tiempo durante un intervalo determinado. Determinar la velocidad de descenso de los gusanos vivos y muertos de esta manera (Figura 3). </li><li> Promediar las velocidades de natación verticales de los nematodos. Un tamaño de muestra de alrededor de 50 gusanos es suficiente. Comparar las velocidades de natación en gusanos vivos con velocidades de deriva en gusanos muertos. </li></ol></li></ol> 5. Analizar lineal Movimiento de C. elegans <ol><li> De la Sección 3, seleccione un archivo de vídeo analizado, que muestra un descenso lineal en la columna de agua (Figura 4). Un descenso no lineal se puede identificar mediante el paso 4.1.1 en este protocolo. </li><li> Seleccione &#39;Curve Fit&#39; en el menú &#39;Análisis&#39; en el software de análisis de vídeo. Seleccione un segundo orden (cuadrático) polinómica. Ajustar la curva. </li><li> Para una región de interés, ajuste el ajuste en el gráfico haciendo deslizar los soportes en cada lado of el ajuste en el gráfico hasta que la curva es muy cerca de los puntos de datos dentro de la forma y / o bien dentro de las barras de error. El programa de ajuste da una expresión matemática de la curva ajustada, que es la posición vertical, en función del tiempo. Tenga en cuenta los errores curva ajustada dadas por el programa asociado con las propiedades físicas. Un error relativo de 15% o por debajo es por lo general aceptable. </li><li> Añadir más curva se ajusta para cubrir las secciones adicionales de datos. Spline 13 las funciones para una cobertura óptima: asegúrese de que la curva de ajuste a la superposición y tratar de alinear las curvas adyacentes, de manera que el partido de laderas en las regiones que se superponen. </li><li> Obtener la velocidad de una región de interés tomando la derivada de la curva ajustada utilizando la expresión matemática obtenida en la etapa 5.1.3. Las velocidades pueden variar en el tiempo. Tenga en cuenta que la derivada es la pendiente de una función. El derivado puede obtenerse matemáticamente o gráficamente. En este caso es práctico utilizar la expr matemática dadaesión. </li><li> Tome la segunda derivada de las curvas ajustadas para obtener la aceleración. La aceleración puede variar en el tiempo. </li><li> Multiplique la aceleración de la masa del gusano para calcular el empuje que ejerce el gusano. Una masa estimada razonable es 3 g suponiendo que el gusano se compone principalmente de agua. </li></ol>

<ol><li>Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+behavioral+hierarchies+during+environmental+transitions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans.</a> Worm. 1, 5-11 (2012).</li>
<li>Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+locomotion+of+the+nematode+C.+elegans+is+achieved+through+modulation+of+a+single+gait%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+Journal%22%5BJournal%5D)">Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait.</a> HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).</li>
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<li>Conrad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth+of+Field+in+Depth%5BTitle%5D)+AND+%22Large+Format+Page+Retrieved%22%5BJournal%5D)">Depth of Field in Depth.</a> Large Format Page Retrieved. , Available from:
 
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<li>Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+J.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).</li>
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<li>Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+JR+%22Classical+Mechanics%22">Classical Mechanics</a>. , University Science Books. (2005).</li>
<li>Magnes, J., Susman, K., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li>
<li>Bevington, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBevington%2C+PR+%22Data+Reduction+and+Error+Analysis+for+the+Physical+Sciences%22">Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences</a>. , McGraw-Hill Book Company. New York. (1969).</li>
<li>Lyche, T., Schumaker, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+spline+approximation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Approximation+Theory%22%5BJournal%5D)">Local spline approximation methods.</a> Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+Force+Transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FENaC+Channel+Modulates+DAF-16%2FFoxO+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La técnica SWSI proporciona un medio adicional para entender las capacidades de locomoción de organismos microscópicos como los nematodos de vida libre. Con esta técnica se ha distinguido entre la locomoción activa (natación) y la deriva pasiva debido a la gravedad que opera sobre los nematodos muertas. Además, cuando nadan libremente nemátodos cambian de dirección durante la locomoción en el agua, que son capaces de medir las fuerzas de arrastre y las fuerzas angulares, que están operando en los nematodos y ejercida por los nematodos. Los nematodos se encuentran con diferentes condiciones ambientales dentro del suelo. Hay bolsas de agua dentro del suelo, así como partículas sólidas y materiales biológicos de diferentes formas y texturas. Además, existen nematodos dentro de un entorno gravitacional que responden a 14. Además, los nematodos cerca de la superficie del suelo están expuestos a diferentes longitudes de onda de la luz, cambios en la temperatura y la humedad, así como biológicavariables como bacterias, hongos depredadores y otros organismos del suelo. Los nematodos deben responder a todas estas diferentes variables, nadando y arrastrándose en diferentes medios de comunicación, el torneado y la alteración de las estrategias de navegación. Todos estos cálculos complejos se llevan a cabo por sólo 302 neuronas, un subconjunto de los cuales están implicados en la locomoción, y 95 células musculares de la pared del cuerpo. Las mediciones del tipo descrito por la técnica SWSI proporcionan información importante sobre cómo nematodos lograr esta complejidad de navegación. Para la primera parte, hemos medido la tasa de descenso general de tipo salvaje C. elegans en 633 nm de luz. El uso de estas mediciones, se puede estimar la fuerza de arrastre a los encuentros de gusano. Para el estudio de caso de un nematodo de aceleración, las fuerzas involucradas cambio continuamente desde la fuerza de resistencia cambia con la velocidad. Hay algunas afirmaciones que podemos hacer acerca de las fuerzas que actúan sobre el gusano. A medida que el gusano se ralentiza y trata de swim hacia arriba la componente vertical de la fuerza de arrastre disminuye hasta llegar a cero en el punto más bajo de la trayectoria del nematodo. En este punto, el gusano debe tener una fuerza hacia arriba para nadar. Este método se puede modificar de varias maneras. Cualquier especie microscópicos que navega en un líquido claro se pueden seguir usando SWSI. Los estudios pueden llevarse a cabo con cualquier longitudes de onda que son accesibles a las cámaras digitales. Las cámaras digitales suelen recogerá longitudes de onda que van de la UV a IR cercano. Además, los estudios horizontales pueden llevarse a cabo dirigiendo el láser verticalmente hacia arriba. La especie puede entonces ser colocado en una superficie transparente horizontal, como un portaobjetos de microscopio. Ajuste del expansor de haz o el lente de aumento después de la expansión del haz puede agudizar las imágenes borrosas. El usuario debe asegurarse de ajustar todos los componentes de la mesa para asegurar la alineación de haz coherente y fácil. El método está limitada por wavelengt láser disponibleshs y resolución. En esencia, las ventajas de este método más de microscopios existentes, que son la flexibilidad en direcciones y longitudes de onda, son también puntos débiles desde la configuración es simple. La óptica poco sofisticados y motas del láser limitan la resolución. Algunos de estos inconvenientes, sin duda se puede mejorar en el futuro mediante la inclusión de filtro espacial y la proyección de la imagen directamente en una cámara CCD. Los pasos más críticos en el protocolo pueden ser fácilmente extraídas como se realiza el experimento por primera vez. La colocación del nematodo en la cubeta sin crear turbulencia es crítico. Además, las vibraciones pueden perturbar la configuración y alterar el comportamiento de los gusanos. Asegúrese de limitar el poder, que se utiliza a la sombra de la imagen. 2 mW para un rayo láser que es 1 mm de diámetro debe ser el máximo para evitar efectos de calentamiento. La configuración debe ser probado para la dispersión efectos al usar líquidos distintos del agua destilada. Actualmente la mayor parte microscopes operan en un plano horizontal con luz blanca o de color filtros, que siguen siendo muy amplio en la gama de longitud de onda. Microscopios que realmente utilizar longitudes de onda individuales y tener flexibilidad en el escenario de la visión, es decir, la colocación horizontal, por lo general se limitan a una ventaja o la otra. Además, este tipo de microscopios suelen ser muy caros y todavía limitado a planos focales a diferencia de nuestro método. Nuestra configuración puede ser fácilmente construido con un presupuesto muy bajo. Este método está listo para ser utilizado por las escuelas, las empresas ambientales, así como otras entidades que operan con pocos fondos. En el futuro, este método se puede utilizar en una configuración muy sofisticado para estudiar los efectos en tiempo real sobre la locomoción y mechanosensation de especies microscópicas. Este método hace que los estudios de longitud de onda única en una amplia gama de ángulos y profundidades de visión fácilmente disponibles.

Caenorhabditis elegans es un nematodo del suelo beneficiosos de vida libre que es un organismo modelo de gran alcance para el estudio de los mecanismos de regulación de genes, desarrollo y, más recientemente, para la comprensión de la biología sensorial y el comportamiento. A pesar de tener sólo 302 neuronas, C. elegans son capaces de complejos patrones de locomoción, los comportamientos reproductivos, la navegación, la quimiotaxis y muchos otros comportamientos. C. elegans poseen mecanorreceptores, quimiorreceptores e incluso detectar longitudes de onda de luz azul (Ward et al., 2008) 1. Aunque se sabe mucho sobre los circuitos neuronales de la función sensoriomotora y los patrones de locomoción generales en C. elegans, menos se sabe acerca de las respuestas a los múltiples estímulos simultáneos o condiciones ambientales más complejos que se pueden modelar con un microscopio. Algunos estudios han puesto de manifiesto los patrones de locomoción más complejos que son 2,3,4 muy plástico. Nuestro enfoque metodológico permitirá estudios de nematodes en solución en tiempo real en el que podemos proporcionar fácilmente múltiples condiciones ambientales simultáneamente. Esta pregunta es difícil de abordar utilizando técnicas convencionales de imagen basada en el microscopio. Hemos desarrollado una técnica que nos permite colocar los nematodos dentro de una columna de agua para examinar los comportamientos de locomoción, así como determinar las capacidades de los nematodos para cambiar la locomoción en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Longitud de onda única Shadow Imaging (SWSI) se presenta en este trabajo por primera vez para hacer frente a las deficiencias de los microscopios tradicionales. Microscopios tradicionales se limitan a observar especies en un plano focal horizontal unas pocas micras de profundidad 5,6. En cuanto a los estudios de longitud de onda única, la mayoría de los microscopios tradicionales utilizan filtros de color para filtrar la luz blanca de manera muy amplia, por lo general, 50 a 100 nm. El uso de un láser para SWSI se estrecha la selección de longitud de onda de menos de 1 nm, mientras que el mantenimiento de signoificant intensidad de la luz 7. Del mismo modo, las longitudes de onda individuales se han utilizado para medir las frecuencias de natación de C. elegans en tiempo real 8. Para la primera demostración de nuestro método, monitoreamos la posición horizontal, x, y la posición vertical, y, de un C. libremente la natación elegans en una columna de agua, más de una distancia de alrededor de un centímetro. En particular, estamos interesados ​​en el movimiento vertical ya que la gravedad también actúa verticalmente. La pendiente de un ajuste lineal a la posición vertical da la velocidad vertical, V y, del nematodo a medida que desciende en la columna de agua: <img alt="Fórmula" fo:content-width="0.5in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq1.jpg" width="50" /> (1) La raíz cuadrada media del error (RMSE) 9 indica la calidad del ajuste e indica si la velocidad de descenso es generalmente constante. Las velocidades verticales se promedian para eacespecies h y gusanos muertos. El uso de estos resultados, el arrastre, que la experiencia gusanos puede ser estimado. Para la segunda demostración de nuestro método, hemos seleccionado C. elegans que no descienden a una velocidad constante a diferencia de la mayoría de los gusanos observados. Los gusanos seleccionados o bien se dieron la vuelta y nadó hacia arriba o hacia rondaban por un tiempo antes de continuar el descenso. Físicamente, este estudio de caso muestra que la idea central de un microorganismo de natación se puede calcular. Las leyes de Newton dictan que un cuerpo que cambia de dirección se acelera, lo que implica una fuerza neta, <img alt="Fórmula 1" fo:content-width="0.3in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq.jpg" width="25" /> , Es que actúa sobre ese cuerpo 10: <img alt="Fórmula 2" fo:content-width="0.7in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq2.jpg" width="70" /> (2) donde <img alt="p" fo:content-width="0.1in" src="/files/ftp_upload/51424/51424p.jpg" width="10" /> esla cantidad de movimiento y t es el tiempo. La aceleración del gusano es directamente proporcional a la fuerza que actúa sobre el gusano ya que la masa del gusano permanece constante. Como resultado, la fuerza neta vertical es: <img alt="Fórmula 3" fo:content-width=".8in" src="/files/ftp_upload/51424/51424eq3.jpg" width="70" /> (3) donde m es la masa de un tornillo sin fin y una de las y representa la aceleración vertical. La fuerza neta en la dirección vertical representa la fuerza de propulsión gusano en la misma dirección. El empuje total se puede calcular tomando la componente horizontal en cuenta.

<table><tbody><tr><td>Láser de helio-neón sintonizable&nbsp;</td><td>Research Electro-Optics</td><td>30602</td><td>Se pueden seleccionar cuatro longitudes de onda entre 543 nm y 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Espejos de aluminio de superficie frontal</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Cámara Exilim de Alta Velocidad</td><td>Casio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de cuarzo</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td></td></tr><tr><td>LoggerPro (Software)</td><td>Vernier</td><td></td><td>http://www.vernier.com/products/software/lp/</td></tr> <tr><td>Mathematica 8</td><td>Wolfram</td><td></td><td>http://www.wolfram.com/</td></tr><tr><td>Expansor de haz galileano con zoom variable 5x-10x</td><td>Thorlabs</td><td>BE05-10-A</td> Lente plano-convexa <td></td></tr><tr><td>con una distancia focal positiva de 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1257</td><td></td></tr></tbody></table>

longitud de onda única shadow imaging de<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; locomotion incluida la fuerza estimaciones

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

Este estudio demuestra una técnica de bajo costo y sencillo que permite la medición de las propiedades físicas, tales como posición, velocidad, aceleración y fuerzas implicadas en el comportamiento locomotor de los nematodos en suspensión en una columna de agua en respuesta a longitudes de onda individuales de luz. Demostramos cómo evaluar la locomoción de un organismo microscópico usando Longitud de onda única Shadow Imaging (SWSI) utilizando dos ejemplos diferentes. El primer ejemplo es un estudio sistemático y estadísticamente viable del descenso promedio de C. elegans en una columna de agua. Para este estudio, hemos utilizado de estar y de tipo salvaje muerto C. elegans. Cuando se comparó la velocidad y la dirección de nematodo movimiento activo con el descenso pasiva de gusanos muertos dentro del campo gravitatorio, este estudio no mostró diferencias en el descenso veces. El descenso promedio fue de 1,5 mm / s ± 0,1 mm / s, tanto para los gusanos vivos y muertos utilizando 633 nm coherenteluz. El segundo ejemplo es un estudio de caso de la selección de personal C. elegans cambiar de dirección durante el descenso en una columna vertical de agua. La aceleración y la fuerza se analizan en este ejemplo. Este estudio de caso demuestra el alcance de otras propiedades físicas que pueden ser evaluados utilizando SWSI mientras se evalúa el comportamiento utilizando longitudes de onda individuales en un ambiente que no es accesible con microscopios tradicionales. El uso de este análisis se estimó un nematodo individuo es capaz de empujar con una fuerza de más de 28 nN. Nuestros hallazgos indican que los nematodos que viven ejercen 28 nN al girar o moverse contra el campo gravitatorio. Los resultados sugieren además que los nematodos pasivamente descienden en una columna de agua, pero pueden resistir activamente la fuerza de gravedad sobre todo por el sentido de giro.

Descent Steady La primera investigación no muestra diferencias distinguibles en las tasas descendentes de la C. elegans durante SWSI utilizando 633 nm. Se encontró que las tasas descendentes de ser constante a 1,5 mm / s ± 0,1 mm / s, tanto para el vivo y el muerto C. elegans. Un tamaño de muestra de 50 gusanos generó una variación razonable de 7% tanto para vivir y gusanos muertos. No hay aceleración que actúa sobre los gusanos desde la velocidad de descenso es constante, de manera que la fuerza de arrastre es igual a la fuerza gravitacional menos la fuerza de flotabilidad. Esto implica que la densidad del gusano es ligeramente más grande que la del agua; Sin embargo, para las estimaciones más abajo todavía es práctico suponer que la densidad de un nematodo es más o menos la del agua. Cambio de dirección La segunda investigación, un estudio de caso, demuestra que los nematodos son capaces de cambiar de dirección y pueden nadar hacia arriba contrala gravedad. Dos curvas se ajustaron para el desplazamiento vertical del nematodo de manera que los segundos derivados de esas curvas podrían ser estriados para representar gráficamente la aceleración en función del tiempo (Figura 5). &#160; Es aconsejable mantener el orden polinomio lo más bajo posible, manteniendo un buen ajuste. Un polinomio de orden inferior indica una menor variación en la aceleración en el tiempo. Los términos de polinomios de orden superior serán insignificantes, y por lo tanto innecesario, si el orden del polinomio es demasiado alto. Este gusano decelera a una velocidad constante de 0,110 mm / seg 2 ± 0.002 mm / seg 2, se da la vuelta y se acelera a la misma velocidad de 0.110 mm / seg 2 ± 0,002 mm / s 2 hasta poco después de el punto de entrega. El C. elegans continúa moviéndose hacia arriba con una aceleración de la disminución de 1,252 a 0,00708 t en mm / s 2 hasta que la aceleración cae a cero. Teniendo en cuenta la ecuación. 3, y una masa gusano estimado de 3 y #956, g, el gusano se somete a una fuerza neta vertical, F Ny, de 0,33 pN hasta poco después de que el punto de inflexión. Descenso: Hay tres tipos de fuerzas que actúan sobre el gusano hasta que el gusano llega al punto de cambio de tendencia: la gravedad, la fricción, la flotabilidad y de empuje (figura 6a). La fuerza neta es igual a la suma vectorial de las tres fuerzas. Aquí consideramos sólo las componentes verticales: F Ny = F + Dy F Ty-F g + F B (4) donde F B es la fuerza de flotabilidad. F g es igual en magnitud pero de dirección opuesta a la fuerza de flotabilidad suponiendo que la densidad del gusano es la del agua. La ecuación. 4 entonces se puede escribir de la siguiente manera: F Ny = F + Dy F Ty (5) F Ny se mantiene constante durante el descenso. Esto implica queF Dy + F Ty permanece constante hasta el nematodo alcanza el punto de cambio de tendencia. F Dy es más grande en la parte superior, que es el comienzo de la trayectoria, y se reduce gradualmente a cero hasta que la velocidad es cero en el punto de entrega mientras que F Ty debe aumentar para mantener F Ny constante. Turnaround: No hay fuerza de arrastre en la dirección vertical en el punto de cambio de tendencia ya que la velocidad vertical es igual a cero en ese punto. Las únicas fuerzas que actúan en la dirección vertical son la gravedad, - F G, flotabilidad, F B y el gusano de empuje vertical, F Ty, tal como se representa en la Figura 6b. En este punto, el empuje de la C. elegans se pueden determinar: F Ty = F Ny (6) El empuje en la parte inferior de la trayectoria es entonces aproximadamente igual a 0,33 pN, que es de aproximadamente 0,001% del peso del gusano. Teniendo encuenta que el peso estimado, F g de una C. elegans es de 28 nN, Ascenso: Del mismo modo, durante el ascenso, la resistencia aumenta, pero se apunta hacia abajo (Figura 6c): F Ny = Dy-F + F Ty (7) El empuje aplicado por el gusano debe ahora ser incluso más grande y ser igual a la suma de la fuerza de arrastre y el peso. El gusano se está desacelerando después de empezar a nadar. Para nadar a la misma velocidad como el gusano descendió, el gusano tendría que ejercer un empuje hacia arriba de por lo menos dos veces su peso. Al pasar Un ejemplo de un gusano que se ralentiza su descenso durante aproximadamente 3 segundos se presenta en la Figura 7. &#160; Un polinomio grado 3 rd es un ajuste razonable para la trayectoria general. Los errores en la aceleración y la velocidad de este ajuste son menos de 15%. El gusano comienza con un UPWA significativard empuje, se ralentiza y empieza a girar en torno a 68 segundos; Sin embargo, la aceleración hacia arriba disminuye continuamente (Figura 8) &#160; hasta que la aceleración neta es igual a cero alrededor de 68,5 seg. Esto a la larga conduce a una aceleración neta en la dirección hacia abajo seguido por otro punto cero en la velocidad (Figura 9) &#160; y el nematodo comienza a descender de nuevo en 69 seg. Es interesante que la aceleración vertical máxima observada en este caso es 2,7 mm / s 2. La aceleración en los puntos de inflexión son 0.455 mm / seg y 2 - 0.455 mm / s 2, respectivamente; aproximadamente cuatro veces mayor que en el caso del nematodo que se da la vuelta y nada hacia arriba. Usando la ecuación. 6, se puede estimar que el empuje hacia arriba es de aproximadamente 1,32 pN en el primer punto de inflexión. En el segundo punto de giro, la aceleración neta es negativa para que el empuje hacia arriba es 1,32 pN. o: páginas together.within-keep = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig1.jpg" /> Figura 1. Montaje experimental. El láser, expansor de haz, la lente y la pantalla son esenciales para la configuración experimental. Los espejos de orientación y puntos de aguja pueden omitirse, pero hará que la alineación óptica menos estable. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig2.jpg" /> Figura 2. Longitud de onda única sombra de la imagen (SWSI). Usando 2 mW de 543 nm de luz láser a la sombra de un gusano se proyecta sobre una pantalla. La imagen se invierte de manera que el nematodo aparece a caer hacia arriba. 424/51424fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Vertical descenso de un solo tipo salvaje C. elegans en una columna de agua. Este nematodo fue ensombrecida por la luz coherente de 633 nm. La pendiente del ajuste lineal indica una velocidad descendente de 1,09 mm / s ± 0,01 mm / seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig4.jpg" /> Figura 4. Gráfico Desplazamiento de una sola alza de natación de tipo salvaje C. elegans. Dos ataques estriados trazan la trayectoria global del nematodo. El segundo derivado del ajuste revela la aceleración. La aceleración máxima se determina fácilmente a partir de la primera ajuste: 0,110 mm<html> / Seg 2 ± 0,002 mm / s 2. Sólo un par de barras de error se muestran de manera que los puntos de datos y el ajuste permanecen visibles. Este nematodo fue ensombrecida por la luz coherente de 633 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig5.jpg" /> Gráfico de la figura 5. Aceleración de un solo tipo salvaje C. elegans. Este nematodo mantiene una aceleración hacia arriba constante de 0,110 mm / s 2 ± 0,002 mm / s 2 haciendo que se reduzca la velocidad y luego mueva hacia arriba. Poco después de que el punto de inflexión de la aceleración disminuye de forma constante y la aceleración neta disminuye a cero.<html> g &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig6.jpg" /> Diagramas de la Figura 6. Fuerza para el descenso, el punto y el ascenso. Flotabilidad y la gravedad de giro son iguales en magnitud y opuestas en dirección, de manera que el efecto de estas fuerzas se anulan entre sí. Por tanto, no se muestran en estos diagramas. (A) El gusano está descendiendo con un simple arrastrar y empuje hacia arriba. (B) El gusano se encuentra en el punto más bajo de la trayectoria sin arrastre. El empuje es hacia arriba. (C) El gusano es ascendente con un simple arrastrar hacia abajo, mientras que el empuje es hacia arriba. &quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Desplazamiento del gráfico único nematodo flotando. El gusano se ralentiza y empieza a dar la vuelta en unos 68 segundos, pero comienza a descender alrededor de 69 seg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig8.jpg" /> .. Figura 8 graph Aceleración de un solo nematodo cierne Este gusano comienza con una aceleración hacia arriba de 2,7 mm / s 2, se reduce a cero y, finalmente, tiene una aceleración hacia abajo de -. 2.6 mm / seg 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig8highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para conocer el vers grandes</a>ión de esta figura. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424fig9.jpg" /> Figura 9. Gráfico Velocidad de un solo nematodo flotando. Este gusano se haya detenido a los 68 segundos y comienza a dirigirse hacia arriba, se ralentiza y alcanza velocidad cero en la dirección vertical en 69 segundos seguido de un descenso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51424/51424fig9highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <img alt="Tabla 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51424/51424table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51424/51424table1.jpg" width="400" /> Tabla 1. Velocidades promedio de descenso de N2 C. elegans. 50 en vivo y 50 nematodos muertas se tracked durante su descenso. La velocidad media para los descensos es el mismo para el vivo y los gusanos muertos: 1,5 mm / s ± 0,1 mm / seg.

La técnica presentada aquí mide el camino de nadar libremente especies microscópicas utilizando exposición única longitud de onda. C. elegans se utilizan para demostrar sombra de formación de imágenes como una alternativa económica a los microscopios costosos. Esta técnica se puede adaptar para acomodar varias orientaciones, entornos y especies para medir la dirección, la velocidad, la aceleración y fuerzas.

Longitud de onda única Shadow Imaging de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion incluida la fuerza Estimaciones

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

El objetivo general de este procedimiento es medir y evaluar la velocidad del trayecto vertical y las fuerzas ejercidas por un nematodo nadando libremente mediante el uso de radiación coherente monocromática. Esto se logra primero configurando un experimento de sombra coherente monocromática para el gusano marino elegans nadando libremente. Luego, un individuo adulto de elegans marino se coloca en la cámara de observación del experimento de sombra, que es un vet.La sombra del gusano al descender a través del haz láser se registra como una película, y esta película se utiliza para analizar el movimiento del animal. Por lo tanto, se determina la trayectoria de un nematodo nadando libremente y las fuerzas asociadas generadas. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la microscopía tradicional en un plano horizontal, es que el movimiento de microorganismos nadando libremente puede investigarse utilizando una amplia gama de luz monocromática a bajo costo.Este método puede responder preguntas clave sobre las fuerzas generadas por nematodos o a las que responden en un entorno líquido. Tuvimos la idea de este método cuando comenzamos a explorar por primera vez la idea de movimiento vertical para especies microscópicas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del procedimiento son difíciles de aprender porque se requiere cierta práctica para lograr una alineación correcta del láser.Además, se necesita cierto tiempo en el laboratorio biológico para aprender cómo preparar los gusanos, armar el montaje experimental para crear imágenes de sombra. Utilice dos o más espejos para dirigir el láser de helio-neón hacia el expandidor de haz galileano, donde debe aumentar hasta 12 milímetros. Coloque uno o dos orificios de alfiler en la trayectoria del haz para asegurar su alineación procedente del expandidor.Oriente el haz hacia un cuarzo Q montado. Después de que el haz pase, el cuarzo Q lo amplifica utilizando una lente plano-convexa con una longitud focal positiva de 75 milímetros. Luego, coloque una pantalla aproximadamente a 120 centímetros de la lente, que es la distancia de resolución óptima.Coloque una cámara de alta velocidad de forma que pueda capturar la imagen de la pantalla, por ejemplo, junto al Q vet. También debe haber un microscopio estereoscópico cerca del qve para recoger los gusanos. Sujete temporalmente una regla transparente con divisiones en milímetros en el centro del soporte QVAD sobre la pantalla, cerca del borde del campo de visión de la cámara.Utilice las líneas de la regla para marcar la distancia de escala de un milímetro. Haga esto para cada longitud de onda utilizada, ya que la refracción variará debido a las aberraciones cromáticas en el QV y a los cambios en la ampliación descritos anteriormente. En JoVE, tenga listos nematodos adultos jóvenes para el qve.También tenga preparados nematodos muertos debido a la exposición al cloroformo. Comience llenando el Q Vet con agua destilada hasta un milímetro del borde. Inicie una grabación con las luces del cuarto encendidas, de modo que la línea en la pantalla sea inicialmente visible, y luego apague las luces del cuarto.Luego, recoja un nematodo con una aguja de platino. Es importante colocar los gusanos en el vet al tocar ligeramente la aguja sobre la superficie del agua sin agitar el medio. La imagen proyectada del gusano y de la columna de agua está invertida.Los gusanos que descienden con la gravedad parecerán moverse hacia arriba en la pantalla. Registre aproximadamente 20 segundos por gusano y registre unos 50 gusanos por condición. Primero, importe el video al programa de análisis de video.Establezca la escala utilizando las marcas de longitud en el video para determinar el factor de magnificación. Luego, comience a rastrear el desplazamiento lineal de la cabeza del nematodo sombreado. Seleccione al menos 10 puntos de datos a lo largo del recorrido, uno cada 0,3 segundos aproximadamente.La velocidad vertical se calcula entonces a partir de la derivada dividida por el factor de magnificación. Es fundamental crear curvas separadas para el desplazamiento horizontal y el desplazamiento vertical. Dado que la gravedad solo actúa en la dirección vertical.Si los puntos de datos forman una línea generalmente recta, la trayectoria es lineal. Algunas desviaciones del movimiento de la cabeza pueden ignorarse. A continuación, en el menú de análisis, cree una línea de regresión lineal ajustando una línea recta a los datos.La pendiente de la línea es la velocidad vertical del gusano. Si un gusano se mueve de forma no lineal, seleccione ajuste de curva en el menú de análisis. A continuación, ajuste la curva a un orden segundo o tercero.Polinomio para cada curva en la trayectoria que ajusta una curva a los datos. Al deslizar los corchetes en cada lado de la gráfica, se presenta la expresión matemática de la curva. Un error relativo de hasta 15 % aquí es aceptable.Agregue curvas adicionales según sea necesario para cubrir los puntos de datos e intente unir las funciones mediante interpolación suave. Los ajustes de curva deben tener la misma pendiente en las regiones donde se superponen. La primera y segunda derivada de la curva proporcionan la velocidad y la aceleración.El empuje se calcula utilizando tres microgramos como la masa del gusano durante la deriva; no hubo una diferencia distinguible en las tasas de descenso entre los ejemplares vivos y muertos de *C. elegans*. La tasa de deriva descendente para ambos fue de 1,5 milímetros por segundo. Sin embargo, los nematodos vivos son capaces de cambiar de dirección y nadar contra la gravedad; se ajustan curvas al desplazamiento vertical del nematodo y se calcula la aceleración a partir de sus segundas derivadas.Las fuerzas que actúan sobre el gusano hasta que este alcanza el punto de retorno son la gravedad, la resistencia, la flotabilidad y el empuje. La fuerza neta equivale a su suma vectorial. Considere las componentes verticales de la fuerza.La fuerza gravitacional es igual en magnitud a la fuerza de flotación, suponiendo que el gusano tiene una densidad aproximadamente igual a la del agua, por lo que la ecuación puede simplificarse hasta el punto de giro. La suma de la resistencia y el empuje es constante. Inicialmente, la resistencia es mayor, pero disminuye gradualmente hasta cero mientras que el empuje aumenta; en el punto de giro, no hay resistencia vertical y el empuje apunta hacia arriba durante el movimiento del gusano.El arrastre de ascenso vertical aumenta en dirección descendente, por lo que la fuerza de empuje debe ser mayor que el arrastre más el peso. Se analizó la trayectoria no lineal de este gusano. Cambió de dirección.Al observar su desplazamiento, se desaceleró y comenzó a invertir su dirección a los 68 segundos. Sin embargo, la aceleración hacia arriba disminuyó continuamente hasta que la aceleración neta alcanzó cero a los 68,5 segundos. Luego, comenzó a acelerarse en la dirección negativa para descender nuevamente.Por lo tanto, cuando la velocidad era cero, el gusano presentaba un empuje ascendente significativo, calculado en 1,32 piconeutonios. Una vez dominado, los datos pueden obtenerse en menos de 10 minutos si los gusanos están listos para ser retirados del tornillo sinfín. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener constante la frecuencia de grabación de la cámara para todos los datos registrados, ya que necesitamos ajustar la velocidad de cuadros en el programa de análisis de video tras seguir este procedimiento. Mediante este método, pueden realizarse otros estudios, como estudios de longitud de onda única, para responder preguntas como qué fuerzas se ejercen en distintas direcciones, vertical y horizontal.Por ejemplo, esta técnica óptica podría ser utilizada por otros biólogos interesados en las propiedades de locomoción de organismos pequeños como Proti u otros organismos acuáticos. Después de ver este video, deberían tener una buena idea de cómo analizar el movimiento de microorganismos que nadan libremente utilizando la ampliación de imágenes de sombra y luego un programa de análisis de video.

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