Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los vasos sanguíneos en construcciones de ingeniería tisular. Esto se logra mediante la creación de un defecto cutáneo completo estandarizado en la parte posterior de los ratones. A continuación, se implanta una muestra del material de ingeniería tisular en el defecto de la piel.

Luego, al final del tiempo de observación, el material se implanta y se coloca en un dispositivo de iluminación trans. Por último, las fotos de alta resolución de la red vascular se adquieren con una cámara digital estándar. En última instancia, la red de buques se analiza mediante segmentación y cuantificación digital utilizando el software de la herramienta Vest egg.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes como la microscopía, la tomografía computarizada o la resonancia magnética, es que permite una visualización y cuantificación efectiva de los procesos vasculares dentro de los biomateriales enfocando todos los nuevos vasos funcionales. Este método puede proporcionar información sobre la vascularización de los materiales de reemplazo dérmico. También se puede aplicar a otros organismos modelo o para estudiar la vascularización en otros órganos.

Para comenzar, use punzones de biopsia de 12 milímetros para generar muestras de andamios, como de materiales de reemplazo dérmico bovinos, a base de colágeno cortados en piezas de malla de tetina redondas de 14 milímetros de diámetro para colocarlas debajo de cada andamio. Después de anestesiar a un ratón, verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie y retire el pelaje de la espalda de acuerdo con el protocolo de texto. Coloque al animal en posición prona y use un bolígrafo permanente de punta fina para marcar la línea media de la espalda del ratón.

Defina un área de escisión que no esté demasiado lejos para evitar que el animal retire el andamio. Con un punzón de biopsia de 10 milímetros, cree defectos bilaterales redondos forzando cuidadosamente el punzón contra la piel. Para delinear el área de escisión con pinzas, levante suavemente la piel marcada y use unas tijeras quirúrgicas para hacer una incisión a lo largo del círculo marcado.

Si se produce sangrado, use una gasa estéril para comprimir cuidadosamente el área y hacer espacio para la malla del Titanic. Extienda la separación de la piel y el tejido subyacente en el borde de la herida y de dos a cuatro milímetros adicionales. Coloque la malla en el defecto directamente sobre el lecho de la herida y debajo de los bordes de la herida.

A continuación, coloque los andamios directamente sobre la malla. Use de cuatro a seis nudos simples para suturar el andamio, de modo que los bordes adyacentes se enrollen dejando los bordes ligeramente sobre el andamio. A continuación, sutura un apósito transparente sobre los defectos para proteger el andamio y permitir el seguimiento de la zona de la herida.

Evaluar, valorar diariamente el estado general del animal mediante el seguimiento de la actividad motora, el peso corporal, los signos de dolor, la tolerancia al vendaje y la automutilación. Además, controle el área de la herida para detectar signos de sangrado, locales y sistémicos de infección y la posición del apósito. Después de sacrificar al animal en el momento deseado.

De acuerdo con el protocolo de texto, use un marcador permanente para marcar el sitio de escisión que incluye los andamios. Use un par de tijeras o un bisturí para incidir la piel a lo largo de las líneas marcadas a través de una escisión roma, separe toda la piel, incluidos los andamios y la malla del tejido subyacente, coloque un tejido estirado boca abajo en una placa de Petri. Para visualizar la muestra, colóquela sobre un dispositivo de iluminación trans.

En el modo macro, tome fotografías de los andamios completos y de áreas de igual tamaño de piel normal y almacene las imágenes en formato TIFF para su posterior análisis digital. Después de descargar el software de la herramienta ves EQ, abra una imagen y seleccione una región de interés para el análisis presionando la tecla de retroceso. A continuación, pulse invertir.

Para visualizar la red vascular en blanco, elija la imagen, el realce de los vasos, el filtro, la histéresis, el umbral, la transformación del sombrero de copa, y calcule el realce de los vasos en todos los pasos anteriores. Desplácese para acercar y alejar la imagen. Segmente el mapa de embarcaciones seleccionando el primer umbral o cobertura de embarcaciones para que cada píxel que sea remotamente similar a una embarcación se etiquete como una embarcación.

Presione calcular. Para obtener una vista previa de la selección, seleccione el segundo umbral o la cobertura de fondo para que solo los píxeles que son particularmente similares a los recipientes se etiqueten como recipientes. Para calcular la longitud de los recipientes y el área total cubierta por ellos, haga clic en imagen, estadísticas de imagen y estadísticas de imagen binaria.

La longitud de los vasos se estima mediante el adelgazamiento previo de la red vascular a un píxel de ancho. Para ello, vaya a los filtros morfológicos de la imagen y al esqueletizado antes del cálculo. La relación entre el área del recipiente y la longitud del recipiente da un valor para el tamaño del recipiente en la región de interés.

Si es necesario, elimine los artefactos seleccionando solo los recipientes de interés. Al hacer clic en el modo de selección, presione la tecla de retroceso para copiar las embarcaciones seleccionadas en una nueva imagen. Finalmente, analizar el área de la piel nativa bajo los mismos parámetros que un andamio, asignando un valor de 100% al tejido nativo y relacionar el andamio con ese valor.

Por ejemplo, si el porcentaje de píxeles blancos es del 30% en el tejido normal y del 15% en el andamio, esto representa una vascularización del 50% del área total del andamio. Tenga en cuenta que los valores corresponden a toda el área de la imagen. Por lo tanto, es necesario corregirlo al área de la región seleccionada como se muestra aquí.

Dos semanas después de la implantación del tejido, la iluminación trans permitió una visualización clara de estructuras vasculares de hasta 30 micrómetros de ancho en una muestra de tejido completo que incluía tanto tejido nativo como andamios implantados. Utilizando la segmentación digital para analizar el tejido explantado, se observaron niveles de vascularización de 62,28 más o menos 8,6% en el andamio en comparación con la piel nativa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar crear defectos cutáneos completos reproducibles y fijar el biomaterial de forma fiable a la herida.

Después de este procedimiento, el tejido expandido se puede utilizar para análisis posteriores, como la histología o la expresión de ARN y proteínas.