Name: Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la vascularización en constructos de ingeniería de tejidos utilizando un modelo de defecto cutáneo estandarizado en ratones. Este método ofrece una alternativa rentable y eficaz para evaluar redes vasculares in vivo.

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Integra plantilla de regeneración dérmica fue proporcionado amablemente por Integra LifeSciences Corporation. Fuentes de fondos de apoyo a la obra: Este trabajo fue parcialmente financiado por el Premio CIRM-BMBF Early Traslacional II y el Centro FONDAP de regulación del genoma tanto a JTE (Nr 15090007.).

1 Preparación de andamios <ol><li> Generar muestras de los andamios utilizando 12 mm punzones biopsia. </li><li> Para introducir moléculas bioactivas o células en el andamiaje, la fuga de los andamios, apretando suavemente con una gasa estéril. Entonces rehidratar los andamios mediante la adición de 160 l de una solución que contiene las moléculas bioactivas o células de interés. Compruebe el éxito de bioactivación con las células a través de ensayos metabólicos como MTT ensayos. </li><li> Si es necesario, fijar los compuestos o células a ensayar en el interior del andamio mediante la entrega de ellos, por ejemplo en una solución de fibrina-trombina o un hidrogel, de nuevo a través de la rehidratación como se describe en el paso 1.2. NOTA: Este paso puede ser de utilidad cuando los compuestos o células no se adhieren mecánicamente al material. También se puede controlar la dinámica de liberación de los compuestos .. </li><li> Preparar las mallas titanizado, que serán colocados en cada andamio en cada grupo experimental y el control, por cutting trozos de forma redonda, de aproximadamente 14 mm de diámetro. NOTA: La malla titanizado funciona como una frontera física necesaria para delimitar el tejido regenerado del lecho de la herida. </li></ol> 2. Animales <ol><li> Antes de la implementación del modelo presentado, consulte las leyes de protección animal correspondientes y obtener el permiso de las autoridades locales. En este trabajo, todos los experimentos se realizaron con ratones, de acuerdo con la actual ley de bienestar animal alemán y aprobados por el Gobierno del Distrito de la Alta Baviera (Regierung von Oberbayern). </li><li> Elija cuidadosamente el animal y la tensión. Aunque el modelo se estableció para los ratones, que se puede traducir a otros animales comunes, tales como ratas, conejos o cerdos. </li><li> Si estás trabajando con animales de pelo, afeitarse la parte posterior de los animales antes de la implantación de los andamios. NOTA: Este trabajo utiliza ratones de 6 a 8 semanas de edad con un peso corporal entre 20 gy 25 g, sin embargo diferentes edades y bpesos ody también se pueden utilizar. </li></ol> 3. Anestesia <ol><li> Llevar a cabo la operación en condiciones estériles. Con el fin de mantener la temperatura normal del cuerpo del animal, utilizar una estera de calentamiento. </li><li> Antes de la inhalación de anestesia a los animales reciben buprenorfina a una dosis de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea cada 8 horas. </li><li> Colocar el animal bajo anestesia por inhalación (isoflurano) o aplicar procedimientos estándar equivalentes. Confirme la anestesia, ya sea apretando suavemente los dedos del pie del animal oa través de un pliegue cutáneo. </li><li> Para evitar exsiccosis, inyectar 0,5 ml por vía subcutánea solución salina fisiológica al comienzo de la operación. </li></ol> 4. La escisión de la piel <ol><li> Colocar el animal en posición prona y marcar la línea media de la espalda del ratón con un bolígrafo de punta fina permanente (Figura 1A). </li><li> Defina el área de la escisión. Coloca los defectos en el área mostrada en Figure 1C. Tenga en cuenta que si los defectos se colocan demasiado caudal, los animales son más propensos a retirar los apósitos y los andamios. </li><li> Crear ronda defectos bilaterales usando un punzón de biopsia de 10 mm (Figura 1B). El punzón debe ser cuidadosamente forzado contra la piel y no debe ser utilizado para cortar completamente a través de la piel, pero para delinear el área de la escisión (Figuras 1C y 1E). </li><li> Levantar suavemente la piel marcada con una pinza y una incisión a lo largo del círculo marcado con unas tijeras quirúrgicas finas (Figura 1F). En caso de hemorragia, comprimir cuidadosamente con una gasa estéril. Una descripción paso a paso de la escisión se muestra en la Figura 1. NOTA: El defecto se crea con un punzón más pequeño que el de la generación de los andamios, para compensar la ampliación del defecto debido a la elasticidad de la piel. </li></ol> 5. Andamios Implantación <ol><li> Con el fin de hacer espacio para la titazada malla, extender la separación de la piel y el tejido subyacente en las fronteras de la herida de 2-4 mm (Figura 2A). </li><li> Coloque el titanizado de malla en el defecto directamente en el lecho de la herida y bajo los bordes de la herida (Figuras 2A y B). </li><li> Lugar andamios directamente sobre la malla. </li><li> Suturar los andamios a los bordes de la herida adyacentes con 4 a 6 nudos individuales, dejando los bordes ligeramente en el andamio (Figura 2C). NOTA: Evite el uso de suturas biodegradables. </li><li> Suturar una herida apósito transparente por encima de los defectos para proteger el andamio al tiempo que permite el seguimiento de la zona de la herida (Figura 2D). </li></ol> 6. Cuidado Postoperatorio <ol><li> Mantenga un ratón por jaula para evitar la manipulación mutua del vestidor y andamios. </li><li> Evaluar el estado general del animal sobre una base diaria por la observación de la actividad del motor, el peso corporal, signos de dolor, la toleranciaal vestidor y auto-mutilación. También supervisar el área de la herida para el sangrado, local y signos sistémicos de infección y la posición del apósito. </li><li> Con el fin de minimizar el dolor del animal, inyectar buprenorfina diaria en una dosis de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal o la medicación analgésica equivalente. </li><li> Si el ratón elimina o daña el vendaje de la herida, reemplazar o volver a instalarlo bajo anestesia. </li></ol> 7. Eutanasia y explantación del andamio <ol><li> En los puntos de tiempo deseados, sacrificar los animales por sobredosis de pentobarbital (150 mg / kg). </li><li> Marque el sitio de escisión de la piel con un marcador permanente, que debe incluir los andamios y la mayor cantidad de ratón de nuevo la piel como sea posible (Figura 3A). </li><li> Incisión en la piel a lo largo de las líneas marcadas con un par de tijeras o un bisturí. Separar la totalidad de la piel, incluyendo los andamios y la malla titanizado, desde el tejido subyacente a través de la preparación romo (Figura 3B). </li><li> Coloque el tejido explantado tendido en una placa de Petri (Figura 3C y D) </li></ol> 8. visualización y cuantificación de la Red Vascular <ol><li> Transiluminación: <ol><li> Configurar un dispositivo de transiluminación, mediante el montaje de una placa de Petri encima de una fuente intensa de luz blanca (100 vatios bombilla estándar). </li><li> Fijar una cámara digital por encima del transiluminador para obtener imágenes digitales. </li><li> Colocar las muestras en posición invertida sobre la placa de Petri sobre el dispositivo de transiluminación. </li><li> Tome fotos de los andamios completos en modo macro, así como de las áreas de igual tamaño de la piel normal. Guarde las imágenes en un formato TIFF para su posterior análisis digital. </li><li> Guarde el tejido para su posterior análisis bioquímicos o histológicos. </li></ol></li><li> Segmentación digital y cuantificación: <ol><li> Descargue e instale el software VesSeg-Herramienta, que se puede obtener free de forma gratuita en: <a href="http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&amp;L=2%255">http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&amp;L=2%255</a> . </li><li> Abra la imagen con el software VesSeg-Herramienta. </li><li> Seleccione el área de la imagen cubierta por el andamio para el análisis digital (imagen → Select). </li><li> Para aumentar el contraste de los vasos utilizar la opción &quot;umbral de histéresis&quot; (Imagen → mejora Vessel filtro → Histéresis de umbral → Top-Hat transformación → mejora buque Calcular). </li><li> Proceda con la segmentación del mapa buque (las fronteras de imagen → mejora Vessel filtro → → umbral Histéresis de umbral). Seleccione el primer umbral (&quot;cobertura de buques&quot;), por lo que cada píxel, que es ni remotamente buque similar, será etiquetado como recipiente. Seleccione el segundo umbral (&quot;cobertura de fondo&quot;), por lo que sólo aquellos píxeles que son particularmente buque similar será etiquetado como vasos. </li><li> Compruebe la propuesta automática segmentación manualmente añadir buques no capturados y eliminar estructuras falsos positivos comunes, que generalmente son largas y delgadas estructuras, como los vasos tales como pelos o suturas. </li><li> Calcular la longitud de los vasos y el área total cubierta por los buques (estadísticas de imagen → Imagen → Estadísticas imagen binaria). NOTA: Para el cálculo de las longitudes de los vasos, vasos en el mapa buque resultante se adelgazan a las líneas con un ancho de un pixel 20. </li></ol></li><li> Analizar el área de la piel nativa bajo los mismos parámetros que los andamios, la asignación de un valor de 100% para el tejido nativo y se refieren al cadalso a ese valor. Por ejemplo, si el porcentaje de píxeles blancos es 60% en el tejido normal y 30% en el andamio, representaría una vascularización 50% del andamio. Nota: La cobertura vasos blanco se asigna al área de un cuadrado alrededor del andamio. Ajuste el número de píxeles blancos consi coberturaDering que el área del círculo es significativamente menor (π x R 2) que el cuadrado (4 x R 2). </li></ol>

<ol><li>Rahaman, M. N., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+composite+tissue+constructs+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine.</a> Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioartificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Bioartificial skin.</a> Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).</li>
<li>Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+tissue+engineering+for+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).</li>
<li>Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+vascularization+of+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategies for vascularization of polymer scaffolds.</a> Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).</li>
<li>Laschke, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+tissue+engineering%3A+breathing+life+into+constructed+tissue+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes.</a> Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).</li>
<li>Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+scaffolds+for+skin+wound+healing+and+dermal+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).</li>
<li>Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+regeneration+in+a+canine+cranial+model+using+allogeneic+adipose+derived+stem+cells+and+coral+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold.</a> Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).</li>
<li>Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+evaluation+of+nanoparticles+for+directed+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering.</a> International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).</li>
<li>Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-collagen+scaffolds+with+nano%2Fmicrofibrous+architecture+for+skin+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+knitted+mesh-reinforced+collagen-chitosan+hybrid+scaffold+in+the+one-step+repair+of+full-thickness+skin+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats.</a> Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).</li>
<li>Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+dermal+wound+healing%3A+biomedical+device+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches.</a> Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).</li>
<li>des Rieux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+systems+delivering+VEGF+to+promote+angiogenesis+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering.</a> Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).</li>
<li>Reckhenrich, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivation+of+dermal+scaffolds+with+a+non-viral+copolymer-protected+gene+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector.</a> Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Key+Regulatory+Roles+of+the+PI3K%2FAkt+Signaling+Pathway+in+the+Functionalities+of+Mesenchymal+Stem+Cells+and+Applications+in+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).</li>
<li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+progenitor+cells+in+prevascularized+bone+tissue+engineering%3A+development+of+heterogenous+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+and+angiogenesis+of+tissue-engineered+bone+constructed+by+prevascularized+%CE%B2-tricalcium+phosphate+scaffold+and+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).</li>
<li>Cuadra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+results+of+burned+hands+treated+with+Integra%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Functional results of burned hands treated with Integra.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).</li>
<li>Wilcke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF%28165%29+and+bFGF+protein-based+therapy+in+a+slow+release+system+to+improve+angiogenesis+in+a+bioartificial+dermal+substitute+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo.</a> Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).</li>
<li>Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).</li>
<li>Danner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+sweat+gland-derived+stem+cells+for+enhancing+vascularization+during+dermal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).</li>
<li>Shaterian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+Time+Analysis+of+the+Kinetics+of+Angiogenesis+and+Vascular+Permeability+in+an+Animal+Model+of+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing.</a> Burns. 35 (6), 811-817 (2009).</li>
<li>McDonald, D. M., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+angiogenesis%3A+from+microscope+to+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic.</a> Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).</li>
<li>Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+vascular+injection+techniques+for+the+study+of+perforator+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).</li>
<li>Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+intussusceptive+capillary+growth+in+the+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo.</a> Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).</li>
<li>Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+skinfold+chamber+technique+for+intravital+microscopy+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice.</a> American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).</li>
<li>Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+studies+on+the+microvasculature+of+transplanted+islets+of+Langerhans+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+microcirculation%2C+clinical+and+experimental%22%5BJournal%5D)">A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo.</a> International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).</li>
<li>Laschke, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+are+potent+initiators+of+blood+vessel+formation+in+porous+polyurethane+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds.</a> Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).</li>
<li>Egaña, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+mesenchymal+cells+to+improve+vascularization+in+a+mouse+model+for+scaffold-based+dermal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration.</a> Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).</li>
<li>Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).</li>
<li>Egaña, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+method+to+visualize+and+quantify+vascular+networks+in+native+and+tissue+engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin.</a> Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).</li>
</ol>

Declaración de conflicto de intereses: Todos los autores: Ninguno Divulgación de información financiera: Ninguno de los autores tiene un interés financiero en cualquiera de los productos, dispositivos o medicamentos mencionados en este manuscrito.

Hay una necesidad de establecer enfoques eficaces en la mejora de la perfusión sanguínea en construcciones de ingeniería tisular, lo que exige el desarrollo de nuevos métodos fiables para estudiar los procesos de vascularización dentro de los biomateriales. Los métodos comunes para hacer visible la vascularización andamio ex vivo incluyen el uso de la microscopía, que proporciona una herramienta de alta resolución. En la mayoría de los casos, sin embargo, este método está limitado al análisis de pequeñas áreas ...

En las últimas décadas, la ingeniería de tejidos ha abierto una nueva opción terapéutica para reemplazar defectos de tejidos con células del propio cuerpo 1. Con el fin de apoyar el proceso fisiológico de la regeneración de tejidos, andamios están diseñados como una estructura biodegradable, que proporciona un escenario en el que las células de la lecho de la herida pueden crecer y restaurar el defecto de 2,3. Vascularización insuficiente se considera que es el principal obstáculo, que retiene el avance clínico de andamios bioartificiales 4. Con el crecimiento hacia el interior de las células, la demanda de nutrientes y oxígeno aumenta y vascularización del material se convierte en esencial. Por lo tanto, la vascularización insuficiente o tardía puede llevar a necrosis central de productos de ingeniería tisular 5. Además, los vasos sanguíneos proporcionan células inmunocompetentes y eliminar los residuos metabólicos en la zona de regeneración. Las tasas de infección altas y bajas de regeneración son sóloalgunas de las consecuencias de la perfusión insuficiente de sangre observados en la ingeniería de tejidos, que tienen por objeto que se estén produciendo por el aumento de la vascularización de los andamios de 6,7. Varias estrategias encaminadas a mejorar la vascularización foco en el papel clave de la propia biomaterial y la microestructura del andamio. Hay esfuerzos de investigación intensiva para desarrollar nuevos enfoques en el cambio del proceso de curación de la reparación a la regeneración, por lo tanto (re) generar un tejido con las propiedades fisiológicas más cercanas a la de ser restaurados 8,9. Biomateriales que fueron estudiados y evaluados en cuanto a su potencial de regeneración incluyen colágeno, fibrina, quitosano y alginato 10,11. Estos biomateriales se pueden utilizar y combinar como columna vertebral para la construcción de nuevos andamios utilizando diferentes estrategias como descelularización tejido, auto-ensamblaje, prototipado rápido y electrospinning 12. Con el fin de ENHAnce propia capacidad de regeneración del cuerpo, los andamios se pueden bioactivados. La incorporación de factores de crecimiento angiogénico recombinante o gen 13 vectores que codifican para tales factores 14 ha demostrado mejorar la vascularización del andamio. El uso de células madre se ha demostrado ampliamente ser una estrategia prometedora para mejorar la vascularización, donde las células estromales mesenquimales y células progenitoras endoteliales han ganado la mayor atención 15,16. Otros enfoques intentan construir construcciones que contienen redes de vasos prefabricados antes del trasplante 17. A pesar de los intensos esfuerzos en el diseño de andamio y su bio-activación, ninguna estrategia ha mejorado la vascularización en un nivel clínicamente significativo y, con la excepción de los reemplazos dérmicos en las lesiones por quemaduras masivas, la traducción de los materiales de bioingeniería en la rutina clínica sólo está teniendo lugar vacilante 18 . Una de las razones por las que la vascularizaciónde construcciones de tejidos artificiales sigue siendo un problema sin resolver, es la dificultad para evaluar el éxito de las nuevas tecnologías en los enfoques in vivo. Aunque los experimentos in vitro pueden proporcionar importantes conocimientos sobre el potencial de la vascularización de los andamios, se requieren modelos animales apropiados para estudiar los parámetros clave tales como la biocompatibilidad del material, la seguridad y eficacia del tratamiento y, de particular importancia, la vascularización del tejido construir. Por lo tanto, herramientas fiables para visualizar y cuantificar redes de vasos sanguíneos in vivo son esenciales. En este estudio se presenta un método simple y fiable que permite la visualización y cuantificación de la red vascular en el interior andamios explantados. Este método se basa en la transiluminación del tejido y la segmentación digital. Dado que este método no es invasivo, permite nuevos análisis moleculares e histológicas del material objetivo.

<table><tbody><tr><td>Ethilon P-3 13 mm 3/8 círculo 5-0</td><td>Ethicon, Norderstedt, Alemania</td><td>698G</td><td>Ethilon polyamid-6 sutura de corte inverso de precisión en punto</td></tr><tr><td>Punzones de biopsia (10 mm)</td><td>Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, EE. UU</td>. <td>P1050</td><td></td></tr><tr><td>Punzones de biopsia (12 mm)</td><td>Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, EE. UU</td>. <td>P1250</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital&nbsp;</td><td>Ricoh, Hannover, Alemania</td><td>Cx1</td><td></td></tr><tr><td>Gazin Mullkompresse&nbsp;</td><td>Lohmann und Rauscher, Neuwied, Alemania</td><td>13622</td><td>Gasa estéril (10 cm x 10 cm)</td></tr><tr><td>Andamio de doble capa a base de colágeno (8' x 10')</td><td>Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, EE. UU</td><td>. 88101</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, gas líquido para anestesia inhalativa&nbsp;</td><td>Baxter, Unterschleissheim, Alemania</td><td>100196040</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital, 16 g / 100 ml</td><td>Fa. Merial, Hallbergmoos</td> Nuri Nu/Nu Ratones desnudos<td></td><td></td></tr><tr><td>, CrLNU-Foxn1nu</td><td>Charles River, Sulzfeld, Alemania</td><td>Código de cepa 088</td><td>Ratones desnudos atímicos, de 6 a 8 semanas de edad y con un peso corporal entre 20 y 25 g&nbsp;</td></tr><tr><td>Buprenorfina (0,3 mg/ml)</td><td>Essex Pharma GmbH, Múnich, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malla titanizada (15 cm x 15 cm), extraligera</td><td>PFM Medical AG, K&ouml; ln, Alemania</td><td>6000029</td><td></td></tr><tr><td>Tissucol Duo S Immuno 2 ml</td><td>Baxter Germany GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Alemania</td><td>B1332020110614</td><td>Solución de fibrina-trombina&nbsp;</td></tr><tr><td>Cortina adhesiva transparente (30,5 cm x 26 cm)</td><td>KCI Medical Products, Wimborne Dorset, Reino Unido</td><td>M6275009/10</td><td></td></tr></tbody></table>

una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de biomateriales<em&gt; en vivo</em

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularización insuficiente se considera que es uno de los principales factores que limitan el éxito clínico de construcciones de ingeniería tisular. Con el fin de evaluar nuevas estrategias encaminadas a mejorar la vascularización, se requieren métodos confiables para hacer la en-el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en los andamios visibles bioartificiales y cuantificar los resultados. En el último par de años, nuestro grupo ha introducido un modelo de defecto de la piel completa que permite la visualización directa de los vasos sanguíneos mediante transiluminación y ofrece la posibilidad de cuantificación a través de la segmentación digital. En este modelo, se crea quirúrgicamente defectos completos de la piel en la parte posterior de los ratones y las sustituye por el material ensayado. Moléculas o células de interés también se pueden incorporar en tales materiales para estudiar su efecto potencial. Después de un tiempo de observación de la propia elección de uno, los materiales se explantaron para su evaluación. Heridas bilaterales ofrecen la posibilidad de hacer comparaciones internas ªa minimizar los artefactos entre los individuos, así como de reducir el número de animales necesarios para el estudio. En comparación con otros enfoques, nuestro método ofrece un análisis simple, fiable y rentable. Hemos aplicado este modelo como una herramienta rutinaria para llevar a cabo el cribado de alta resolución cuando se prueba la vascularización de diferentes biomateriales y enfoques bio-activación.

Un defecto de la piel completa bilateral fiable se puede crear en el ratón (Figura 1) donde la piel puede ser reemplazado por un biomaterial en estudio (Figura 2). Aquí, no se observan complicaciones mayores durante o después del procedimiento quirúrgico, ni signos macroscópicos de infección o reacción de cuerpo extraño. En casos raros, un andamio se pierde cuando un ratón elimina. Contracción de la herida que nunca se observó (Figura 3). Transiluminación tejido permiti...

La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales<em&gt; En Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar los vasos sanguíneos en construcciones de tejido ingenierizado. Esto se logra creando un defecto estándar completo de piel en la espalda de ratones. A continuación, se implanta una muestra del material de tejido ingenierizado en el defecto cutáneo.Luego, al final del tiempo de observación, el material se implanta y coloca en un dispositivo de transiluminación. Finalmente, se obtienen fotografías de alta resolución de la red vascular mediante una cámara digital estándar. En última instancia, la red de vasos se analiza mediante segmentación digital y cuantificación utilizando el software Vest egg tool.La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía, la tomografía computarizada o la imagen por resonancia magnética es que permite la visualización y cuantificación efectivas en el tiempo y por causas de los procesos vasculares dentro de biomateriales, centrándose en todos los nuevos vasos funcionales. Este método puede proporcionar información sobre la vascularización de materiales de reemplazo dérmico. También puede aplicarse a otros organismos modelo o para estudiar la vascularización en otros órganos. Para comenzar, utilice punzones de biopsia de 12 milímetros para obtener muestras de andamios, como materiales de reemplazo dérmico a base de colágeno bovino, y corte piezas redondas de malla tetin de 14 milímetros de diámetro para colocar debajo de cada andamio. Después de anestesiar un ratón, verifique la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie y retire el vello de la espalda según el protocolo descrito en el texto. Coloque al animal en posición prona y utilice un rotulador de punta fina permanente para marcar la línea media de la espalda del ratón.Defina un área de escisión que no esté demasiado cerca de la línea media para evitar que el animal elimine el andamio. Utilizando un punzón de biopsia de 10 milímetros, cree defectos redondos bilaterales presionando cuidadosamente el punzón contra la piel. Para delimitar el área de escisión con pinzas, levante suavemente la piel marcada y use tijeras quirúrgicas para realizar una incisión siguiendo el círculo marcado.Si ocurre sangrado, use gasa estéril para comprimir cuidadosamente el área y crear espacio para la malla Titanic. Extienda la separación entre la piel y el tejido subyacente en el borde de la herida y otros dos a cuatro milímetros adicionales. Coloque la malla en el defecto directamente sobre el lecho de la herida y por debajo de los bordes de la herida.Luego coloque los andamios directamente sobre la malla. Utilice de cuatro a seis nudos simples para suturar el andamio, de modo que los bordes adyacentes de la herida queden ligeramente por encima del andamio. A continuación, sutúre un apósito transparente sobre las lesiones para proteger el andamio permitiendo al mismo tiempo el monitoreo del área de la herida.Evalúe el estado general del animal diariamente mediante el monitoreo de la actividad motora, el peso corporal, signos de dolor, tolerancia al vendaje y automutilación. Asimismo, controle el área de la herida en busca de sangrado, signos locales y sistémicos de infección, así como la posición del vendaje. Después de la eutanasia del animal en el momento deseado.Según el protocolo descrito, utilice un marcador permanente para marcar el sitio de escisión que incluye los andamios. Use un par de tijeras o un escalpelo para realizar una incisión en la piel a lo largo de las líneas marcadas mediante una escisión roma, separe completamente la piel, incluyendo los andamios y la malla, del tejido subyacente y coloque el tejido extendido boca abajo en una placa de Petri. Para visualizar la muestra, colóquela sobre un dispositivo de transiluminación.En modo macro, tome fotografías de los andamiajes completos y de áreas de tamaño equivalente de piel normal, y almacene las imágenes en formato TIFF para su posterior análisis digital. Después de descargar el software de la herramienta ves EQ, abra una imagen y seleccione una región de interés para el análisis presionando la tecla de retroceso. Luego, presione invertir.Para visualizar la red vascular en blanco, elija la imagen del filtro de realce de vasos, umbralización por histéresis, transformación sombrero superior y calcule el realce de vasos en todos los pasos anteriores. Desplácese para acercar y alejar la imagen. Segmentar el mapa de vasos seleccionando el primer umbral o la cobertura de vasos de manera que cada píxel que tenga incluso remotamente características de vaso sea etiquetado como un vaso.Pulse calcular. Para previsualizar su selección, elija el segundo umbral o la cobertura de fondo de manera que solo los píxeles que sean especialmente similares a vasos sean etiquetados como vasos. Para calcular la longitud de los vasos y el área total cubierta por ellos, haga clic en imagen, estadísticas de imagen y estadísticas de imagen binaria.La longitud del vaso se estima mejor previamente adelgazando la red vascular hasta un ancho de un píxel. Para ello, vaya a los filtros morfológicos de imagen y aplique esqueletización antes del cálculo. La relación entre el área del vaso y la longitud del vaso proporciona un valor para el tamaño del vaso en la región de interés. Si es necesario, elimine los artefactos seleccionando únicamente los vasos de interés. Al hacer clic en el modo de selección, presione la tecla de retroceso para copiar los vasos seleccionados en una nueva imagen. Finalmente, analice el área de piel nativa con los mismos parámetros que un andamio, asignando un valor del 100 % al tejido nativo y relacione el andamio con respecto a ese valor.Por ejemplo, si el porcentaje de píxeles blancos es del 30 % en el tejido normal y del 15 % en el andamio, esto representa una vascularización del 50 % del área total del andamio. Tenga en cuenta que los valores corresponden al área completa de la imagen. Por lo tanto, es necesario corregirlos según el área de la región seleccionada, como se muestra aquí.Dos semanas después del implante del tejido, la transiluminación permitió la visualización clara de estructuras vasculares de hasta 30 micrómetros de ancho en una muestra de tejido completo que incluía tanto tejido nativo como andamios implantados. Mediante el uso de segmentación digital para analizar la vascularización del tejido extraído, se observaron niveles de 62,28 ± 8,6 % en el andamio en comparación con la piel nativa. Al intentar este procedimiento, es importante recordar crear defectos cutáneos completos reproducibles y fijar de manera confiable el biomaterial a la herida.Tras seguir este procedimiento, el tejido expandido puede utilizarse para análisis adicionales, como histología o la expresión de ARN y proteínas.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se introduce un inmunohistoquímica todo el montaje y la microscopía confocal de barrido láser con múltiples etiquetas para analizar la formación de complejos de la red vascular de la piel del ratón extremidades embrionarias.

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

El objetivo de este protocolo es construir un equivalente de piel tridimensional de espesor completo, que se asemeje a la piel natural. Con un dispositivo de herida automatizado específicamente construido, se pueden generar heridas precisas y reproducibles bajo el mantenimiento de la esterilidad.

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

Hasta la fecha, los defectos de tejido grueso se reconstruyen típicamente mediante la aplicación de colgajos de tejido autólogo o tejidos de ingeniería. En este protocolo, presentamos un nuevo método para diseñar un colgajo de tejido vascularizado con un pedículo autólogo, para que sirva como sustituto de los colgajos autólogos.

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

Esta es una guía para construir tejido vascularizado in vivo utilizando un asa arteriovenosa microquirúrgica o una configuración de pedículo de flujo continuo dentro de una cámara de ingeniería de tejidos. Los tejidos vascularizados generados se pueden emplear para la regeneración de órganos y el reemplazo de defectos tisulares, así como para pruebas de medicamentos y modelado de enfermedades.

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

Se describe un enfoque microquirúrgico para la generación de un bucle arteriovenosa (AV) como un modelo para el análisis de la vascularización in vivo en un entorno aislado y bien caracterizado. Este modelo no sólo es útil para la investigación de la angiogénesis, pero también es adecuado de manera óptima para la ingeniería vascularizado axialmente y tejidos trasplantables.

El asa arteriovenosa (AV) en un modelo de pequeños animales para estudiar la angiogénesis e Ingeniería tejido vascularizado

Este video muestra un modelo para estudiar el desarrollo de la hiperplasia miointimal después de la cirugía de interposición venosa en ratas.

La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar la formación de vasos sanguíneos en vivo y en tiempo real en 3D andamios por microscopía multifotón. Angiogénesis en andamios modificados genéticamente fue estudiada en un modelo de defecto murino hueso calvarial de crítica. Más nuevos vasos sanguíneos fueron detectados en el grupo de tratamiento que en los controles.

Visualización de angiogénesis por microscopía multifotón En Vivo en modificados genéticamente 3D-PLGA/nHAp andamio para Calvarial críticos de la reparación del defecto óseo

Aquí, se describen dos modelos de cicatrización de heridas murinas, uno diseñado para evaluar las respuestas de cicatrización de heridas celulares y citoquinas y el otro para cuantificar la tasa de cierre de heridas. Estos métodos se pueden utilizar con modelos de enfermedades complejas como la diabetes para determinar los mecanismos de varios aspectos de la cicatrización deficiente de heridas.

Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

Presentamos un protocolo detallado para generar un modelo de xenoinjerto murino de malformación venosa. Este modelo se basa en la inyección subcutánea de células endoteliales derivadas del paciente que contienen mutaciones hiperactivantes de los genes TIE2 y/o PIK3CA. Las lesiones de xenoinjerto recapitulan estrechamente las características histopatológicas del tejido del paciente con VM.

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente para la malformación venosa

La meta de este protocolo es describir la generación y el análisis volumétrico de los equivalentes humanos vascularizados de la piel usando las técnicas accesibles y simples para la cultura a largo plazo. En la medida de lo posible, se describe la justificación de los pasos para permitir a los investigadores la capacidad de personalizar en función de sus necesidades de investigación.

Generación de equivalentes de piel humana vascularizada autoensamblada

Este protocolo describe la técnica quirúrgica para la extracción de un modelo de colgajo perforante humano basado en el pedículo profundo de la arteria epigástrica inferior, destinado a la investigación experimental.

Un modelo experimental de colgajo DIEP humano para investigar estrategias de preservación de aloinjertos compuestos vascularizados y colgajos libres

Aprende a visualizar y cuantificar la vascularización en constructos de ingeniería de tejidos utilizando un modelo de defecto cutáneo estandarizado en ratones. Este método ofrece una alternativa rentable y eficaz para evaluar redes vasculares in vivo.

Una piel llena de defectos modelo para evaluar la vascularización de Biomateriales

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