Name: Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a reprogramar pericitos cerebrales humanos en neuronas inducidas mediante vectores retrovirales con Sox2 y Ascl1. Este protocolo permite la conversión directa de células endógenas para estrategias innovadoras de reparación cerebral.

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Estamos muy agradecidos a la Dra. Magdalena Götz por su aportación durante el desarrollo de este protocolo. Agradecemos al Dr. Marius Wernig (Universidad de Stanford) por su generoso que nos proporciona la secuencia de codificación sox2. También estamos muy agradecidos a la Dra. Alexandra Lepier para la producción de virus. Este trabajo fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) y el BMBF (01GN1009A) a BB, y el Ministerio de Ciencias del Estado de Baviera, Investigación y las Artes a MK y BBCS recibieron financiación de la SYSTHER-binacional INREMOS Instituto Virtual (Ministerios Federal alemán y esloveno de Educación e Investigación) y la DFG (SFB 824).

1. Aislamiento y cultivo de células cerebro humano adulto Los experimentos con el tejido humano se deben realizar de acuerdo con todas las regulaciones gubernamentales e institucionales pertinentes en relación con la utilización de material humano para fines de investigación. El presente protocolo fue desarrollado de acuerdo con la aprobación del comité de ética de la Facultad de Medicina de la LMU Munich y el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes. Este protocolo de culturas que se preparan de la corteza cerebral humano adulto se ha establecido el uso de muestras de pacientes de ambos sexos que sufren de epilepsia del lóbulo temporal u otras lesiones no traumáticas, no malignas profundas. El tejido obtenido de la sala quirúrgica que comprende exclusivamente el canal de acceso a la lesión del cerebro y por lo tanto se considera saludable. El rango de edad de los pacientes fue de 19 a 70 años. <ol><li> Preparar medio de crecimiento mediante la adición de suero de ternera fetal inactivado por calor(FCS) a DMEM de alta glucosa con GlutaMAX para obtener una concentración final de 20% de FCS. Añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina a un total de 500 ml de medio de crecimiento. Realice este y todos los pasos posteriores que requieren condiciones de cultivo estériles en una campana de flujo laminar adecuado. </li><li> Mantener la biopsia de cerebro humano adulto obtenida de la habitación quirúrgica en solución salina equilibrada de Hanks con CaCl2 y MgCl2 (HBSS) medio que incluye HEPES (10 mM de concentración final) en hielo hasta el procesamiento. Inicie el procesamiento tan pronto como sea posible. </li><li> Para iniciar la disociación en células individuales, transferir el tejido en una placa de Petri de 65 mm y picar en trozos pequeños usando dos escalpelos estériles de uso único. Para la digestión enzimática utilizar 3-6 ml TrypLE en un tubo cónico de 15 ml y se incuba durante 15-30 min a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Añadir 1 volumen de medio de crecimiento precalentado para facilitar la disociación y se tritura suavemente la solución que contiene piezas de tejido arriba y hacia abajo por primera utilizandouna pipeta desechable de 5 ml, seguido por el uso de una pipeta Pasteur de vidrio hasta la homogeneización de la suspensión celular. Normalmente, algunos trozos de tejido residual, en su mayoría consisten en la sustancia blanca, permanecerán en la suspensión. </li><li> Centrifugar a 157 xg durante 5 min y resuspender el precipitado en la cantidad apropiada de medio de crecimiento (10 ml por matraz de cultivo T75 no recubierto). Utilice un frasco de cultivo T75 para una biopsia de 5-10 mm de diámetro de tamaño y extrapolar a partir de esto en el caso de los especímenes más grandes. </li><li> Colocar las células en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2 y 5% de O 2. </li><li> Reemplazar la mitad del medio cada 3-4 días hasta que las células han alcanzado la confluencia. Esto suele tardar hasta dos semanas (denominados pasaje 0 [P0]). </li></ol> 2. Expansión in vitro y caracterización de células adultas del cerebro humano <ol><li> En la expansión in vitro: <ol><li> Aspirar el medio de cultivo y se lava con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se mantuvo en la sala de temperatura, antes de añadir 3 ml TrypLE. </li><li> Se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos hasta que la mayoría de las células separadas. Golpee suavemente los frascos para facilitar la eliminación de las células; después de la adición de 3 volúmenes de medio de crecimiento, transferir las células a un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 157 xg durante 5 min y resuspender las células en la cantidad apropiada de medio de crecimiento. </li><li> Pasaje de las células en una proporción de 1:3 para un rendimiento óptimo en frascos nuevos de cultivo de células T75. Nota: Hemos pases estas células hasta P5, sin signos de reducción de la eficiencia de reprogramación. Mientras que en P0 el cultivo contiene una fracción considerable de células endoteliales (como se evaluó por la expresión de CD34), en pasajes posteriores su número se convierte en insignificante. </li></ol></li><li> Caracterización de las culturas del cerebro humano adulto: <ol><li> La inmunocitoquímica: <ol><li> Para la caracterización de las células, ~ 60.000 células de semillas en D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en 500 l fresca mediu crecimientom en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y 5% de O 2. </li><li> Para el análisis inmunocitoquímico de las células cerebrales humanas cultivadas eliminar el medio y lavar 3 veces con 1 ml de PBS. </li><li> Fijar las células mediante la adición de 500 l de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Transferencia de la cubierta de vidrio se desliza en una cámara humidificada tinción apropiado y bloquear con 80 l de PBS que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,5% de Triton X-100 durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Añadir anticuerpos primarios diluidos en la misma solución (para factores de dilución véase la tabla de reactivos y equipos específicos) y se incuba durante la noche a 4 ° C o 1 hora a temperatura ambiente. Nota: Una fracción sustancial pero variando de las células en esta fase de cultivo son inmunorreactivas para β del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), grupo de diferenciación 146 (CD146), Proteo condroitina sulfato de NG2glicanos y actina de músculo liso (SMA), es decir, marcadores característicos de pericitos microvasos asociada. Sólo una minoría (&lt;1%) expresan la proteína glial fibrilar ácida marcadores astrogliales (GFAP) y S100β. Además, en esta etapa el cultivo debe ser desprovisto de cualquier células que expresan el marcador neuronal βIII-tubulina. Utilice múltiples combinaciones de anticuerpos primarios para la co-etiquetado de los diferentes marcadores. La confirmación adicional de la expresión de marcadores gliales, neuronales, endoteliales y pericitos puede obtenerse por transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (no descrito en este protocolo). </li><li> Después de la incubación con los anticuerpos primarios se lavan tres veces con 1 ml de PBS y añadir los anticuerpos secundarios correspondientes (en las diluciones apropiadas) a la solución de tinción y se incuban 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavan las células 3 veces con PBS. Si es necesario, antes de montar incluir tinción con DAPI durante 5 min a la habitacióntemperatura. </li><li> Utilice antifading medio de montaje y analizar los cubreobjetos utilizando un microscopio de epifluorescencia o un microscopio confocal. </li></ol></li><li> La citometría de flujo: <ol><li> Para el análisis de expresión de marcadores de superficie utilizando citometría de flujo, crecer las células hasta la confluencia en T25 sin recubrir o frascos de cultivo celular T75. </li><li> Separar las células mediante el uso de TrypLE como se ha descrito antes y volver a suspender en solución de tinción que consiste en PBS + 0,5% de BSA. Por reacción de tinción, resuspender 100.000-200.000 células en 100 l de solución de tinción. Preparar reacciones de tinción individuales por anticuerpos utilizados (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, anticuerpos de control de isotipo respectivos). </li><li> Añadir anticuerpos conjugados con fluorocromo a cada solución de tinción (véase la tabla para diluciones de reactivos y equipos específicos) directamente en la suspensión celular y se incuba a 4 ° C durante 30 minutos en la oscuridad. </li><li> Se lavan las células tres veces con 500 l de PBS y centrifugar entre cadaetapa de lavado a 157 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 0,5-1 ml de solución de tinción y las células de transferencia a través de un filtro de células (70 micras) a tubos de FACS. Evita que la muestra de la exposición a la luz. </li><li> Muestras Vortex antes de colocarlos en el instrumento FACS. </li><li> Para el análisis de las células vivas y excluir a los desechos celulares y los agregados, portón para FSC-A y SSC-A. Dosillos celulares se gated específicamente por FSC-A y FSC-W. Para determinar las condiciones de activación periódica adecuadas para los marcadores de superficie celular que figuran las puertas con control de isotipo conjugado con el fluorocromo respectiva. A continuación, determinar la proporción de células productoras de anticuerpos de ruedas. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Enriquecimiento de células derivadas de pericitos por fluorescencia de células activadas por la clasificación <ol><li> Se purifica la población de células de pericitos (se resuspendieron en medio de crecimiento) antes de la transducción a través de clasificación por FACS utilizando una boquilla de 70 micras. Utilice CD34-APC en combinación con CD140b-PE y CD146-FITC para seleccionar a los pericitos. Ordenar por, células CD140b-y CD146 positivas CD34 negativas. </li><li> Recoger las células clasificadas en medio de crecimiento y placa sobre D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en placas de cultivo tisular de 24 pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y el 5% de O 2. </li><li> 48 h después de su clasificación sustituir el medio con medio de crecimiento fresco y llevar a cabo la transducción tal como se describe en el Protocolo 4. </li></ol> 4. Transducción retroviral de células derivadas de pericitos y Reprogramación en neuronas inducidas Nota: Consulte las normas de bioseguridad locales al manipular partículas retrovirales. En Alemania, el uso de los retrovirus utilizados aquí requiere de bioseguridad de nivel 2. Para la producción de partículas retrovirales se refiere el protocolo 6. Para construcciones retrovirales utilizados para la reprogramación, consulte Karow et al. (2012). Los retrovirus fueron pseudotyped con VSV-G (virus de la estomatitis vesicular-glicoproteína) 5. Para la producción consulte Gavrilescu et al 6. <ol><li> 24 horas antes de la semilla de la transducción retroviral ~ 60.000 células en D-lisina recubierto con poli-cubierta de cristal se desliza en 500 l medio de cultivo fresco en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO 2 y el 5% de O2 . </li><li> Al día siguiente, reemplazar el medio de cultivo con 500 l medio de cultivo fresco, precalentado y añadir 1 l de los sobrenadantes concentrados respectivos que contienen partículas retrovirales (pCAG-IRES dsRed-para el control, sobre todo durante el establecimiento del protocolo en el laboratorio), pCAG-Ascl1 -dsRed IRES, pCAG-sox2-IRES-GFP. </li><li> Un día después, extraiga el soporte incluyendo las partículas virales de las células y se añade 1 ml fresco, precalentado medio B27-diferenciación, compuesta de 49 ml de DMEM rico en glucosa con GlutaMAX y 1 suplemento libre de suero B27 ml. Mantener las células en cultivo a 37 ° C en 5% De CO 2 y el 5% de O 2 durante 4-8 semanas sin cambiar el medio como cambios de medio repetitivas se vuelven dañinos como iNs maduran. </li></ol> 5. Caracterización de neuronas inducida por inmunocitoquímica <ol><li> Para determinar la identidad celular de las células transducidas, en particular, para demostrar la adquisición de un fenotipo neuronal, realizar inmunocitoquímica contra antígenos neuronales tales como bIII-tubulina, MAP2, y NeuN (para los anticuerpos y las diluciones respectivas, ver tabla de reactivos específicos y equipo; seguir el mismo procedimiento como se indica en 2.2.1). </li><li> Para mejorar la maduración de PdiNs, co-cultivo de estas células con las neuronas derivadas de ratón E14 cortezas cerebrales. Para este fin, diseccionar la corteza cerebral y disociar el tejido mecánicamente con una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego. Añadir 10.000-50.000 neuronas murinas a cultivos de células derivadas de pericitos 2-3 semanas después de la transducción con re-Sox2 y Ascl1-codificacióntroviruses y continuar el cultivo. Las células transducidas se pueden distinguir de las neuronas murinas por su reportero (GFP y dsRed) la expresión, ya sea por epifluorescencia vivo o después de inmunocitoquímica para GFP y dsRed. </li><li> Para evaluar la formación de sinapsis en PdiNs por neuronas murinas, realizar inmunocitoquímica contra receptores de neurotransmisores vesiculares tales como transportador vesicular de glutamato 1 (VGLUT1). </li><li> Sonda células transducidas para sus propiedades eléctricas (es decir, la capacidad de generar potenciales de acción) y el establecimiento de las sinapsis funcionales por electrofisiología de patch-clamp. Para más detalles sobre el procedimiento de ver Heinrich et al. (2011). </li></ol>

<ol><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+water+deficit%2C+ABA%2C+and+provenances+in+Picea+asperata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li>
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<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
<li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li>
<li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+cells%3A+how+to+make+and+define+a+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li>
<li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li>
<li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li>
<li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable%2C+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

El presente protocolo describe la expansión in vitro y el enriquecimiento de las células derivadas de pericitos después del aislamiento por parte del adulto corteza cerebral humana y la posterior conversión en iNs por la expresión mediada por retrovirus de la transcripción neurogénica factores Sox2 y Ascl1. Tal protocolo experimental proporciona un sistema in vitro para estudiar el linaje de conversión de las células cerebrales-residente en neuronas y glía, potencialmente, también, con el objetivo en m...

A diferencia de la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que a su vez están dotados de una gran cantidad de potenciales de diferenciación, la reprogramación directa tiene como objetivo para la conversión recta de un tipo específico de célula a otro. Con respecto a su aplicación en el contexto de la modelización de enfermedades y terapias basadas en células potenciales, ambos enfoques de reprogramación tienen ventajas y desventajas específicas. Reprogramación en iPSCs (i) ofrece una fuente casi infinita de células; (Ii) permite la ingeniería genética; (Iii) dota de un potencial de diferenciación casi ilimitada. Sin embargo, las principales desventajas de CMPI conllevan el riesgo de tumorigenicidad de las células no diferenciadas (la formación de teratomas in vivo) y la necesidad para el cultivo ex vivo y posterior trasplante si estas células se van a utilizar para las terapias basadas en células. Por el contrario, el linaje-reprogramación directa está limitado por el menor rendimiento de las células deseadasque se correlaciona directamente con el número de las células diana de la población de partida, sino que posee la ventaja de que las células de linaje-reprogramado parecen exhibir ningún riesgo tumorigénico en el trasplante 1,2; además, la reprogramación directa, incluso se puede lograr in situ, es decir, en el órgano donde se requerirían estas células, evitando así la necesidad de un trasplante. Con esto en mente, nuestro laboratorio ha perseguido la posibilidad de las células cerebrales residente linaje reprogramación en iNs como un nuevo enfoque hacia las terapias basadas en las células de las enfermedades neurodegenerativas. Células cerebrales-residente que pueden ser considerados como potencialmente dianas celulares para el linaje-reprogramación comprenden diferentes tipos de macroglía (astrocitos, células NG2 y oligodendrocitos), microglia y células microvasculares asociadas (células endoteliales y los pericitos). Hemos estudiado ampliamente el potencial reprogramación in vitro de astroglia del cor cerebraltex de principios de ratones postnatales 3-5. En la búsqueda de fuentes de células de manera similar adecuadas para linaje reprogramación directa en el cerebro humano adulto, nos encontramos con una población de células que se pueden reprogramar con éxito en ins y características de exhibición de los pericitos. Aquí se describe un protocolo de cómo cosechar estas células de biopsias de cerebro humano adulto, para expandir y enriquecer estas células in vitro, y finalmente reprogramar con éxito una fracción sustancial de estas células in vitro en expandido (en el rango de 25-30%) en Ins. La reprogramación se puede lograr por mediada por retrovirus co-expresión simultánea de dos factores de transcripción, Sox2 y Ascl1. Se encontró que estas PdiNs para adquirir la capacidad de acción repetitiva potencial de fuego y para servir como dianas sinápticas de otras neuronas que indican su capacidad de integrarse en las redes neuronales. Nuestro protocolo proporciona un mecanismo sencillo para que el aislamiento y el linaje de conversión de pericitos cerebro humano adulto en Complementos. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>anti-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td></td><td>MCA2141FT uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td></td><td>MVA1270A488T uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFR&beta;</td><td>Señalización celular</td><td>3169S</td><td>uso 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD146</td><td>Abcam</td><td>Ab75769</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-y beta; III-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>uso 1:400</td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>uso 1:200</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>uso 1:600</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>uso 1:1.000</td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>uso 1:500</td></tr><tr><td>anti-S100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td>uso 1:300</td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>uso 1:200</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>uso 1:500</td></tr><tr><td>anti-Calretinina</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>uso 1:500</td></tr><tr><td>anti-vGluT1</td><td>SYnáptico SYstálticos</td><td>135511</td><td>uso 1:1.000</td></tr><tr><td>Rat IgG1 control de isotipo FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>Rata IgG1 control de isotipo PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>Rat IgG1 control de isotipo APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>uso 1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento sin suero</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>suero fetal para terneros</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td><td>realiza la inactivación del calor por incubación a 56 & grados; C durante 30 min</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Solución salina equilibrada de Hanks)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS de Dulbecco sin CaCl2 y MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina bromuro de hidrobromuro (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehído)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidin-2-fenilindol) dilactato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/ Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo de polipropileno&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de poliestireno de fondo redondo con tapa de filtro de células&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Orange Scientific 5530305</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matraces de cultivo de 75 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>matraces de cultivo de 25 cm2</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas desechables 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipetas (150 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio de 12 mm de diámetro</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes quirúrgicos desechables&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr>Campana <td></td><td></td><td></td>de<td>flujo laminar</td></tr><tr><td>Centrífuga y rotor basculante con adaptadores para tubos de 15 ml y 50 ml</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Clasificador de células por citometría de flujo: FACSAria l con software FACSDiva&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td> Incubadora de <td></td><td></td></tr><tr><td>cultivos celulares humificados</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua a 37 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSFara fluido de vaina de bajo&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia BX61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Linaje reprogramación directa de las células no neuronales en neuronas inducidas (INS) puede proporcionar conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la neurogénesis y permitir nuevas estrategias para el modelado in vitro o reparar el cerebro enfermo. La identificación de los tipos de células no neuronales del cerebro residente susceptibles de conversión directa en iNs podrían permitir el lanzamiento de un enfoque de este tipo in situ, es decir, dentro del tejido cerebral dañado. Aquí se describe un protocolo desarrollado en el intento de identificar las células derivadas de cerebro humano adulto que cumplen esta premisa. Este protocolo implica: (1) el cultivo de células humanas a partir de la corteza cerebral obtenidos a partir de biopsias de cerebro humano adulto; (2) la expansión in vitro (que requiere aproximadamente 2-4 semanas) y caracterización de la cultura por inmunocitoquímica y citometría de flujo; (3) el enriquecimiento por células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando anticuerpos anti-receptor de PDGF-β y los anticuerpos anti-CD146;(4) la transducción mediada por retrovirus con la transcripción neurogénica factores de Sox2 y Ascl1; (5) y, finalmente, la caracterización de las neuronas resultantes derivadas de pericitos inducidas (PdiNs) por inmunocitoquímica (14 días a 8 semanas después de la transducción retroviral). En esta etapa, el INS se puede probar por sus propiedades eléctricas mediante la grabación de patch-clamp. Este protocolo proporciona un procedimiento altamente reproducible para la conversión linaje in vitro de los pericitos cerebrales residente en iNs humanos funcionales.

El primer resultado de este protocolo después de establecer con éxito una cultura de un espécimen de ser humano adulto corteza cerebral consiste en la identificación de la composición celular de la cultura. La inmunocitoquímica de proteínas específicas de tipo celular revela un grado considerable de heterogeneidad entre los cultivos derivados de muestras de diferentes pacientes (Figura 1A). Tal como se cuantifica por citometría de flujo no es siempre una fracción sustancial de las células que expresan P...

Atacar a las células cerebrales residente por linaje reprogramación directa ofrece nuevas perspectivas para la reparación del cerebro. Aquí se describe un protocolo de cómo preparar cultivos enriquecidos por pericitos cerebrales residente del adulto corteza cerebral humana y convertirlas en neuronas inducida por la expresión mediada por retrovirus de los factores de transcripción Sox2 y Ascl1.

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en convertir células derivadas de parásitos cerebrales humanos en neuronas inducidas. Esto se logra mediante el aislamiento y cultivo de células derivadas de parásitos a partir de especímenes cerebrales quirúrgicos. A continuación, tras la expansión, las células in vitro se marcan inmunológicamente con marcadores parasitarios, lo que permite la caracterización y, eventualmente, un mayor enriquecimiento de las células.Luego, las células derivadas del parásito se transducen con vectores retrovirales que codifican determinantes del destino neuronal para convertirlas directamente en neuronas inducidas. Se obtienen resultados que muestran neuronas inducidas a partir de células derivadas del parásito reprogramadas en su linaje, basados en tinción inmunológica para el marcador neuronal beta tres tubulina. La ventaja principal de este enfoque frente a métodos existentes, como la reprogramación de fibroblastos o la diferenciación de células madre embrionarias en neuronas, es que dirigimos células endógenas del cerebro, lo que podría allanar el camino para la conversión directa de linajes dentro del cerebro sin necesidad de trasplantar las células.El siguiente protocolo se desarrolló de acuerdo con la aprobación del Comité Ético de la facultad de medicina de la LMU Munich y con el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, comenzando con una biopsia cerebral humana fresca. Mantenga el tejido sobre hielo en HBSS y disocie el tejido en células individuales transfiriéndolo a una placa de Petri de 65 milímetros y, utilizando dos escalpelos estériles de un solo uso, córtelo en trozos pequeños. Transfiera el tejido a un tubo cónico de 15 mililitros y añada de tres a seis mililitros de trip, incube de 15 a 30 minutos a 37 grados Celsius en un baño de agua.Después de la reacción de digestión, añada un volumen de medio de crecimiento precalentado para facilitar la asociación y utilice una pipeta desechable de cinco mililitros seguida de una pipeta de vidrio Pasteur para triturar suavemente la suspensión celular. Centrifugue la solución a 157 G durante cinco minutos. Re suspenda el sedimento en medio de crecimiento y transfiera el cultivo a un matraz T 75.Incube las células a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 5% de oxígeno. Reemplace la mitad del medio cada tres o cuatro días hasta que las células hayan alcanzado confluencia. Cuando las células hayan alcanzado confluencia, aspire el medio de cultivo y lave con PBS a temperatura ambiente antes de agregar tres mililitros de trip le.Tras una incubación de cinco a 10 minutos a 37 grados Celsius, golpee suavemente el matraz para ayudar a desprender las células. Luego, agregue tres volúmenes de medio de crecimiento tras centrifugar la suspensión y resuspender las células en medio de crecimiento, y páselas a una relación de uno a tres para obtener un rendimiento óptimo en nuevos matraces de cultivo T 75.Las células se han pasado hasta cinco veces sin signos de reducción en el reprogramamiento, y el número de células endoteliales se volverá despreciable con cada paso. Para realizar inmunocitoquímica, siembre aproximadamente 60.000 células sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina en 500 microlitros de medio de crecimiento fresco en placas de cultivo de tejidos de 24 pozos y cultive.Incube las células durante 24 horas a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 5% de oxígeno. Para el análisis inmunoquímico de las células cerebrales humanas cultivadas, retire el medio y lave tres veces con un mililitro de PBS. Añada 500 microlitros de paraformaldehído al 4% en PBS e incube durante 15 minutos.A temperatura ambiente. Transfiera las laminillas de vidrio a una cámara de tinción humedecida adecuada y agregue 80 microlitros de bloqueador de P-B-S-B-S-A con Triton X-100 durante una hora a temperatura ambiente antes de añadir los anticuerpos primarios diluidos en la misma solución e incubar durante una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius. Use PBS para lavar las células tres veces antes de agregar los anticuerpos secundarios e incubar durante una hora a temperatura ambiente.Después de lavar tres veces, aplique un medio antidesvanecimiento y monte las laminillas. Utilice microscopía de fluorescencia epiescopia o confocal para analizar las muestras. Siga las directrices locales de bioseguridad al manipular partículas retrovirales; 24 horas antes de la transducción retroviral, siembre aproximadamente 60 000 células en la parte superior.Coloque cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina en 500 microlitros de medio de crecimiento fresco en placas de cultivo celular de 24 pocillos e incube a 37 grados Celsius. Al día siguiente.Sustituya el medio de crecimiento por 500 microlitros de medio de crecimiento fresco precalentado y agregue un microlitro de los sobrenadantes concentrados respectivos que contienen partículas retrovirales. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme de las partículas virales en todo el pocillo. Un día después, retire el medio con partículas virales de las células y agregue un mililitro de medio fresco precalentado.Medio de diferenciación B 27 según se describe en el protocolo escrito, mantenga las células en cultivo durante cuatro a ocho semanas sin cambiar el medio, ya que esto puede dañar a las neuronas inducidas mientras maduran, con el fin de demostrar la adquisición de un fenotipo neuronal. Realice inmunocitoquímica frente a antígenos neuronales como beta tres tubulina, map dos y nen. Como se demostró anteriormente en este video, la inmunocitoquímica realizada en cultivos exitosamente establecidos a partir de corteza cerebral humana adulta revela un grado considerable de heterogeneidad entre cultivos derivados de muestras de diferentes pacientes, tal como se cuantificó mediante citometría de flujo.Existe una fracción considerable de células que expresan PDGFR beta, mientras que otros marcadores de parásitos como CD146, NG2 y CD13 se expresan en niveles más bajos. Asimismo, SMA se expresa en una subpoblación menor de células cultivadas en el pase cero; habitualmente hay menos del 10 % de células endoteliales positivas para CD34, y estas disminuyen por debajo del límite de detección con pases posteriores. Del mismo modo, los astrocitos representan solo una contaminación despreciable en los pases iniciales.Los datos inmunoquímicos, fitoquímicos y de citometría de flujo están completamente respaldados por R-T-P-C-R-A cuantitativa. Puede lograrse un mayor enriquecimiento de células derivadas del parásito mediante hechos en esta etapa. Esto es particularmente relevante cuando la pureza del cultivo se encuentra en el extremo inferior del espectro, tal como lo refleja el nivel de expresión de P-D-G-F-R beta.Por lo tanto, hemos utilizado un anticuerpo contra P-D-G-F-R beta CD uno 40 B solo o en combinación con un anticuerpo anti-CD 1 46, excluyendo al mismo tiempo cualquier contaminante positivo para CD 34 para separar por clasificación. Específicamente, los parásitos que transducen estos cultivos con virus de control no alteran su perfil de expresión, lo que indica que permanecen en la línea parasitaria. Asimismo, la expresión mediada por retrovirus de SOX dos sola no provoca cambios en la morfología ni induce la expresión de beta tres tubulina.En contraste, aproximadamente el 10 % de las células transducidas con un retrovirus que codifica únicamente A SCL uno exhiben expresión de beta tres tubulina, pero no adquieren una morfología neuronal. Sorprendentemente, casi el 50 % de todas las células cotransducidas con so dos y A SCL uno muestran expresión de beta tres tubulina, y un tercio de ellas también exhiben prolongaciones neuronales, lo que indica su conversión de destino en PNS tras seguir este procedimiento.Otras técnicas como la electrofisiología de parche ggl se pueden emplear para abordar preguntas adicionales sobre la maduración y funcionalidad de las neuronas inducidas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Primario, fetales humanos derivado del cerebro, células progenitoras multipotenciales...

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Este video muestra la reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas modificadas genéticamente en células madre neuronales. Los factores de transcripción expresados por las células progenitoras hematopoyéticas desencadenan una cascada de eventos moleculares que facilitan su transformación. Se utilizan otros medios específicos para seleccionar y cultivar células madre neuronales inducidas.

Reprogramación directa de células progenitoras hematopoyéticas en células madre neurales

Este video demuestra el proceso para diferenciar células progenitoras neurales inducidas (iNPCs) en neuronas y astrocitos utilizando medios especializados.

Diferenciación de células progenitoras neurales inducidas en astrocitos

El video muestra la generación de neuronas a partir de fibroblastos dérmicos humanos adultos (aHDF). Los aHDFs se reprograman utilizando un vector lentiviral portador de genes para factores de transcripción neuronal y ARN de horquilla corta (shRNAs). Los shRNAs inhiben la expresión de un represor transcripcional neuronal, y los factores de transcripción neuronal activan genes para diferenciar las aHDFs en neuronas. Estas aHDFs reprogramadas se cultivan en un medio de conversión neuronal...

Generación de neuronas mediante la reprogramación de células de fibroblastos dérmicos humanos

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

En proyección de imagen es una poderosa herramienta para estudiar el comportamiento celular en tiempo real. Aquí, describimos un protocolo para Time-lapse vídeo-microscopía de células de la corteza cerebral primaria que permite un examen detallado de las fases promulgadas durante la progresión del linaje de las células madre neurales primarias diferenciadas neuronas y glia.

Proyección de imagen de las células de la corteza Cerebral primaria usando un sistema 2D de la cultura en vivo

Se describe un protocolo robusto para monitorear las poblaciones neuronales de Time-lapse vídeo-microscopía seguido basado en software de post-processing. Este método representa una poderosa herramienta para identificar acontecimientos biológicos en una población seleccionada durante los experimentos de imagen vivo.

La proyección de imagen seguida de la célula de seguimiento para la biología de la célula de Monitor y la progresión de linaje de poblaciones neuronales múltiples en vivo

Reprogramación neuronal directa genera neuronas que mantienen la edad de la partida de la célula somática. Aquí, describimos un método único basado en vectores para generar neuronas inducidas de fibroblastos dérmicos obtenidos de donantes humanos adultos.

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

El protocolo presenta la reprogramación de células mononucleares de sangre periférica para inducir células madre neurales por infección por el virus Sendai, diferenciación de iNSCs en neuronas dopaminérgicas, trasplante de precursores de DA en el unilateralmente-lesioned Modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson, y evaluación de la seguridad y eficacia de los precursores de DA derivados de iNSC para el tratamiento de la DP.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Se describe un protocolo para reprogramar fibroblastos derivados de la piel humana en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs), y su posterior diferenciación en astrocitos inducidos (iAs). Este método conduce a la generación rápida y reproducible de iNPCs e iAs en grandes cantidades.

Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

La capacidad de marcar permanentemente las células madre y su progenie con un fluoróforo utilizando una línea de ratón de rastreo de linaje transgénico inducible permite el análisis espacial y temporal de la activación, proliferación, migración y / o diferenciación in vivo. El rastreo de linaje puede revelar información novedosa sobre el compromiso del linaje, la respuesta a las intervenciones y la multipotencia.

Rastreo de linaje de células madre inducibles marcadas fluorescentemente en el cerebro de ratón adulto

Aprende a reprogramar pericitos cerebrales humanos en neuronas inducidas mediante vectores retrovirales con Sox2 y Ascl1. Este protocolo permite la conversión directa de células endógenas para estrategias innovadoras de reparación cerebral.

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

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