La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

El objetivo general del siguiente experimento es observar la interacción entre dos proteínas y células vivas cultivadas. Esto se logra mediante la subclonación de los CDNA de las dos proteínas de interés en plásmidos que contienen la secuencia de recubrimiento para luciferasa o proteína fluorescente amarilla, abreviada YFP para crear vectores para la expresión de proteínas en células de mamíferos. Como segundo paso, los plásmidos se transfectan en células cultivadas, lo que conduce a la expresión de las proteínas de fusión YFP y luciferasa.

A continuación, se añade un sustrato de luciferasa a las células para iniciar la emisión de luz de la luciferasa. Se obtienen resultados que muestran la interacción entre las dos proteínas de fusión basada en la transferencia de energía de LUCIFERASA a YFP. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como la precipitación en consuelo, es que permite observar las interacciones proteína-proteínas en células vivas.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genómica funcional al determinar si una mutación encontrada en un paciente afecta las interacciones proteína-proteína. La demostración del primer paso del procedimiento será RAB tric, un estudiante de doctorado de mi laboratorio para comenzar a crear los plásmidos como se describe en el protocolo de texto. Estime la concentración de los mismos en función de la absorbancia a 260 nanómetros.

Determine la masa molecular de cada plásmido multiplicando el número de pares de bases por 650.Daltons. Utilice la concentración y la masa molecular para calcular la concentración molar de cada preparación de plásmido. Diluir las preparaciones de ADN plasmídico a una concentración de 36 nano molares.

Estas serán las existencias de trabajo que se utilizarán para preparar las mezclas de ADN. Para la transfección. El aspecto más difícil de este procedimiento es la configuración de las mezclas de ADN. Para garantizar el éxito, creamos hojas de cálculo para precalcular la cantidad correcta de cada componente, y tenemos mucho cuidado.

En la configuración de las mezclas DN. Prepare la primera mezcla de ADN de control que contenga 1800 nanogramos de plásmido de relleno en un volumen final de 20 microlitros de agua. A continuación, configure una segunda mezcla de ADN controlada preparando cinco microlitros de la construcción de control de aspecto P.

Agregue plásmido de relleno para llevar la masa total de ADN a 1800 nanogramos. Agregue agua para llevar el volumen final a 20 microlitros. Prepare una tercera mezcla de ADN de control que contenga cinco microlitros de constructo de control P look y cinco microlitros de constructo de control PYFP.

Agregue el plásmido de relleno y el agua como antes. Finalmente, establezca una cuarta mezcla de ADN de control que contenga cinco microlitros de la construcción de control positivo. Nuevamente, agregue relleno, plásmido y agua de la misma manera.

A continuación, prepare mezclas de NA en 3D para probar la homodimerización de una proteína de interés x. Para cada mezcla de ADN, combine cinco microlitros de la construcción de aspecto P relevante y cinco microlitros de la construcción PYFP, agregando plásmido de relleno y agua. A continuación, prepare mezclas de ADN para probar una interacción entre un par de proteínas de interés X e Y. Para cada mezcla de ADN, combine cinco microlitros de la construcción de aspecto P relevante y cinco microlitros de la construcción PYFP junto con un plásmido de relleno y recoja agua células hec subconfluentes 2 9 3 de un matraz de 75 centímetros cuadrados, diluya el 10% del total de células en 13 mililitros de medio de cultivo.

A continuación, dispense 130 microlitros de suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo transparente blanco antes de cultivar las células durante 24 horas. A continuación, calcule el número de pocillos que se van a transfectar multiplicando el número de mezclas de ADN por tres. Prepare una mezcla maestra que contenga 6,3 microlitros de medio libre de suero a temperatura ambiente y 0,18 microlitros de reactivo de transfección por pocillo mezclado por vórtice antes de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, se dispensaron 20 microlitros de mezcla maestra de reactivo de transfección de medio libre de suero en el número requerido de tubos. Agregue dos microlitros de la mezcla de ADN correspondiente en cada tubo, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Por último, transfecte tres pocillos con cada mezcla de transfección.

Dispensar 6,5 microlitros de mezcla de transfección por pocillo antes de cultivar las células durante 36 a 48 horas más. Para medir la señal BRET. Primero disuelva el sustrato de luciferasa de células vivas a 34 miligramos por mililitro en DMSO por vórtice.

Diluir el sustrato de luciferasa de células vivas reconstituidas a uno a 1000 en medio de dilución de sustrato precalentado a 37 grados Celsius. Permita que se mezclen 50 microlitros de medio de dilución de sustrato por vórtice de pozo. Es posible que se forme un precipitado, pero no interferirá con el ensayo.

Aspire el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos, dispense 50 microlitros de sustrato de luciferasa de células vivas diluidas en cada pocillo después de cultivar las células durante al menos dos horas. Retire la tapa de la placa de 96 pocillos e incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente dentro del luminómetro. Mida la emisión de LUCIFERASA e YFP un pozo a la vez de acuerdo con los detalles del protocolo de texto, integre las señales de emisión durante 10 segundos.

Los miembros de la familia de represores transcripcionales Fox P desempeñan un papel en el desarrollo del cerebro. Las mutaciones se han implicado en los trastornos del habla y del espectro autista. Se sabe que FOX P two forma homodímeros para validar el ensayo Brett para la detección de Fox.

Se transfectaron células P dos Homodímeros con constructos para la expresión de luciferasa como donante o YFP como aceptor fusionado con Fox P dos o una señal de localización nuclear. Las proteínas LUCIFERASA e YFP dirigidas a nuclear sirven como controles negativos como control positivo para la detección de un Brett. Las células señal también se transfectaron con una construcción para la expresión de una proteína de fusión YFP luciferasa.

El aumento de la señal BRET muestra que el ensayo Bret es eficaz en la detección de Fox P: aquí se muestran dos homodímeros, imágenes de microscopía de fluorescencia de células transfectadas con YFP fusionado a una señal de localización nuclear, o con YFP fusionado a FOX P. La especificidad de la interacción se demostró mediante la introducción de una mutación en FOX P dos, que se sabe que interrumpe la dimerización. Cuando se coexpresaron las proteínas de fusión luciferasa Fox P, dos delta E 400 y YFP Fox B, dos.

Se observó una reducción en la señal respiratoria en comparación con cuando Fox B dos y YFP Fox B dos se expresaron conjuntamente. Esta reducción de la señal no se debió a una alteración en la localización subcelular de la proteína mutante para evaluar la efectividad del ensayo de Bret en la detección de interacciones típicas, se probó la interacción de Fox P dos con Fox P uno, se observó una señal de Brett A en ambas configuraciones posibles del ensayo. Además, se probó la idoneidad del ensayo Brett o la interacción de detección de Fox P dos con proteínas no FOX P mediante el examen de la interacción con CT BP one, un corepresor transcripcional y compañero de interacción conocido de Fox P dos.

La interacción Fox P dos CT BP uno se detectó mediante el ensayo Brett cuando Fox P dos fue la proteína de fusión donante y CT P uno fue el aceptor, pero no en la configuración inversa. Se observó la interacción entre FOX P dos y CT P uno, a pesar de que solo una pequeña proporción de CT BP uno se localizó en el núcleo, lo que destaca la sensibilidad de este ensayo. Finalmente, se empleó el ensayo Bret para examinar los efectos de las mutaciones patogénicas en Fox P two en las interacciones proteína-proteína.

Se ha informado que dos mutaciones puntuales en Fox P dos causan un raro trastorno autosómico dominante que afecta el habla y el lenguaje. La capacidad de las proteínas mutantes para dimerizarse con el zorro de tipo salvaje P two se evaluó mediante el ensayo BRET. La mutación R 3 28 X, pero no la mutación R 5 53 H, interrumpe la dimerización de los resultados utilizando el tipo salvaje Fox B dos como donante y el mutante Fox B dos mutante.

A medida que se muestran los aceptadores, se observaron los mismos resultados para la configuración inversa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar el ensayo del pan para monitorear las interacciones proteína-proteína. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran las interacciones proteína-proteína en células vivas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar técnicas adicionales para analizar la actividad de la proteína de interés con el fin de evaluar las consecuencias funcionales de una interacción proteína-proteína observada.