Name: Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprende a medir lípidos neutros en células de algas mediante tinción con Rojo Nilo y espectrofotometría de fluorescencia. Este protocolo rápido facilita el monitoreo eficiente de bioprocesos de cultivo algal.

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Los autores desean agradecer a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá para proporcionar apoyo financiero para este proyecto.

1. Aislamiento de Dry algas biomasa para ser utilizada como Normas para fluorescencia Lecturas <ol><li> Retirar un volumen de muestra de la creciente cultivo de algas que proporcionará al menos 200 mg de biomasa seca, 400-600 mg es preferible. </li><li> Centrifugar la muestra a 4 º C durante 10 min a 10.000 x g. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con un volumen igual de tampón de fosfato formulado para el mismo pH que el medio de crecimiento. </li><li> Repita el paso 1.2 para un total de 3 etapas de lavado. </li><li> Vuelva a suspender el sedimento en agua desionizada y se transfiere a un plato previamente pesado pesan. Deje secar a 50 º C durante 48 horas. NOTA: El secado al vacío disminuirá el tiempo de secado y secado de la cultura a temperaturas superiores a 50 ° C puede hacer difícil su resuspensión. </li><li> La tienda de cultivos de algas se seca a temperatura ambiente para uso futuro. </li></ol> 2. Cuantificación gravimétrica de lípidos neutros por Hexano Extracción (Adaptado de Bligh y Dyer 4) <ol><li> Mide aproximadamente 50 mg de la biomasa de algas secas en un plato de pesaje. NOTA: misas que van desde 40 hasta 80 mg se pueden utilizar sin pérdida de reproducibilidad. </li><li> Transferir la biomasa a un mortero pre-se lava con hexano. Si es necesario, lavar el plato de pesaje con una pequeña cantidad (1 ml) de hexano usando una pipeta Pasteur con el fin de transferir completamente la biomasa para el mortero. NOTA: El hexano es una sustancia muy volátil y tóxico. Debe manejarse en la campana de humos con ropa protectora adecuada. </li><li> Triturar la biomasa de algas durante 5 minutos usando una mano de mortero. Comience con la molienda suave y poco a poco aumentar la intensidad. Triturar la biomasa en una pasta fina y suave en el período de 5 min. Si el exceso de hexano se utiliza cuando la transferencia de la biomasa para el mortero, lo mejor es esperar a que el hexano se evapore antes de la molienda. </li><li> Añadir unos pocos ml de hexano para el mortero y mezclar la suspensión resultante con la mano del mortero hasta que se homogeneiza. Asegúrese de que todos los restos celulares adherido a las paredes de la mortar se golpeó gratuita y se suspende en el líquido. </li><li> Transferir la mezcla de la masa de células hexano a un tubo de centrífuga. NOTA: El tubo de centrífuga debe ser ya sea de vidrio o de un polímero adecuado compatible con hexano tal como Teflón. </li><li> Repetir los pasos 2.4 y 2.5 hasta que toda la biomasa ha sido transferido al tubo de centrífuga (3-5x). </li><li> Centrifugar la muestra a 4 º C durante 20 min a 10.000 x g. </li><li> Pipetear con cuidado el sobrenadante en un metal pesado previamente pesar la cápsula. Guarde en la campana de humos. </li><li> Realizar una extracción de 2 ª hexano mediante la adición de 3 ml de hexano para el sedimento y vórtex vigorosamente durante 1 min. </li><li> Repita los pasos 2.7 y 2.8. Si es necesario, ejecute las muestras durante 30 minutos en la centrífuga durante la segunda extracción para asegurar que todos los residuos celulares se asienta completamente. Determinar la masa del aceite extraído gravimétricamente después de hexano se haya evaporado por completo. </li></ol> 3. Fluorometric Cuantificación de lípidos neutros Uso Rojo Nilo (como Reported por de la Hoz Siegler et al. 11) NOTA: sólo se necesita 10 l de una suspensión de algas en 5 g / L para la lectura de fluorescencia. Generalmente, el aislamiento de la biomasa de algas seco de 1,5 ml de caldo de cultivo es más que suficiente. Además, la intensidad de luz de la lámpara en el espectrofotómetro puede degradarse con el tiempo. Se recomienda incluir estándares en cada experimento para asegurar que las variaciones en el instrumento no añaden de error innecesaria a las mediciones. <ol><li> Preparar una solución de Rojo Nilo a una concentración de 10 mg / ml disueltos en etanol de grado reactivo de alcohol. Almacenar esta solución en la oscuridad a 4 ° C. </li><li> Prepare una solución de etanol al 30% (v / v) en agua desionizada y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Preparar todas las muestras de algas a la misma concentración de biomasa (se recomienda 5 g / L) y de la misma manera como las normas utilizadas en la medición. Para ello, ni la suspensión de las muestras de pre-secado en la cantidad apropiadade tampón de fosfato (0,6 g / L de fosfato dibásico de potasio, 1,4 g / L de fosfato de potasio monobásico), o el ajuste de la concentración de un cultivo de algas en crecimiento a 5 g / l con tampón de fosfato después de la medición de la turbidez. NOTA: las mediciones realizadas en cultivos de algas en vivo a menudo tienen mayor error asociado con ellos dependiendo de la precisión de la curva de calibración de turbidez. Para resuspender las muestras secas puede requerir el uso de un homogeneizador para dispersar completamente la biomasa. </li><li> Para cada muestra, mezclar 80 l de la solución de etanol al 30%, 10 l de la solución de Rojo Nilo, y 10 l de suspensión de algas en un solo pocillo de una placa de 96 pocillos. Con el fin de tener debidamente en cuenta la variabilidad de la medición de la fluorescencia, realizar 5 repeticiones de cada muestra. </li><li> Ejecutar una curva de calibración de dos puntos con las normas previamente preparadas con el fin de tener en cuenta el día a día de las variaciones en el instrumento y preparación. Preparar los estándares para la medición de fluorescencia utilizando el sprocedimiento AME como las muestras. NOTA: Por lo general dos puntos es suficiente para la recalibración del instrumento, los tres puntos se pueden ejecutar para verificar la linealidad. </li><li> Llevar a cabo las mediciones de fluorescencia en un multi-así espectrofotómetro lector de placas. Se encontraron las siguientes condiciones para obtener los resultados más consistentes 11: <ol><li> Agitar a 1.200 rpm, la órbita de 3 mm, durante 30 segundos. </li><li> Incubar a 40 ° C durante 10 min. </li><li> Agitar a 1.200 rpm, la órbita de 3 mm, durante 30 segundos. </li><li> Fluorescencia Record, excitación a 530 nm, emisión a 604 nm. </li></ol></li><li> Convertir las medidas de fluorescencia para el contenido de aceite utilizando los resultados de las normas internas. </li></ol> 4. Microscopía de fluorescencia Técnica NOTA: El protocolo de tinción descrito en la sección 3 está diseñado para el análisis cuantitativo, pero también puede ser útil para proporcionar representaciones visuales de las técnicas basadas en las manchas de la PU educativo y ilustrativosrposes. Para obtener imágenes de fluorescencia de la muestra se requiere un microscopio óptico con fuentes de transmisión y de iluminación de epifluorescencia adicional tradicionales. Filtros de excitación y emisión de luz en el rango de 530 nm (verde) y 604 nm (rojo), respectivamente, son necesarios para la tinción de Rojo Nilo, así como una cámara montada microscopio con software asociado. Las imágenes mostradas en este estudio (Figura 1) fueron adquiridos utilizando un microscopio de campo claro equipado con una cámara y monocromo a la unidad de convertidor de RGB. El procedimiento de obtención de imágenes de fluorescencia Nilo Rojas uso de estas herramientas se describen a continuación: <ol><li> Preparar una muestra de la cultura con la tinción de Rojo Nilo, según el artículo 3 del Protocolo. NOTA: una muestra en el rango de concentración de 5 g / L produce diapositivas de densidad celular adecuada sin hacinamiento. </li><li> Después de completar el paso 3.6 del protocolo de tinción, preparar un portaobjetos de microscopio de la muestra procesada de acuerdo con los procedimientos estándar de laboratorio. </li><li> Comenzando con el microscopio en el modo de transmisión, cargue la diapositiva preparada en el microscopio, y localizar las células a la ampliación deseada (las imágenes que aparecen en este artículo han sido adquiridos con el objetivo de 100X). </li><li> Una vez enfocado, cambie el microscopio de transmisión a modo de iluminación de epifluorescencia. La fuente de luz ahora debe venir directamente de la lente del objetivo (esto puede confirmarse visualmente observando el espacio entre la corredera y la lente del objetivo). </li><li> Inserte un filtro de excitación verde en la fuente de luz y un filtro de emisión de color rojo en la trayectoria de luz de observación; la fluorescencia de las células teñidas ahora debe ser visible directamente a través del ocular. </li><li> Cambie el modo de observación microscópica del ocular para la cámara montada y utilizar el software de visualización para capturar una imagen de las células fluorescentes. Dependiendo de la sensibilidad de la cámara, la muestra no puede aparecer inicialmente en la ventana de vista previa (es decir, la pantalla seser negro); Para remediar esto, ajuste el tiempo de exposición y ganancia de la cámara a un nivel en el que las células son visibles. Ajustes específicos variarán con los instrumentos, equipos y tipos de células. </li></ol>

<ol><li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+%26+Renewable+Energy%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Department+of+Energy%2C+Office+of+Energy+Efficiency+and+Renewable+Energy%2C+Biomass+Program%22%5BJournal%5D)">National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy.</a> U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf">http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf</a> (2010).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+microalgal+productivity+using+an+adaptive%2C+non-linear+model+based+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy.</a> Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
<li>Hara, A., Radin, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+of+tissues+with+a+low-toxicity+solvent%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent.</a> Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+methods+used+for+microalgal+lipid-content+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Procedia%22%5BJournal%5D)">Review of methods used for microalgal lipid-content analysis.</a> Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).</li>
<li>Pino, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+high+throughput+microscopic+assessment+of+fat+mass+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Sitepu, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+Nile+red+fluorescence+assay+for+estimating+intracellular+lipids+in+a+variety+of+yeast+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species.</a> J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).</li>
<li>Izard, J., Limberger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+quantitation+of+bacterial+cell+lipids+from+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).</li>
<li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reliability+of+fluorescence-based+neutral+lipid+content+measurements+in+microalgal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Algal+Res%22%5BJournal%5D)">Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures.</a> Algal Res. 1, 176-184 (2012).</li>
<li>de la Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+determination+of+lipid+content+in+a+marine+dinoflagellate%2C+Crypthecodinium+cohnii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii.</a> J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).</li>
<li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li>
<li>Feng, G. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li>
<li>Guzmán, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li>
<li>Huang, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomass+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li>
<li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li>
<li>Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertozzini%2C+E+%22J.+Microbiol.+Meth%22">J. Microbiol. Meth</a>. 87, 17-23 (2011).</li>
<li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Las algas utilizado en la curva estándar debe ser de la misma especie de cultivo en las mismas condiciones experimentales como los que están siendo medidos. Los cambios significativos en la composición de los medios de comunicación, técnica de cultivo, y el protocolo de tinción pueden afectar a la intensidad de la lectura de fluorescencia. Extracción con hexano (descrito en las secciones 1 y 2) se utilizó para determinar el contenido de lípidos neutros de muestras utilizadas en la curva estándar. Para las mediciones de ...

Debido a su capacidad para almacenar cuerpos de lípidos bajo determinadas condiciones de estrés, las algas han recibido una gran atención en los últimos años como una potencial fuente de combustible renovable 1,2. Los lípidos neutros pueden representar más del 60% del peso seco de células bajo condiciones de crecimiento apropiadas 3. Sin embargo, la industria no tiene un protocolo estandarizado simple, limpia, rápida y fiable para cuantificar el contenido de lípidos de las células de algas con el fin de supervisar adecuadamente el desempeño de bioprocesos, analizar las culturas, y la pantalla de nuevas cepas. El método gravimétrico Bligh-Dyer desarrolló hace unos 50 años sigue siendo una de las técnicas más comunes que se utilizan hoy en día 4,5. Mientras este procedimiento es simple, fiable, y fácil de llevar a cabo, que consume mucho tiempo, requiere grandes volúmenes de muestra, y hace uso de disolventes tóxicos. No es práctico para el análisis de muchas muestras de una operación de fermentación o el cribado de nuevas cepas ricos en petróleo. Otros métodos han been desarrollado, pero por lo general requiere de equipo avanzado y no se han estandarizado 6. Una alternativa que ha ganado una gran cantidad de interés es la mancha del Nilo Rojo. Rojo Nilo, un tinte que emite fluorescencia preferentemente en entornos no polares, se ha utilizado para identificar o cuantificar cuerpos lipídicos en diversos organismos incluyendo nematodos 7, 8 de levadura, bacterias y algas 9, 10-19. Técnicas iniciales que implican Rojo Nilo eran en su mayoría cualitativa o semi-cuantitativa, la combinación de la mancha con espectrofotometría de una sola cubeta o citometría de flujo. Además, algunas clases de algas tales como algas verdes tienen pocillos de células gruesas que son en su mayoría impermeable al colorante, que limita la gama de la técnica 10. Las recientes mejoras en el método de tinción de Rojo Nilo se ha informado de que pasar por alto las deficiencias iniciales del protocolo de 10,11. La tinción de las células en presencia de un CarrIER disolvente tal como DMSO o 10 10,11 etanol linealiza la relación entre el contenido de aceite y la absorbancia, lo que permite mediciones cuantitativas fiables. El disolvente ayuda a permeabilizar la membrana celular de modo que las moléculas de Rojo Nilo pueden pasar a través. Además, la incorporación de un espectrofotómetro con capacidades de lectura de micro-placa permite protocolos de alto rendimiento adecuadas para el análisis cuantitativo. En este artículo se detallan un método simple para medir el contenido de aceite de las células de algas mediante la tinción con Rojo Nilo culturas en presencia de etanol, un disolvente suave. Con el fin de explicar con mayor precisión el ruido de fondo en las mediciones, una curva estándar de la correlación de la intensidad de fluorescencia para el contenido de aceite se desarrolla utilizando células de algas de composición de aceite conocida. El método es una adaptación de los protocolos publicados previamente 10,11. Mediante el uso de un espectrofotómetro de 96 pocillos, uno es capaz de analizar la misma cantidad de muestras en un tha horast tomaría días para controlar por métodos gravimétricos. Además, por la calibración con muestras representativas de las especies de algas deseada este método produce mediciones relativamente precisos que son directamente interpretables. Existen muchos protocolos de métodos de tinción de algas con Rojo Nilo optimizado para diferentes cepas y aplicaciones que describen; el protocolo que aquí se presenta fue desarrollado originalmente por de la Hoz Siegler et al. 11 para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus y Scenedesmus oblicuo, aunque es probable conveniente para muchas más especies y clases. Ha sido diseñado con la aplicación específica de la supervisión del rendimiento de bioprocesos y funciona igual de bien para muestras previamente secadas y muestras húmedas de una creciente cultura.

<table><tbody><tr><td>Peso en</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>25 ml pipetas desechables</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Bombilla de pipeta</td><td>Fisher</td><td>13-681-51</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Tubos de centrífuga de teflón</td><td>Nalgene Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>Teflón necesario para platos de pesaje de hexano</td></tr><tr><td>(polipropileno)</td><td>Microcentrífuga Fisher</td><td>2-202B</td><td></td></tr><tr><td>de 1,5 ml tubos</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>RC6plus</td><td></td></tr><tr><td>Horno de secado (Fisher 625D)</td><td>Fisher</td><td>13-254-2</td><td></td></tr><tr><td>Viales de almacenamiento</td><td>Fisher</td><td>0337-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa (Eppendorf 5415D)</td><td>Fisher</td><td>05-40-100</td><td></td></tr><tr><td>Cuantificación</td><td></td><td></td><td></td> gravimétrica</tr><tr><td>Mortero de porcelana (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961A</td><td></td></tr><tr><td>Mortero de porcelana (Coorstek)</td><td>Fisher</td><td>12-961-5A</td><td></td></tr><tr><td>40 ml Tubos de centrifugación (FEP)</td><td>Fisher</td><td>05-562-16A</td><td>También podría usar tubos de vidrio</td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio Pasteur</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Platos de pesaje de aluminio</td><td>Fisher</td><td>08-732-101</td><td></td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher</td><td>H292-4</td><td></td></tr><tr><td>Cuantificación fluorométrica del contenido</td><td></td><td></td><td></td>de aceite</tr><tr><td>Lector de placas multipocillos de fluorescencia</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Fluoroskan Ascent</td><td></td></tr><tr><td>Software de lectura de fluorescencia</td><td>Thermo Lab Systems</td><td>Ascent Software 2.6</td><td></td></tr><tr><td>Placa COSTAR de 96 pocillos con fondo redondo</td><td>Fisher</td><td>06-443-2</td><td></td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma</td><td>N3013-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (grado reactivo de alcohol)</td><td>Fisher</td><td>AC65109-0020</td><td></td></tr><tr><td>Imágenes Células</td><td></td><td></td><td></td>fluorescentes</tr><tr><td>Microscopio Leica DMRXA2 (o equivalente)</td><td>Portaobjetos</td> de microscopio Leica <td>DMRXA2</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td></td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio</td><td>Fisher</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Qimaging</td><td>Retiga Ex</td><td></td></tr><tr><td>Software de imagen</td><td>Qimaging</td><td>QCapture v.1.1.8</td><td></td></tr></tbody></table>

un simple y protocolo rapid para medir lípidos neutros en las células de algas utilizando fluorescencia

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Las algas son consideradas excelentes candidatos para las fuentes de combustibles renovables, debido a sus capacidades de almacenamiento de lípidos naturales. Monitoreo robusto de los procesos de fermentación de algas y la detección de nuevas cepas ricas en petróleo requiere un protocolo rápido y fiable para la determinación del contenido intracelular de lípidos. Prácticas actuales se basan en gran medida en los métodos gravimétricos para determinar el contenido de aceite, técnicas desarrolladas hace décadas que consumen mucho tiempo y requieren grandes volúmenes de muestra. En este papel, Rojo Nilo, un colorante fluorescente que se ha utilizado para identificar la presencia de cuerpos de lípidos en numerosos tipos de organismos, se incorpora en un protocolo simple, rápido y fiable para medir el contenido de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, un verde alga. El método utiliza etanol, un disolvente relativamente suave, para permeabilizar la membrana celular antes de la tinción y un pozo de micro-placa de 96 para aumentar la capacidad de la muestra durante las mediciones de intensidad de fluorescencia. Ha sido diseñadoedición con la aplicación específica de la supervisión del rendimiento bioprocesos. Muestras previamente secado o muestras vivos de un cultivo en crecimiento se pueden utilizar en el ensayo.

Células de algas representativos teñidas con colorante rojo Nilo se muestran en la Figura 1. Partes A y B de 1 visualización Figura imágenes de A. protothecoides cultivan en exceso de nitrógeno, lo que lleva a la acumulación intracelular de lípidos muy bajo. En las partes C y D, las muestras de A. se muestran protothecoides cultivadas bajo limitación de nitrógeno. Bajo ilumina...

Un protocolo simple para determinar el contenido de lípidos neutros de células de algas utilizando un procedimiento de tinción de Rojo Nilo se describe. Esta técnica de ahorro de tiempo ofrece una alternativa a los protocolos de cuantificación de lípidos basados ​​en gravimétricos tradicionales. Ha sido diseñado para la aplicación específica de la supervisión del rendimiento de bioprocesos.

Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir el contenido de lípidos neutros en células algales utilizando el colorante fluorescente rojo Nilo. Esto se logra primero suspendiendo las células en una solución de etanol para permeabilizar la pared celular y la membrana celular. Como segundo paso, se añade el colorante fluorescente rojo Nilo, que penetra en las células y se acumula en las regiones no polares de la célula, incluyendo los cuerpos de lípidos neutros.A continuación, las muestras se exponen a una fuente de luz de excitación de 530 nanómetros, lo que provoca que el rojo Nilo absorbido en los cuerpos de lípidos neutros fluoresca a 604 nanómetros. Los resultados se obtienen a escala masiva realizando las pruebas individuales en una placa multipozo y utilizando un espectrofotómetro para generar lecturas rápidas de fluorescencia. Las lecturas muestran una relación lineal entre el contenido de lípidos neutros de las células algales y la intensidad de la medición de fluorescencia.La conversión de mediciones de fluorescencia en contenido de aceite puede lograrse mediante una curva de calibración preparada con células de composición lipídica conocida. La principal ventaja

a-simple-rapid-protocol-for-measuring-neutral-lipids-algal-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Se introduce una rápida basada en fluorescencia ensayo que controla la tasa de extinción de fluorescencia como una medida de la actividad del canal gramicidina. Los canales de gramicidina se utilizan como sensores de fuerza molecular para monitorear los cambios en las propiedades de bicapa lipídica detectada por las proteínas de dos capas de expansión.

Gramicidina basado en ensayo de fluorescencia, para la determinación de moléculas pequeñas posibles para modificar las propiedades bicapa lipídica

Este video muestra un protocolo para detectar y cuantificar lípidos neutros en células de algas tiñéndolas con colorante rojo del Nilo.

Tinción de rojo del Nilo: una técnica para detectar y cuantificar lípidos neutros intracelulares en algas

Un método para la determinación del contenido de ácido graso y la composición en microalgas basado en disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, de transesterificación, y la cuantificación e identificación de los ácidos grasos utilizando cromatografía de gases se describe. Un estándar interno tripentadecanoin se utiliza para compensar las posibles pérdidas durante la extracción y la transesterificación incompleta.

Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas

Describimos un ensayo basado en fluorescencia para medir la mezcla de fosfolípidos en grandes liposomas unilamelares reconstituidos con opsina.

Un ensayo basado en la fluorescencia de fosfolípido escramblasa Actividad

Aquí, describimos un protocolo para obtener el lípido gotitas índice (LD) para estudiar la dinámica de triacilgliceroles en las células cultivadas en experimentos de alto rendimiento. El ensayo de índice de LD es un método sencillo y fiable que utiliza BODIPY 493/503. Este ensayo no es necesario dispendious extracción o análisis de la microscopia.

Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

Aquí, presentamos un protocolo para construir laboratorio burbuja columna fotobiorreactores y usarlos para cultivo de microalgas. También proporciona un método para la determinación de la tasa de crecimiento del cultivo y el contenido de lípidos neutros.

Cultivo de microalgas verdes en fotobiorreactores de columna de burbuja y un análisis de lípidos neutros

Este protocolo describe un ensayo para la caracterización de la formación de gotas lipídicas (LD) en organoides intestinales humanos tras la estimulación con ácidos grasos. Discutimos cómo se utiliza este ensayo para la cuantificación de la formación de LD, y cómo se puede utilizar para la detección de alto rendimiento de medicamentos que afectan a la formación de LD.

Un ensayo basado en fluorescencia para la caracterización y cuantificación de la formación de gotas lipídicas en organoides intestinales humanos

Este protocolo describe la fabricación de liposomas y cómo estos pueden ser inmovilizados en una superficie e imágenes individualmente de una manera paralela masiva utilizando microscopía de fluorescencia. Esto permite la cuantificación del tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre los liposomas individuales de la población.

Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales

Aquí, describimos protocolos que utilizan sensores de lípidos fluorescentes y liposomas para determinar si una proteína extrae y transporta fosfatidilserina o fosfatidilinositol 4-fosfato in vitro.

Mediciones basadas en fluorescencia del intercambio de fosfatidilserina/fosfatidilinositol 4-fosfato entre membranas

Este protocolo presenta un método de imagen de fluorescencia que utiliza una clase de fluoróforos lipídicos sensibles al pH para monitorear el tráfico de membranas lipídicas durante la exocitosis celular y el ciclo de endocitosis.

Medición del recambio de lípidos de membrana con el análogo lipídico fluorescente sensible al pH ND6

El presente protocolo describe imágenes de autofluorescencia paso a paso y la evaluación de los cambios de ficobiliproteína en algas rojas basadas en análisis espectral. Este es un método no destructivo y sin etiquetas para evaluar la adaptación celular a hábitats extremos, cuando solo hay material escaso disponible y las células crecen lentamente, o no crecen en absoluto, en condiciones de laboratorio.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar la fisiología de las algas rojas

Aprende a medir lípidos neutros en células de algas mediante tinción con Rojo Nilo y espectrofotometría de fluorescencia. Este protocolo rápido facilita el monitoreo eficiente de bioprocesos de cultivo algal.

Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

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