Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia

El objetivo general del siguiente experimento es medir el contenido de lípidos neutros de las células de algas utilizando un tinte fluorescente rojo del Nilo. Esto se logra suspendiendo primero las células en una solución de etanol para permear la pared celular y la membrana celular. Como segundo paso, se agrega un tinte fluorescente rojo del Nilo, que ingresa a las células y se acumula en las regiones no polares de la célula, incluidos los cuerpos lipídicos neutros.

A continuación, las muestras se exponen a una fuente de luz de excitación de 530 nanómetros, lo que hace que el rojo del Nilo absorbido en los cuerpos lipídicos neutros emita una fluorescencia de 604 nanómetros. Los resultados se obtienen a escala masiva mediante la realización de las pruebas individuales en un micro pocillo múltiple y el uso de un espectrofotómetro para producir lecturas rápidas de fluorescencia. Las lecturas muestran una relación lineal entre el contenido neutro de lípidos de las células lgal y la intensidad de la medición de fluorescencia.

La conversión de las mediciones de fluorescencia en contenido de aceite se puede lograr con una curva de calibración preparada con celdas de composición de aceite conocida. La principal ventaja de esta técnica sobre los protocolos existentes, como el método gravimétrico Bly dire, es que permite la determinación rápida del contenido de lípidos neutros utilizando materiales disponibles para la mayoría de los laboratorios. Este método proporciona información inmediata sobre el rendimiento del bioproceso durante el cultivo de algas.

Además, el alto rendimiento permitido por el lector de placas de 96 pocillos es ideal para estudios de cribado y experimentos factoriales. Aunque esta técnica ha sido optimizada para chlorella y s Desus, puede modificarse fácilmente para el análisis de otras especies de lgal. Bien. Para comenzar, extraiga un volumen de muestra del cultivo de algas en crecimiento que proporcione al menos 200 miligramos de biomasa seca.

De 400 a 600 miligramos es preferible. Centrifugar la muestra a cuatro grados centígrados durante 10 minutos 10.000 veces. G, deseche el sobrenadante y lave el pellet con un volumen igual de tampón de fosfato formulado al mismo pH que el medio de crecimiento.

Repita este proceso para un total de tres pasos de lavado. Vuelva a suspender el pellet en agua desionizada y transfiéralo a un plato de pesaje previamente pesado. Deje secar la muestra a 50 grados centígrados durante 48 horas.

Los cultivos de algas secas se pueden almacenar a temperatura ambiente para su uso futuro. Mida aproximadamente 50 miligramos de biomasa de algas secas en una placa de suero. Transfiera la biomasa a un mortero prelavado con hexano si es necesario, lave la placa de suero con una pequeña cantidad de hexano utilizando una pipeta pasada para transferir completamente la biomasa al pedido de mortero.

A continuación, muele la biomasa de algas durante cinco minutos con un mortero. Comience con una molienda suave y aumente gradualmente la intensidad. Muele la biomasa hasta obtener una pasta fina y suave.

Durante el periodo de cinco minutos, añadir unos mililitros de hexano al mortero y mezclar el purín resultante con el mortero hasta homogeneizarlo. Asegúrese de que todos los restos de celda adheridos a las paredes del mortero se liberen y se suspendan en el líquido. A continuación, transfiera la mezcla de masa de células de hexano a un tubo de centrífuga compatible.

Repita de tres a cinco veces hasta que toda la biomasa se haya transferido al tubo de centrífuga. Centrifugar la muestra a cuatro grados centígrados durante 20 minutos 10.000 veces. G.Después de la centrifugación, pipetee cuidadosamente el sobrenadante en un plato de vía metálica previamente pesado, que se puede almacenar en la campana extractora.

Realice una segunda extracción de hexano añadiendo tres mililitros de hexano al pellet y vórtice vigorosamente. Durante un minuto, repita la centrifugación y la transferencia del sobrenadante. Determine la masa gravimétrica del aceite extraído después de que el hexano se haya evaporado por completo.

Para la cuantificación fluorométrica, prepare todas las muestras de algas a la misma concentración de biomasa y de la misma manera que los estándares utilizados en la medición. Para ello, suspenda las muestras presecas en la cantidad adecuada de tampón de fosfato. Si es necesario, utilice un homogeneizador para facilitar la suspensión de resus de las células lgales secas.

Para cada muestra, mezcle 80 microlitros de una solución preparada de etanol al 30%, 10 microlitros de una solución preparada de rojo del Nilo y 10 microlitros de suspensión de algas en un solo pocillo de una placa de 96 pocillos. Para tener en cuenta adecuadamente la variabilidad de la medición de fluorescencia, realice cinco réplicas de cada muestra. A continuación, ejecute una curva de calibración de dos puntos con estándares preparados previamente.

Con el fin de tener en cuenta las variaciones diarias en el instrumento y la preparación para realizar las mediciones de fluorescencia en un espectrofotómetro lector de placas de pocillos múltiples, configure los parámetros para que vibren a 1.200 RPM y orbiten tres milímetros durante 30 segundos, seguidos de la incubación a 40 grados Celsius durante 10 minutos. Otra sacudida a 1.200 RPM y órbita de tres milímetros durante 30 segundos, y para registrar fluorescencia con excitación a 530 nanómetros y emisión a 604 nanómetros. A continuación, comience la carrera como paso final.

Convierta las mediciones de fluorescencia en contenido de aceite utilizando los resultados de los estándares internos para realizar microscopía de fluorescencia. Utilice la muestra preparada con la tinción roja del Nilo para preparar un portaobjetos de microscopio de la muestra de proceso de acuerdo con los procedimientos estándar de laboratorio. Comenzando con el microscopio en modo de transmisión, cargue el portaobjetos preparado en el microscopio y ubique las células con el aumento deseado.

Una vez enfocado, cambie el microscopio del modo de iluminación de transmisión a epifluorescencia. La fuente de luz ahora debería provenir directamente de la lente del objetivo, lo que se puede confirmar visualmente observando el espacio entre la diapositiva y la lente del objetivo. Inserte un filtro de excitación verde en la fuente de luz y un filtro de emisión rojo en la trayectoria de la luz de observación.

La fluorescencia de las células teñidas ahora debería ser directamente visible a través del ocular. Cambie el modo de observación del microscopio del ocular a la cámara montada y utilice el software de visualización para capturar una imagen de las células fluorescentes. Los ajustes específicos variarán según los instrumentos, el equipo y los tipos de células.

Las células de algas representativas teñidas con colorante rojo del Nilo se muestran imágenes de un proto cultivado en exceso de nitrógeno que conduce a una acumulación de lípidos intracelular muy baja, que se muestran en contraste con las muestras de OID cultivadas bajo limitación de nitrógeno. Bajo la iluminación de transmisión, los cuerpos lipídicos de las células se pueden visualizar con una inspección cuidadosa, donde aparecen como estructuras circulares brillantes y constituyen la mayor parte del volumen de la célula. Las celdas que se muestran aquí tienen solo un 5% de aceite por peso seco y no contienen niveles significativos de cuerpos lipídicos cuando se les muestran las condiciones de luz adecuadas.

Las diferencias en estas muestras se magnifican. Las células magras en aceite aparecen como anillos fluorescentes con cuerpos oscuros, mientras que las células ricas en aceite muestran un brillo rojo anaranjado brillante donde han acumulado cuerpos lipídicos. El rojo del Nilo emitirá fluorescencia en diferentes longitudes de onda dependiendo de la presencia de lípidos neutros, fosfolípidos ubicados en la pared celular y proteínas celulares no polares, razón por la cual las células magras de aceite aparecen como anillos fluorescentes con cuerpos oscuros.

Esta no especificidad es también lo que causa el nivel de fondo de fluorescencia durante las mediciones del espectrofotómetro de los lípidos neutros en las condiciones optimizadas del ensayo, las curvas de calibración con valores de R cuadrado superiores a 0,980 son fácilmente alcanzables. La relación entre el contenido de aceite celular y la fluorescencia se vuelve no lineal si las células se tiñen en una solución, sin un solvente portador como el etanol. Los datos aquí presentados tienen un cuadrado R de 0,395, y se obtuvieron mediante la realización del protocolo en una solución de etanol al 0%.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 15 a 20 minutos si se realiza correctamente. Al realizar este procedimiento, es fundamental asegurarse de que todas las muestras se preparen a la misma concentración de biomasa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el contenido de lípidos neutros de las células lgal utilizando los protocolos tradicionales de extracción de hexano y el procedimiento más simple de tinción fluorescente de rojo NAL.