El aislamiento de los pequeños RNAs no codificantes de suero humano

El objetivo general de este procedimiento es aislar ARN de alta calidad a partir de muestras de suero. Para ello, se utiliza nuestra versión optimizada del protocolo común de reactivo MRC try RTLS. Esto se logra diluyendo primero el suero en una proporción de uno a cinco con agua libre de nucleasas para reducir la contaminación por proteínas.

El segundo paso consiste en introducir dos tubos de bloqueo de fase de mililitro para el primer paso de centrifugación. Esto atrapa la mayor parte de los contaminantes, como el fenol y las proteínas en la fase orgánica. A continuación, el tercer y último paso de optimización es la centrifugación rápida a 12.000 cheese, que elimina cualquier contaminación residual del precipitado de ARN antes de los lavados con etanol.

El paso final consiste en combinar dos preparaciones de ARN modificado del mismo paciente si se requiere un rendimiento total mayor de ARN. En definitiva, al utilizar este método modificado, que solubiliza el suero en agua libre de nucleasas, emplea un tubo con bloqueo de fase para retener los contaminantes principales e introduce una centrifugación rápida, demostramos que es posible maximizar la recuperación de ARN no codificantes pequeños a partir de un aislamiento de ARN del suero.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el protocolo estándar de aislamiento de ARN con triol, es que mediante modificaciones sencillas podemos maximizar el rendimiento de ARN a partir de suero. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque los ARN pequeños se encuentran en bajas cantidades en el suero. El método optimizado y la visualización de estos pasos mejorarán la recuperación de estos ARN y guiarán a los principiantes hacia un aislamiento exitoso.

Para comenzar, descongele la muestra de suero previamente preparada sobre hielo y luego transfiera 400 microlitros del suero recién descongelado a un tubo microcentrífugo etiquetado. A continuación, diluya el suero con 100 microlitros de agua libre de RNasa y agregue 50 microlitros de proteinasa K a una concentración de un miligramo por mililitro. Incube entonces el suero diluido a 37 grados Celsius durante 20 minutos para permitir una digestión proteica adecuada y asegurar la completa solubilización con 1,5 mililitros de tri reactivo RTLS y 100 microlitros de cuatro promonol.

Invierta brevemente el homogenato y realice pipeteo repetitivo durante cinco segundos. A continuación, transfiera la mezcla a un tubo de bloqueo de fase pesada de dos mililitros etiquetado. Centrifugue el homogenato a 12,000 GS durante 20 minutos a cuatro grados Celsius.

A continuación, vierta cuidadosamente un mililitro de la solución acuosa resultante en un tubo nuevo de ADN de baja retención. La fase orgánica y la interfase deben quedar atrapadas debajo del gel blanco del tubo con bloqueo de fase. Luego, agregue cinco microlitros de glicógeno y 500 microlitros de isopropanol al 100 % a la solución acuosa.

Mezcle la solución mediante inversión e incúbela durante la noche a menos 20 grados Celsius. Tras la incubación nocturna, centrifugue la muestra durante 20 minutos a 12.000 GS en una centrífuga a cuatro grados Celsius. A continuación, deseche el sobrenadante claro y realice una centrifugación rápida durante dos minutos a 16.000 GS en una centrífuga a cuatro grados Celsius.

Utilizando una pipeta, retire cuidadosamente la solución clara que rodea el precipitado. Luego, lave el precipitado con un mililitro de etanol al 70 % y centrifugue la muestra a 10,000 ×g durante 10 minutos. Para visualizar el precipitado, incline el tubo frente a un fondo oscuro y deseche la solución de lavado.

Repita el lavado. Paso siguiente. Suspender el precipitado en 10 microlitros de agua libre de ARN.

Asegúrese de que el pellet esté completamente disuelto calentando la muestra a 55 grados Celsius durante cinco minutos. Durante este tiempo, mezcle la muestra mediante pipeteo repetido para obtener un mayor rendimiento total de ARN, dos preparaciones de ARN del mismo paciente. Cuantifique el ARN resuspendido utilizando un UV frente a.

Espectrofotómetro y evalúe la calidad del ARN utilizando un bioanalizador 2100. Luego, almacene las muestras de ARN agrupadas a menos 80 grados Celsius para su uso en aplicaciones posteriores. Los perfiles espectrofotométricos de ARN de suero humano demuestran el mayor rendimiento de ARN debido a la adición de varios pasos al enfoque tradicional de chum Chomsky.

Un perfil típico de UV de ARN aislado de suero humano contrasta con aquellos que utilizan pasos de optimización, incluyendo la adición de glicógeno y centrifugaciones adicionales, y la combinación de cada una de esas herramientas, lo que resulta en una reducción de contaminantes y un mayor rendimiento total de ARN. La pureza de la muestra de ARN se incrementó aún más mediante el uso de un gel de bloqueo de fases, que atrapa el fenol y las proteínas. Además, aumentar el volumen de suero tiene un impacto notable en el rendimiento de ARN.

Se realizó un rastreo en bioanalizador para analizar más a fondo la calidad de la muestra. Un único pico a aproximadamente 21 nucleótidos representa la fracción de microARN. Se realizó el perfilado con matriz y QPCR siguiendo el procedimiento. Este perfil de matriz de tres cánceres de cabeza y cuello y una muestra normal S muestra la expresión de microARNs, analizada mediante agrupamiento jerárquico y presentada como un mapa de calor donde pueden observarse la sobreexpresión y la subexpresión de los microARNs.

Se generaron curvas de amplificación mediante qPCR para microARNs específicos. Estos datos se utilizaron luego para graficar los valores de CT brutos del suero normal. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cualquier número de pacientes, produciendo ARN de alta calidad en el máximo nivel actual si se lleva a cabo correctamente siguiendo el procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como PCR cuantitativa o secuenciación de nueva generación para responder preguntas adicionales, como el descubrimiento y la validación de biomarcadores.