Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

El objetivo general de este procedimiento es observar la interacción dinámica entre una única proteína de unión al ADN y una molécula de ADN. Esto se logra combinando, en un microscopio construido a medida, dos técnicas de molécula individual: pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Esta configuración también está equipada con iluminación de campo claro para la visualización y estabilización del muestra a nivel nanométrico.

Como segundo paso, se construye una celda de flujo multicanal integrada en un sistema de flujo microscópico para permitir hasta cuatro flujos laminares que recluten y ensamblen eficientemente todos los componentes necesarios para el experimento. A continuación, se ensambla el constructo de molécula individual con el fin de realizar los experimentos. Primero, dos microesferas recubiertas con titina en tira son capturadas con pinzas ópticas duales en el primer canal.

A continuación, los dos microesferas atrapadas se desplazan al segundo canal para permitir la unión de la plantilla de ADN marcada con biotina en ambas extremidades. La presencia de una única molécula de ADN se verifica en el tercer canal mediante un análisis de extensión por fuerza del ADN. Por último, el montaje de microesfera-ADN-microesfera, denominado mancuerna de ADN, se mueve al canal de proteína donde se encuentra la proteína represora de lactosa marcada con fluorescencia.

Se obtienen resultados que muestran la difusión y la unión específica de moléculas individuales de LAC eye sobre una única molécula de ADN estirada y la cuantificación de los parámetros cinéticos del movimiento de LAC eye. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes de molécula individual son la posibilidad de controlar la tensión aplicada a la molécula de ADN, la posibilidad de rastrear con precisión los movimientos de las proteínas ligadas sobre un punto estable a escala nanométrica, así como la capacidad de operar lejos de la superficie del cubreobjetos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones proteína-ADN, especialmente sobre la mecánica de la regulación de la expresión génica, así como sobre la dinámica de la difusión proteica a lo largo del ADN en los mecanismos de búsqueda de dianas.

Esta demostración de este método es muy útil para mostrar los aspectos prácticos de la construcción de la celda de flujo, el manejo de muestras y el ensamblaje del constructo de perlas de ADN batiente. Este video demostrará primero cómo verificar la estabilidad direccional de los dos láseres de atrapamiento utilizando microperlas adheridas a la superficie de un cubreobjetos como referencia. Los detalles sobre el diseño y la construcción del sistema de pinzas ópticas se pueden encontrar en el texto del protocolo adjunto.

Utilice un cubreobjetos de 24 por 60 milímetros para extender dos microlitros de perlas de sílice sobre la superficie de un cubreobjetos de 24 por 32 milímetros. Usando dos trozos de cinta adhesiva doble cara, fije el cubreobjetos de 24 por 32 milímetros sobre una portaobjetos para crear una celda de flujo.

Llene la celda de flujo con 50 milimolares de tampón fosfato y séllela con grasa de silicona imagen. Un microesfera de sílice en microscopía de campo brillante a aproximadamente 2000 aumentos. El campo de visión debe ser de aproximadamente siete por cinco micrómetros adquirido a 768 por 576 píxeles, de modo que la imagen de la microesfera tenga un diámetro de aproximadamente 190 píxeles. Compense las derivas térmicas con un software de retroalimentación que calcule la posición XY a partir del centro de la imagen y la posición Z a partir de los anillos de difracción, y corrija las derivas.

Mueva un escenario piezo con precisión de nanómetros o mejor superponga el centro de la trampa izquierda con el centro del perla y mida el ruido de posición y su desviación estándar desde el fotodiodo del detector de cuadrantes o QDP. Repita la medición para la trampa derecha. La desviación estándar del ruido de posición debe estar dentro de unos pocos nanómetros para permitir la localización precisa de proteínas de unión al ADN al fabricar la celda de flujo.

Primero se utiliza una punta de diamante para perforar orificios de un milímetro de diámetro en una microplaca de 76 por 76 por un milímetro. Esto crea cuatro entradas y una salida. Esto permitirá hasta cuatro flujos paralelos de tampón.

Cada uno contiene uno de los diferentes componentes necesarios para el experimento: perlas, ADN, proteína marcada con fluorescencia y tampón de imagen. Limpie la lámina del microscopio con etanol y centre el puerto con la junta tórica insertada y el anillo adhesivo en la lámina alrededor de los orificios de acceso. Es esencial usar guantes durante este paso para evitar huellas dactilares, que podrían interferir con el proceso de pegado.

Con la ayuda de una segunda portaobjetos, sujete los nano puertos al portaobjetos y colóquelo en un horno precalentado a 180 grados Celsius durante una hora para permitir la fijación completa. Mientras tanto, dibuje el patrón del contorno de la celda de flujo sobre un papel. El canal debe tener aproximadamente tres milímetros de ancho y coincidir con las posiciones del portaobjetos en el microscopio.

Coloque el dibujo encima de dos piezas de perfil y, con un escalpelo, realice cortes precisos y continuos siguiendo el contorno trazado. Retire cualquier protuberancia formada, deseche la capa inferior de parfum, que solo se utiliza para garantizar un soporte limpio. A continuación, coloque la portaobjetos que contiene los nano puertos adheridos boca abajo en el soporte metálico.

Alinee cuidadosamente el contorno de la cámara de parafina con los orificios, asegurándose de que la parafina no sobresalga de las entradas y salida de la tapa de la cámara. Cubra con una laminilla de microscopio limpia y retire cuidadosamente el exceso de parafina alrededor de la cámara. Coloque dos bloques térmicos previamente calentados a 120 grados Celsius encima de la celda de flujo para aplicar una presión homogénea sobre ella. Deje que la película de parafina se derrita durante aproximadamente 25 minutos.

El siguiente paso consiste en preparar el depósito de presión y los recipientes de tampón. El depósito de presión está hecho de plexiglás y permite alojar hasta seis recipientes de tampón. En primer lugar, conecte las válvulas de cierre a la salida de los recipientes de tampón para activar el flujo de tampón con la palanca de la válvula en posición vertical o desactivarlo en la posición girada en sentido horario.

Durante los experimentos, monte la celda de flujo sobre la platina del microscopio. Luego conecte las válvulas de cierre a través del tubo de poli éter, éter cetona, o tubo peak, y las conexiones sin brida a las entradas de la cámara de flujo. El tubo peak tiene un diámetro interno de aproximadamente 150 micrómetros kilómetros; aproximadamente tres centímetros de tubo de politetrafluoroetileno con un diámetro interno de aproximadamente 500 micrómetros se utilizan como conexión entre el tubo peak y los ensamblajes de nanoconectores de la celda de flujo.

Esto es esencial para reducir el flujo del tampón en la entrada de la cámara y evitar la rotura de la celda de flujo o la desconexión del puerto nano del vidrio. Por otro lado, el uso de tubos con un diámetro interno grande requeriría grandes volúmenes de muestras biológicas. Conecte la salida de la cámara de flujo a un tubo Falcon abierto a presión atmosférica.

Este tubo sirve para desechar el tampón que fluye fuera de la cámara de flujo. Para comenzar este procedimiento, agregue un mililitro de tampón A a cada uno de los recipientes de tampón y aplique 200 milibares de presión para lavar los tubos de conexión y la celda de flujo. Un sistema de control de presión es capaz de hacerlo.

Finalmente, ajuste la presión del aire dentro del depósito de presión. Verifique la presencia de burbujas de aire, que podrían interrumpir la fluidez del flujo. Un ligero golpe en el tubo de salida ayudará a eliminar cualquier burbuja residual, reduzca la presión a 20 milibares y verifique que todos los canales y tubos estén libres de burbujas de aire y que el tampón fluya con velocidades similares en todos los canales.

Prepare las muestras hasta un volumen final de 300 microlitros. Este experimento utiliza perlas de poliestireno recubiertas con strept, ADN lineal biotinilado en ambos extremos que contiene secuencias diana específicas para la unión del represor de lactosa y proteína represora de lactosa marcada con fluorescencia. Añada cada muestra a uno de los contenedores de jeringa en el siguiente orden: perlas en el primer canal, ADN en el segundo, tampón de imagen en el tercero y proteína marcada en el cuarto canal.

Active el flujo a 20 milibares y abra las válvulas de cierre para permitir que las muestras lleguen al canal de flujo. Esto se detecta fácilmente en el canal de microesferas. Mientras se obtiene la imagen del primer canal bajo iluminación de campo claro, encienda las dos pinzas ópticas y capture una microesfera de poliestireno en cada trampa.

Mueva rápidamente al segundo canal para evitar que las otras perlas caigan en las trampas. Observe que la llegada al canal de ADN es fácilmente notable por el final del flujo de perlas. Utilizando un desviador óptico AO o un movimiento OD, mueva una perla atrapada de un lado a otro en la proximidad de la otra perla para permitir la unión del ADN extendido por flujo entre las dos perlas atrapadas ópticamente.

Cuando se forma un dumbbell de ADN, la perla estática comienza a seguir el movimiento de la perla que se mueve activamente de un lado a otro mediante la trampa. Muévase rápidamente al canal de tampón y detenga el flujo de tampón. Realice un análisis de la curva de fuerza-extensión para verificar la presencia de una sola molécula de ADN.

Esto se logra separando los dos perlas mientras se mide la tensión del ADN. Una vez obtenido un solo dumbbell de ADN, active nuevamente el flujo y mueva el dumbbell al canal de proteína. Cambie a microscopía de fluorescencia de campo amplio para monitorear la interacción de la proteína represora de lactosa marcada con el ADN, detenga el flujo e inicie la adquisición.

Este método permite la detección de una sola molécula de represor de lactosa o de lac eye interactuando con una molécula de ADN estirada. En este diagrama CH representativo, una sola molécula de lac eye se difunde a lo largo de secuencias de ADN no específicas, mientras que otra molécula de lac eye está unida específicamente a un operador situado en el centro de la molécula de ADN. Este gráfico muestra la posición de las dos moléculas de lac eye a lo largo de la dirección que conecta los centros de las dos trampas.

En función del tiempo, las posiciones de las moléculas fueron determinadas mediante el algoritmo del centro de simetría radial. Aquí se muestra un gráfico del desplazamiento cuadrático medio o MSD frente al tiempo para una única molécula lac eye que difunde a lo largo de una molécula de ADN estirada. El coeficiente de difusión de la proteína puede obtenerse fácilmente mediante regresión lineal de los datos. La combinación de técnicas de manipulación y de imagen constituye un método potente, que permite el control mecánico de un solo polímero biológico, como ADN, ARN o un filamento del citoesqueleto, y la localización simultánea de moléculas individuales de proteína que interactúan con el polímero mismo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que combinar técnicas de manipulación e imagen a nivel de molécula individual requiere un diseño cuidadoso del montaje experimental para garantizar la estabilidad a nivel nanométrico del polímero suspendido. Por otro lado, se necesita un diseño adecuado de la sonda biológica para asegurar una separación espacial entre el láser de trampa G y la sonda fluorescente. Consulte el texto del protocolo adjunto para obtener más detalles.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar la molécula de ADN entre los dos latidos ópticos rápidos del ensamblaje de este constructo. Se obtiene mejor con la celda de flujo multicanal para la cual proporcionamos la descripción detallada. También indicamos cómo optimizar el flujo del tampón y eliminar las burbujas de aire, las cuales de lo contrario podrían comprometer sus experimentos.

En el protocolo de texto combinado, puede encontrar los protocolos para marcar el ADN con bioTE, lo cual es necesario para el ensamblaje con las perlas recubiertas de estreptavidina, así como los protocolos para marcar la proteína. Finalmente, ilustramos las operaciones paso a paso para cuantificar la unión y la difusión de una única proteína represora de lactosa sobre una molécula de ADN extendida.