Name: Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprende a estudiar interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única combinando pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Este método permite observar la dinámica de unión con precisión nanométrica.

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Agradecemos a Gijs wuite, Erwin JG Peterman, y Peter Gross para obtener ayuda con la microfluídica y Alessia Tempestini para obtener ayuda con la preparación de muestras. Esta investigación fue financiada por la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (7PM / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 284464 y del Ministerio de Educación, Universidad e Investigación FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro italiano Ricerca 2013 RBFR13V4M2, y en el marco de la NANOMAX proyecto emblemático.

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<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
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<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
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<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la última década, las técnicas de manipulación y de imágenes de moléculas individuales se han visto grandes avances en términos de resolución espacial y temporal. La combinación de técnicas de manipulación y de imagen está en la base de instrumentos de gran alcance que ahora permiten el control de las condiciones mecánicas de un solo polímero biológico, tales como ADN, ARN o filamentos del citoesqueleto, y la localización simultánea de proteínas individuales interactuar con el mismo polímero . El control de las condi...

Molécula individual (SM) técnicas han evolucionado mucho en los últimos treinta años para responder a la necesidad de superar algunas de las limitaciones de las mediciones de soluciones tradicionales, a granel 1.3. La manipulación de las moléculas biológicas individuales ha creado la oportunidad para medir las propiedades mecánicas de los biopolímeros 4 y controlar los parámetros mecánicos de proteína-proteína 5 y proteína-DNA 6,7. Detección de fluorescencia SM, por otro lado, representa una herramienta muy versátil para el estudio de actividad de la proteína in vitro e in vivo, dando lugar a la posibilidad de localizar y rastrear moléculas individuales con precisión nanométrica. A través del punto de ajuste de amplio función del instrumento a la imagen SM, de hecho, se puede lograr la localización con una precisión dependiendo principalmente de la relación señal a ruido (SNR) y alcanzando un límite de alrededor de un nanómetro 8,9. Estas metodologías se encuentran potenteaplicaciones en el estudio de la dinámica de las proteínas motoras, así como de los procesos de difusión subyacentes búsqueda de objetivos en las proteínas de unión al ADN. La capacidad de determinar constantes de difusión como una función de la secuencia de ADN, tiempo de residencia en el objetivo y con precisión la medición de la longitud del ADN explorado durante los eventos de difusión unidimensionales, representa una poderosa herramienta para el estudio de la dinámica de interacción de proteínas de ADN y para la investigación de los mecanismos de búsqueda de objetivo específico. Recientemente, la combinación de estas dos técnicas se ha producido una nueva generación de montajes experimentales 10-14 que permitan la manipulación simultánea de un sustrato biológico (por ejemplo, un filamento de actina o una molécula de ADN) y la detección / localización de una enzima interacción socio (por ejemplo, miosina o una proteína de unión al ADN). Las ventajas de estas técnicas se basan principalmente en la posibilidad de ejercer el control mecánico sobre el polímero atrapado, por lo tanto enabling el estudio de la dinámica de interacción frente a fuerzas o pares. Además, la metodología permite la medición de las reacciones bioquímicas lejos de la superficie, evitando una de las principales limitaciones de los métodos clásicos SM, es decir, la necesidad de inmovilización de las moléculas en estudio sobre una superficie (portaobjetos de vidrio o microesferas). La combinación de dos técnicas de moléculas individuales es necesario superar varias dificultades técnicas, fundamentalmente como consecuencia de las exigencias de estabilidad mecánica y SNR adecuado (sobre todo cuando se requiere la localización con precisión nm) 15. En particular, si se acoplan detección por fluorescencia SM con pinzas ópticas, la reducción de ruido y photobleaching de los láseres infrarrojos captura 16 y el control de los buffers bioquímicos para el ensamblaje de los complejos biológicos y el rendimiento de las mediciones experimentales 11 son de suma importancia. A continuación, describimos los métodos para realizar con éxitomediciones en una configuración de localización de captura / SM fluorescencia dual. La metodología se ilustra con el ejemplo de la proteína represora lactosa (LacI) marcado con fluorescencia (con Atto532) y se detectó ya que se une a una molécula de ADN (atrapado entre dos pinzas ópticas) que contiene secuencias específicas LacI de unión (es decir, operadores). Se demuestra la eficacia del método en la detección de la unión de LacI al ADN y la difusión a lo largo de su contorno en el proceso de búsqueda de destino. El método es aplicable a cualquier combinación de secuencia de ADN y proteína de unión a ADN, así como a otros sistemas (microtúbulos o filamentos de actina y las proteínas motoras que interactúan con ellos).

<table><tbody><tr><td>Aisladores elastoméricos</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Elija el elastómero Newdamp adecuado en función del peso del microscopio y de las frecuencias de resonancia</td></tr><tr><td>Aislador óptico</td><td>Óptica para la investigación</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Láser Nd:YAG, longitud de onda de 1.064 nm</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Deflectores acústico-ópticos (AOD)</td><td>A& A optoelectrónica</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Sintetizadores digitales directos</td><td>Analog Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector de cuadrante fotodiodos</td><td>OSI optoelectrónica</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>Placa DIO y FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td> Lámpara halógena <td></td></tr><tr><td></td><td>Schott</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Condensador</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Objetivo Acromático</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA inmersión en agua 532</td><td></td></tr><tr><td>nm láser</td><td>Zafiro</td><td></td><td>coherente</td></tr><tr><td>CCD 200X y 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>CCD multiplicado por electrones</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Platina piezoeléctrica con precisión nm</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de sílice (1,54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de pentilo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Líquidos y vapores inflamables (No 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitrocelulosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Sólido inflamable&nbsp; (No 1272/2008)</td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>con 2 bloques extraíbles; precalentado a 120 °C; C</td></tr><tr><td>NanoPort ensambla</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polieteretercetona&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Soporte metálico casero para el montaje del depósito de presión de la cámara de flujo de plexiglás</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de punta de bloqueo Luer 2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas de cierre&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Herrajes sin bridas&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Tubería de etileno propileno fluorado&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Dos electroválvulas controladas por ordenador</td><td>Clippard, Cincinnati, EE.UU</td>. <td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de presión</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida (DMF)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Líquido Combustible, Nocivo por la absorción cutánea. Irritante, teratógeno. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; Pág. 261; Pág. 280; P305; Pág. 351; Pág. 338; P311</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatión reducido (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Toxicidad aguda, Oral (Categoría 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLQK Membrana Ultracel-PL, 10&nbsp; Concentradores de espín de corte kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de poliestireno recubiertas de estreptavidina 1,87 y micro; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-adn

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

El artículo describe la combinación de pinzas ópticas y detección de fluorescencia de una sola molécula para el estudio de la interacción proteína-ADN. El método ofrece la oportunidad de investigar las interacciones que ocurren en solución (evitando así problemas debidos a superficies cercanas como en otros métodos de una sola molécula), controlando la extensión del ADN y rastreando la dinámica de interacción en función de los parámetros mecánicos y la secuencia de ADN. Se ilustran los métodos para establecer con éxito el atrapamiento óptico y la localización nanométrica de moléculas individuales. Ilustramos las condiciones experimentales que permiten el estudio de la interacción del represor de lactosa (lacI), marcado con Atto532, con una molécula de ADN que contiene secuencias diana específicas (operadores) para la unión de LacI. El método permite la observación de interacciones específicas en los operadores, así como la difusión unidimensional de la proteína durante el proceso de búsqueda de objetivos. El método es ampliamente aplicable al estudio de las interacciones proteína-ADN, pero también a los motores moleculares, donde es deseable el control de la tensión aplicada al polímero de la pista asociada (por ejemplo, actina o microtúbulos).

En un experimento exitoso, uno (o más) proteínas marcadas se someten a la unión / unbinding difusión y / o monodimensional a lo largo de la molécula de ADN (Figura 3A). La localización de proteínas a lo largo de la molécula de ADN permite la cuantificación de los parámetros cinéticos como una función de la secuencia de ADN. Cuando se aplican condiciones de tampón que causan difusión 1D, es posible seguir trayectorias de proteína, y determinar, por ejemplo, el coeficiente de difusión D 1D. </p...

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

El objetivo general de este procedimiento es observar la interacción dinámica entre una única proteína de unión al ADN y una molécula de ADN. Esto se logra combinando, en un microscopio construido a medida, dos técnicas de molécula individual: pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Esta configuración también está equipada con iluminación de campo claro para la visualización y estabilización del muestra a nivel nanométrico.Como segundo paso, se construye una celda de flujo multicanal integrada en un sistema de flujo microscópico para permitir hasta cuatro flujos laminares que recluten y ensamblen eficientemente todos los componentes necesarios para el experimento. A continuación, se ensambla el constructo de molécula individual con el fin de realizar los experimentos. Primero, dos microesferas recubiertas con titina en tira son capturadas con pinzas ópticas duales en el primer canal.A continuación, los dos microesferas atrapadas se desplazan al segundo canal para permitir la unión de la plantilla de ADN marcada con biotina en ambas extremidades. La presencia de una única molécula de ADN se verifica en el tercer canal mediante un análisis de extensión por fuerza del AD

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Investigación

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Biology

Biología

A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

Imágenes de una sola molécula para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en cortinas de ADN

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Aquí, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) utilizando un sustrato de ADN λ site-specifically modificado y un etiquetado proteína del punto cuántico.

Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

Utilizando ADN marcado con puntos cuánticos y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, podemos investigar el mecanismo de reacción de las endonucleasas de restricción mientras usamos proteínas no marcadas. Esta técnica de una sola molécula permite la observación masiva y multiplexada de las interacciones individuales proteína-ADN, y los datos se pueden agrupar para generar distribuciones de tiempo de permanencia bien pobladas.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .

Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Informamos de un ensayo híbrido de conjunto y de una sola molécula para obtener imágenes directas y cuantificar el movimiento de la helicasa Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) totalmente reconstituida y marcada con fluorescencia en moléculas de ADN lineales mantenidas en su lugar en una trampa óptica.

Ensayo híbrido de conjunto y molécula única para obtener imágenes del movimiento de la CMG totalmente reconstituida

Este protocolo describe el procedimiento para realizar la microscopía de localización profunda de molécula única (SMLM) de célula entera utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con reasignación óptica de fotones, permitiendo así la obtención de imágenes DNA-PAINT sin necesidad de óptica personalizada ni iluminación compleja.

Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones

Aprende a estudiar interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única combinando pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Este método permite observar la dinámica de unión con precisión nanométrica.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

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