Name: Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprende a estudiar interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única combinando pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Este método permite observar la dinámica de unión con precisión nanométrica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Gijs wuite, Erwin JG Peterman, y Peter Gross para obtener ayuda con la microfluídica y Alessia Tempestini para obtener ayuda con la preparación de muestras. Esta investigación fue financiada por la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (7PM / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 284464 y del Ministerio de Educación, Universidad e Investigación FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro italiano Ricerca 2013 RBFR13V4M2, y en el marco de la NANOMAX proyecto emblemático.

<ol><li>Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Methods+to+Study+Protein-DNA+Interactions+in+Vitro+and+in+Living+Cells+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level.</a> International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).</li>
<li>Tinoco, I., Gonzalez, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+mechanisms%2C+one+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biological mechanisms, one molecule at a time.</a> Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+molecular+motors+and+switches+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Micr.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level.</a> Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bead+movement+by+single+kinesin+molecules+studied+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers.</a> Nature. 348, 348-352 (1990).</li>
<li>Wang, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+velocity+measured+for+single+molecules+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase.</a> Science. 282, 902-907 (1998).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300, 2061-2065 (2003).</li>
<li>Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+of+single+quantum+dot+labeled+EcoRV+sliding+along+DNA+manipulated+by+double+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers.</a> Biophys J. 96, 50-52 (2009).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+chemistry+chemical+physics+%3A+PCCP%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+RNA+polymerase-DNA+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time.</a> Biophys J. 76, 709-715 (1999).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+RAD51+proteins+disassembling+from+nucleoprotein+filaments+under+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension.</a> Nature. 457, 745-748 (2009).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiona+in+the+trap%3A+the+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+A%3A+Pure+Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).</li>
<li>Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping+and+single-molecule+fluorescence+spectroscopy%3A+enhanced+photobleaching+of+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores.</a> J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).</li>
<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor%2C+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En la última década, las técnicas de manipulación y de imágenes de moléculas individuales se han visto grandes avances en términos de resolución espacial y temporal. La combinación de técnicas de manipulación y de imagen está en la base de instrumentos de gran alcance que ahora permiten el control de las condiciones mecánicas de un solo polímero biológico, tales como ADN, ARN o filamentos del citoesqueleto, y la localización simultánea de proteínas individuales interactuar con el mismo polímero . El control de las condi...

Molécula individual (SM) técnicas han evolucionado mucho en los últimos treinta años para responder a la necesidad de superar algunas de las limitaciones de las mediciones de soluciones tradicionales, a granel 1.3. La manipulación de las moléculas biológicas individuales ha creado la oportunidad para medir las propiedades mecánicas de los biopolímeros 4 y controlar los parámetros mecánicos de proteína-proteína 5 y proteína-DNA 6,7. Detección de fluorescencia SM, por otro lado, representa una herramienta muy versátil para el estudio de actividad de la proteína in vitro e in vivo, dando lugar a la posibilidad de localizar y rastrear moléculas individuales con precisión nanométrica. A través del punto de ajuste de amplio función del instrumento a la imagen SM, de hecho, se puede lograr la localización con una precisión dependiendo principalmente de la relación señal a ruido (SNR) y alcanzando un límite de alrededor de un nanómetro 8,9. Estas metodologías se encuentran potenteaplicaciones en el estudio de la dinámica de las proteínas motoras, así como de los procesos de difusión subyacentes búsqueda de objetivos en las proteínas de unión al ADN. La capacidad de determinar constantes de difusión como una función de la secuencia de ADN, tiempo de residencia en el objetivo y con precisión la medición de la longitud del ADN explorado durante los eventos de difusión unidimensionales, representa una poderosa herramienta para el estudio de la dinámica de interacción de proteínas de ADN y para la investigación de los mecanismos de búsqueda de objetivo específico. Recientemente, la combinación de estas dos técnicas se ha producido una nueva generación de montajes experimentales 10-14 que permitan la manipulación simultánea de un sustrato biológico (por ejemplo, un filamento de actina o una molécula de ADN) y la detección / localización de una enzima interacción socio (por ejemplo, miosina o una proteína de unión al ADN). Las ventajas de estas técnicas se basan principalmente en la posibilidad de ejercer el control mecánico sobre el polímero atrapado, por lo tanto enabling el estudio de la dinámica de interacción frente a fuerzas o pares. Además, la metodología permite la medición de las reacciones bioquímicas lejos de la superficie, evitando una de las principales limitaciones de los métodos clásicos SM, es decir, la necesidad de inmovilización de las moléculas en estudio sobre una superficie (portaobjetos de vidrio o microesferas). La combinación de dos técnicas de moléculas individuales es necesario superar varias dificultades técnicas, fundamentalmente como consecuencia de las exigencias de estabilidad mecánica y SNR adecuado (sobre todo cuando se requiere la localización con precisión nm) 15. En particular, si se acoplan detección por fluorescencia SM con pinzas ópticas, la reducción de ruido y photobleaching de los láseres infrarrojos captura 16 y el control de los buffers bioquímicos para el ensamblaje de los complejos biológicos y el rendimiento de las mediciones experimentales 11 son de suma importancia. A continuación, describimos los métodos para realizar con éxitomediciones en una configuración de localización de captura / SM fluorescencia dual. La metodología se ilustra con el ejemplo de la proteína represora lactosa (LacI) marcado con fluorescencia (con Atto532) y se detectó ya que se une a una molécula de ADN (atrapado entre dos pinzas ópticas) que contiene secuencias específicas LacI de unión (es decir, operadores). Se demuestra la eficacia del método en la detección de la unión de LacI al ADN y la difusión a lo largo de su contorno en el proceso de búsqueda de destino. El método es aplicable a cualquier combinación de secuencia de ADN y proteína de unión a ADN, así como a otros sistemas (microtúbulos o filamentos de actina y las proteínas motoras que interactúan con ellos).

<table><tbody><tr><td>Aisladores elastoméricos</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Elija el elastómero Newdamp adecuado en función del peso del microscopio y de las frecuencias de resonancia</td></tr><tr><td>Aislador óptico</td><td>Óptica para la investigación</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Láser Nd:YAG, longitud de onda de 1.064 nm</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Deflectores acústico-ópticos (AOD)</td><td>A& A optoelectrónica</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Sintetizadores digitales directos</td><td>Analog Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector de cuadrante fotodiodos</td><td>OSI optoelectrónica</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>Placa DIO y FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td> Lámpara halógena <td></td></tr><tr><td></td><td>Schott</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Condensador</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Objetivo Acromático</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA inmersión en agua 532</td><td></td></tr><tr><td>nm láser</td><td>Zafiro</td><td></td><td>coherente</td></tr><tr><td>CCD 200X y 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>CCD multiplicado por electrones</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Platina piezoeléctrica con precisión nm</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de sílice (1,54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de pentilo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Líquidos y vapores inflamables (No 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitrocelulosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Sólido inflamable&nbsp; (No 1272/2008)</td></tr><tr><td>Bloque de calor</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>con 2 bloques extraíbles; precalentado a 120 °C; C</td></tr><tr><td>NanoPort ensambla</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polieteretercetona&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Soporte metálico casero para el montaje del depósito de presión de la cámara de flujo de plexiglás</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de punta de bloqueo Luer 2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas de cierre&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Herrajes sin bridas&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>Tubería de etileno propileno fluorado&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Dos electroválvulas controladas por ordenador</td><td>Clippard, Cincinnati, EE.UU</td>. <td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Transductor de presión</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida (DMF)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Líquido Combustible, Nocivo por la absorción cutánea. Irritante, teratógeno. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; Pág. 261; Pág. 280; P305; Pág. 351; Pág. 338; P311</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatión reducido (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Toxicidad aguda, Oral (Categoría 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLQK Membrana Ultracel-PL, 10&nbsp; Concentradores de espín de corte kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de poliestireno recubiertas de estreptavidina 1,87 y micro; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-adn

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

El artículo describe la combinación de pinzas ópticas y detección de fluorescencia de una sola molécula para el estudio de la interacción proteína-ADN. El método ofrece la oportunidad de investigar las interacciones que ocurren en solución (evitando así problemas debidos a superficies cercanas como en otros métodos de una sola molécula), controlando la extensión del ADN y rastreando la dinámica de interacción en función de los parámetros mecánicos y la secuencia de ADN. Se ilustran los métodos para establecer con éxito el atrapamiento óptico y la localización nanométrica de moléculas individuales. Ilustramos las condiciones experimentales que permiten el estudio de la interacción del represor de lactosa (lacI), marcado con Atto532, con una molécula de ADN que contiene secuencias diana específicas (operadores) para la unión de LacI. El método permite la observación de interacciones específicas en los operadores, así como la difusión unidimensional de la proteína durante el proceso de búsqueda de objetivos. El método es ampliamente aplicable al estudio de las interacciones proteína-ADN, pero también a los motores moleculares, donde es deseable el control de la tensión aplicada al polímero de la pista asociada (por ejemplo, actina o microtúbulos).

En un experimento exitoso, uno (o más) proteínas marcadas se someten a la unión / unbinding difusión y / o monodimensional a lo largo de la molécula de ADN (Figura 3A). La localización de proteínas a lo largo de la molécula de ADN permite la cuantificación de los parámetros cinéticos como una función de la secuencia de ADN. Cuando se aplican condiciones de tampón que causan difusión 1D, es posible seguir trayectorias de proteína, y determinar, por ejemplo, el coeficiente de difusión D 1D. </p...

Aquí se describe la instrumentación y métodos para la detección de moléculas de proteína única etiquetados con fluorescencia que interaccionan con una sola molécula de ADN suspendido entre dos microesferas ópticamente atrapados.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

El objetivo general de este procedimiento es observar la interacción dinámica entre una única proteína de unión al ADN y una molécula de ADN. Esto se logra combinando, en un microscopio construido a medida, dos técnicas de molécula individual: pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Esta configuración también está equipada con iluminación de campo claro para la visualización y estabilización del muestra a nivel nanométrico.Como segundo paso, se construye una celda de flujo multicanal integrada en un sistema de flujo microscópico para permitir hasta cuatro flujos laminares que recluten y ensamblen eficientemente todos los componentes necesarios para el experimento. A continuación, se ensambla el constructo de molécula individual con el fin de realizar los experimentos. Primero, dos microesferas recubiertas con titina en tira son capturadas con pinzas ópticas duales en el primer canal.A continuación, los dos microesferas atrapadas se desplazan al segundo canal para permitir la unión de la plantilla de ADN marcada con biotina en ambas extremidades. La presencia de una única molécula de ADN se verifica en el tercer canal mediante un análisis de extensión por fuerza del ADN. Por último, el montaje de microesfera-ADN-microesfera, denominado mancuerna de ADN, se mueve al canal de proteína donde se encuentra la proteína represora de lactosa marcada con fluorescencia.Se obtienen resultados que muestran la difusión y la unión específica de moléculas individuales de LAC eye sobre una única molécula de ADN estirada y la cuantificación de los parámetros cinéticos del movimiento de LAC eye. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes de molécula individual son la posibilidad de controlar la tensión aplicada a la molécula de ADN, la posibilidad de rastrear con precisión los movimientos de las proteínas ligadas sobre un punto estable a escala nanométrica, así como la capacidad de operar lejos de la superficie del cubreobjetos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones proteína-ADN, especialmente sobre la mecánica de la regulación de la expresión génica, así como sobre la dinámica de la difusión proteica a lo largo del ADN en los mecanismos de búsqueda de dianas.Esta demostración de este método es muy útil para mostrar los aspectos prácticos de la construcción de la celda de flujo, el manejo de muestras y el ensamblaje del constructo de perlas de ADN batiente. Este video demostrará primero cómo verificar la estabilidad direccional de los dos láseres de atrapamiento utilizando microperlas adheridas a la superficie de un cubreobjetos como referencia. Los detalles sobre el diseño y la construcción del sistema de pinzas ópticas se pueden encontrar en el texto del protocolo adjunto.Utilice un cubreobjetos de 24 por 60 milímetros para extender dos microlitros de perlas de sílice sobre la superficie de un cubreobjetos de 24 por 32 milímetros. Usando dos trozos de cinta adhesiva doble cara, fije el cubreobjetos de 24 por 32 milímetros sobre una portaobjetos para crear una celda de flujo.Llene la celda de flujo con 50 milimolares de tampón fosfato y séllela con grasa de silicona imagen. Un microesfera de sílice en microscopía de campo brillante a aproximadamente 2000 aumentos. El campo de visión debe ser de aproximadamente siete por cinco micrómetros adquirido a 768 por 576 píxeles, de modo que la imagen de la microesfera tenga un diámetro de aproximadamente 190 píxeles. Compense las derivas térmicas con un software de retroalimentación que calcule la posición XY a partir del centro de la imagen y la posición Z a partir de los anillos de difracción, y corrija las derivas.Mueva un escenario piezo con precisión de nanómetros o mejor superponga el centro de la trampa izquierda con el centro del perla y mida el ruido de posición y su desviación estándar desde el fotodiodo del detector de cuadrantes o QDP. Repita la medición para la trampa derecha. La desviación estándar del ruido de posición debe estar dentro de unos pocos nanómetros para permitir la localización precisa de proteínas de unión al ADN al fabricar la celda de flujo.Primero se utiliza una punta de diamante para perforar orificios de un milímetro de diámetro en una microplaca de 76 por 76 por un milímetro. Esto crea cuatro entradas y una salida. Esto permitirá hasta cuatro flujos paralelos de tampón.Cada uno contiene uno de los diferentes componentes necesarios para el experimento: perlas, ADN, proteína marcada con fluorescencia y tampón de imagen. Limpie la lámina del microscopio con etanol y centre el puerto con la junta tórica insertada y el anillo adhesivo en la lámina alrededor de los orificios de acceso. Es esencial usar guantes durante este paso para evitar huellas dactilares, que podrían interferir con el proceso de pegado.Con la ayuda de una segunda portaobjetos, sujete los nano puertos al portaobjetos y colóquelo en un horno precalentado a 180 grados Celsius durante una hora para permitir la fijación completa. Mientras tanto, dibuje el patrón del contorno de la celda de flujo sobre un papel. El canal debe tener aproximadamente tres milímetros de ancho y coincidir con las posiciones del portaobjetos en el microscopio.Coloque el dibujo encima de dos piezas de perfil y, con un escalpelo, realice cortes precisos y continuos siguiendo el contorno trazado. Retire cualquier protuberancia formada, deseche la capa inferior de parfum, que solo se utiliza para garantizar un soporte limpio. A continuación, coloque la portaobjetos que contiene los nano puertos adheridos boca abajo en el soporte metálico.Alinee cuidadosamente el contorno de la cámara de parafina con los orificios, asegurándose de que la parafina no sobresalga de las entradas y salida de la tapa de la cámara. Cubra con una laminilla de microscopio limpia y retire cuidadosamente el exceso de parafina alrededor de la cámara. Coloque dos bloques térmicos previamente calentados a 120 grados Celsius encima de la celda de flujo para aplicar una presión homogénea sobre ella. Deje que la película de parafina se derrita durante aproximadamente 25 minutos.El siguiente paso consiste en preparar el depósito de presión y los recipientes de tampón. El depósito de presión está hecho de plexiglás y permite alojar hasta seis recipientes de tampón. En primer lugar, conecte las válvulas de cierre a la salida de los recipientes de tampón para activar el flujo de tampón con la palanca de la válvula en posición vertical o desactivarlo en la posición girada en sentido horario.Durante los experimentos, monte la celda de flujo sobre la platina del microscopio. Luego conecte las válvulas de cierre a través del tubo de poli éter, éter cetona, o tubo peak, y las conexiones sin brida a las entradas de la cámara de flujo. El tubo peak tiene un diámetro interno de aproximadamente 150 micrómetros kilómetros; aproximadamente tres centímetros de tubo de politetrafluoroetileno con un diámetro interno de aproximadamente 500 micrómetros se utilizan como conexión entre el tubo peak y los ensamblajes de nanoconectores de la celda de flujo.Esto es esencial para reducir el flujo del tampón en la entrada de la cámara y evitar la rotura de la celda de flujo o la desconexión del puerto nano del vidrio. Por otro lado, el uso de tubos con un diámetro interno grande requeriría grandes volúmenes de muestras biológicas. Conecte la salida de la cámara de flujo a un tubo Falcon abierto a presión atmosférica.Este tubo sirve para desechar el tampón que fluye fuera de la cámara de flujo. Para comenzar este procedimiento, agregue un mililitro de tampón A a cada uno de los recipientes de tampón y aplique 200 milibares de presión para lavar los tubos de conexión y la celda de flujo. Un sistema de control de presión es capaz de hacerlo.Finalmente, ajuste la presión del aire dentro del depósito de presión. Verifique la presencia de burbujas de aire, que podrían interrumpir la fluidez del flujo. Un ligero golpe en el tubo de salida ayudará a eliminar cualquier burbuja residual, reduzca la presión a 20 milibares y verifique que todos los canales y tubos estén libres de burbujas de aire y que el tampón fluya con velocidades similares en todos los canales.Prepare las muestras hasta un volumen final de 300 microlitros. Este experimento utiliza perlas de poliestireno recubiertas con strept, ADN lineal biotinilado en ambos extremos que contiene secuencias diana específicas para la unión del represor de lactosa y proteína represora de lactosa marcada con fluorescencia. Añada cada muestra a uno de los contenedores de jeringa en el siguiente orden: perlas en el primer canal, ADN en el segundo, tampón de imagen en el tercero y proteína marcada en el cuarto canal.Active el flujo a 20 milibares y abra las válvulas de cierre para permitir que las muestras lleguen al canal de flujo. Esto se detecta fácilmente en el canal de microesferas. Mientras se obtiene la imagen del primer canal bajo iluminación de campo claro, encienda las dos pinzas ópticas y capture una microesfera de poliestireno en cada trampa.Mueva rápidamente al segundo canal para evitar que las otras perlas caigan en las trampas. Observe que la llegada al canal de ADN es fácilmente notable por el final del flujo de perlas. Utilizando un desviador óptico AO o un movimiento OD, mueva una perla atrapada de un lado a otro en la proximidad de la otra perla para permitir la unión del ADN extendido por flujo entre las dos perlas atrapadas ópticamente.Cuando se forma un dumbbell de ADN, la perla estática comienza a seguir el movimiento de la perla que se mueve activamente de un lado a otro mediante la trampa. Muévase rápidamente al canal de tampón y detenga el flujo de tampón. Realice un análisis de la curva de fuerza-extensión para verificar la presencia de una sola molécula de ADN.Esto se logra separando los dos perlas mientras se mide la tensión del ADN. Una vez obtenido un solo dumbbell de ADN, active nuevamente el flujo y mueva el dumbbell al canal de proteína. Cambie a microscopía de fluorescencia de campo amplio para monitorear la interacción de la proteína represora de lactosa marcada con el ADN, detenga el flujo e inicie la adquisición.Este método permite la detección de una sola molécula de represor de lactosa o de lac eye interactuando con una molécula de ADN estirada. En este diagrama CH representativo, una sola molécula de lac eye se difunde a lo largo de secuencias de ADN no específicas, mientras que otra molécula de lac eye está unida específicamente a un operador situado en el centro de la molécula de ADN. Este gráfico muestra la posición de las dos moléculas de lac eye a lo largo de la dirección que conecta los centros de las dos trampas.En función del tiempo, las posiciones de las moléculas fueron determinadas mediante el algoritmo del centro de simetría radial. Aquí se muestra un gráfico del desplazamiento cuadrático medio o MSD frente al tiempo para una única molécula lac eye que difunde a lo largo de una molécula de ADN estirada. El coeficiente de difusión de la proteína puede obtenerse fácilmente mediante regresión lineal de los datos. La combinación de técnicas de manipulación y de imagen constituye un método potente, que permite el control mecánico de un solo polímero biológico, como ADN, ARN o un filamento del citoesqueleto, y la localización simultánea de moléculas individuales de proteína que interactúan con el polímero mismo.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que combinar técnicas de manipulación e imagen a nivel de molécula individual requiere un diseño cuidadoso del montaje experimental para garantizar la estabilidad a nivel nanométrico del polímero suspendido. Por otro lado, se necesita un diseño adecuado de la sonda biológica para asegurar una separación espacial entre el láser de trampa G y la sonda fluorescente. Consulte el texto del protocolo adjunto para obtener más detalles.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar la molécula de ADN entre los dos latidos ópticos rápidos del ensamblaje de este constructo. Se obtiene mejor con la celda de flujo multicanal para la cual proporcionamos la descripción detallada. También indicamos cómo optimizar el flujo del tampón y eliminar las burbujas de aire, las cuales de lo contrario podrían comprometer sus experimentos.En el protocolo de texto combinado, puede encontrar los protocolos para marcar el ADN con bioTE, lo cual es necesario para el ensamblaje con las perlas recubiertas de estreptavidina, así como los protocolos para marcar la proteína. Finalmente, ilustramos las operaciones paso a paso para cuantificar la unión y la difusión de una única proteína represora de lactosa sobre una molécula de ADN extendida.

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A modo de aprovechar microscopio de fuerza atómica (AFM) el método para la visualización de ADN plásmido, proteínas citoplasmáticas, y los complejos ADN-proteína se describe. El método incluye los enfoques alternativos para la preparación de muestras para el AFM imágenes después de la manipulación bioquímica. ADN que contiene regiones específicas que interactúan las proteínas se observan en las condiciones de amortiguación casi fisiológico.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Este video describe un método para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en moléculas de ADN en loci específicos utilizando imágenes de una sola molécula. Estos condensados se forman debido a las interacciones LCD-LCD y LCD-DBD, que permiten el reclutamiento de ARN polimerasa II y una mejor transcripción de genes.

Imágenes de una sola molécula para visualizar el ensamblaje de condensados de proteínas de fusión en cortinas de ADN

Microscopía de localización fotoactivado (PALM) combinada con el seguimiento de una sola molécula permite la observación directa y la cuantificación de la proteína-DNA en células de E. coli vivas de Escherichia.

Visualización de la proteína-DNA en células bacterianas en directo mediante fotoactivado Tracking Single-molécula

Aquí, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) utilizando un sustrato de ADN λ site-specifically modificado y un etiquetado proteína del punto cuántico.

Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

Utilizando ADN marcado con puntos cuánticos y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, podemos investigar el mecanismo de reacción de las endonucleasas de restricción mientras usamos proteínas no marcadas. Esta técnica de una sola molécula permite la observación masiva y multiplexada de las interacciones individuales proteína-ADN, y los datos se pueden agrupar para generar distribuciones de tiempo de permanencia bien pobladas.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

Aquí, describimos el uso del método de imagen de molécula única, cortinas de ADN, para estudiar el mecanismo biofísico de los condensados EWS-FLI1 que se ensamblan en el ADN.

Imágenes de una sola molécula de condensados EWS-FLI1 ensamblados en ADN

La cortina de ADN, una técnica de adquisición de imágenes de molécula única de alto rendimiento, proporciona una plataforma para la visualización en tiempo real de diversas interacciones proteína-ADN. El presente protocolo utiliza la técnica de cortina de ADN para investigar el papel biológico y el mecanismo molecular de Abo1, una ATPasa AAA+ que contiene bromodominio de Schizosaccharomyces pombe .

Descifrando el mecanismo molecular del ensamblaje de histonas mediante la técnica de cortina de ADN

La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.

Uso de pinzas ópticas duales y microfluídica para estudios de moléculas individuales

Se ha demostrado que muchas proteínas intrínsecamente desordenadas participan en la formación de condensados biomoleculares altamente dinámicos, un comportamiento importante para numerosos procesos celulares. Aquí, presentamos un método basado en imágenes de una sola molécula para cuantificar la dinámica por la cual las proteínas interactúan entre sí en condensados biomoleculares en células vivas.

Medición de una sola molécula de la dinámica de interacción de proteínas dentro de condensados biomoleculares

Informamos de un ensayo híbrido de conjunto y de una sola molécula para obtener imágenes directas y cuantificar el movimiento de la helicasa Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) totalmente reconstituida y marcada con fluorescencia en moléculas de ADN lineales mantenidas en su lugar en una trampa óptica.

Ensayo híbrido de conjunto y molécula única para obtener imágenes del movimiento de la CMG totalmente reconstituida

Este protocolo describe el procedimiento para realizar la microscopía de localización profunda de molécula única (SMLM) de célula entera utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con reasignación óptica de fotones, permitiendo así la obtención de imágenes DNA-PAINT sin necesidad de óptica personalizada ni iluminación compleja.

Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones

Aprende a estudiar interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única combinando pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Este método permite observar la dinámica de unión con precisión nanométrica.

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

Explorar más videos