Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

El objetivo general de este procedimiento es observar la interacción dinámica entre una sola proteína de unión al ADN y una molécula de ADN. Esto se logra combinando en un microscopio hecho a medida, dos técnicas de molécula única, pinzas ópticas dobles y microscopía de fluorescencia. Esta configuración también está equipada con iluminación de campo claro para la visualización y estabilización nanométrica de la muestra.

Como segundo paso, se construye una celda de flujo multicanal integrada en un sistema de microflujo para permitir hasta cuatro flujos laminares para reclutar y ensamblar de manera eficiente todos los componentes necesarios para el experimento. A continuación, se ensambla la construcción de una sola molécula para realizar los experimentos. Las dos primeras tiras de microesferas recubiertas de titina se atrapan con las pinzas ópticas dobles en el primer canal.

A continuación, las dos perlas atrapadas se mueven al segundo canal para permitir la fijación de la plantilla de ADN marcada con biotina en ambos extremos. La presencia de una sola molécula de ADN se verifica en el tercer canal mediante un análisis de extensión de fuerza de ADN. Por último, la construcción de la perla de ADN llamada mancuerna de ADN se mueve al canal de proteínas donde está presente la proteína represora de lactosa marcada con fluorescencia.

Se obtienen resultados que muestran la difusión y unión específica de moléculas oculares individuales de LAC en una sola molécula de ADN estirada y la cuantificación de los parámetros cinéticos del movimiento ocular de LAC. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes de una sola molécula son la posibilidad de controlar la tensión aplicada a la nueva molécula, la posibilidad de rastrear con precisión los movimientos de las proteínas de unión en un punto estable de nanómetros, así como la capacidad de operar lejos de la superficie de reposo de la cubierta. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las interacciones entre proteínas y el ADN, especialmente sobre la mecánica de la regulación de la expresión génica, así como sobre la dinámica de la difusión de proteínas a lo largo del ADN en los mecanismos de búsqueda de objetivos.

Esta demostración de este método es muy útil para mostrar los aspectos prácticos de la construcción de la celda de flujo, el manejo de muestras y el ensamblaje de la construcción de cuentas de ADN batido. En este vídeo se demostrará en primer lugar cómo comprobar la estabilidad de apuntamiento de los dos láseres de captura utilizando microperlas pegadas en una superficie de cubreobjetos como referencia. Los detalles sobre el diseño y la construcción de la configuración de la pinza óptica se pueden encontrar en el texto del protocolo adjunto.

Use un cubreobjetos de 24 por 60 milímetros para esparcir dos microlitros de perlas de sílice en la superficie de un cubreobjetos de 24 por 32 milímetros. Usando dos pedazos de cinta adhesiva de doble cara. Coloque el cubreobjetos de 24 por 32 milímetros en un portaobjetos de microscopio para crear una celda de flujo.

Llene la celda de flujo con 50 milimolares de tampón de fosfato y séllela con grasa de silicona. Una perla de sílice en microscopía de campo claro con un aumento aproximado de 2000 veces. El campo de visión debe ser de aproximadamente siete por cinco micrómetros, adquirido a 7 68 por 5 76 píxeles, de modo que la imagen de la cuenta tenga un diámetro de aproximadamente 190 píxeles, compense las derivas térmicas con un software de retroalimentación que calcule la posición XY desde el centro de la imagen y Z desde los anillos de difracción y corrija las derivas.

Moviendo una etapa de pizo con precisión nanométrica o mejor, superponga el centro de la trampa izquierda con el centro del cordón y mida el ruido de posición y su desviación estándar del fotodiodo detector de cuadrante o QDP. Repita la medición para la trampa derecha. La desviación estándar del ruido de posición debe estar dentro de unos pocos nanómetros para permitir la localización precisa de las proteínas de unión al ADN para formar la celda de flujo.

Una punta de diamante se utiliza por primera vez para perforar agujeros de un milímetro de diámetro en un microscopio de 76 por 76 por un milímetro. Deslice para crear cuatro entradas y una salida. Esto permitirá hasta cuatro flujos de búfer paralelos.

Cada uno contiene uno de los diferentes componentes necesarios para las perlas del experimento, la proteína marcada con fluorescencia de ADN y el tampón de imagen. Limpie el portaobjetos del microscopio con etanol y centre el puerto con la junta tórica insertada y el anillo adhesivo en el portaobjetos que rodea los orificios de acceso. Es esencial usar guantes durante este paso para evitar huellas dactilares, que perturbarían el proceso de pegado.

Con la ayuda de una segunda corredera, sujete los puertos nano a la corredera y colóquela en un horno precalentado a 180 grados centígrados durante una hora para permitir la fijación completa. Mientras tanto, dibuje el patrón de contorno de la celda de flujo en una hoja de papel. El canal debe tener aproximadamente tres milímetros de ancho y coincidir con todas las posiciones en el portaobjetos del microscopio.

Coloque el dibujo encima de dos piezas de perfil y con un bisturí, haga cortes agudos y continuos a lo largo del contorno dibujado. Retire las protuberancias formadas, deseche la capa inferior de perfume, que solo se usa para garantizar un soporte limpio. A continuación, coloque el portaobjetos del microscopio que contiene los nanopuertos adjuntos boca abajo en el soporte metálico.

Alinee cuidadosamente el contorno de la cámara de paraformas con los orificios, asegurándose de que el parámetro no extruya las entradas y salidas de la cubierta de la cámara con un deslizamiento de cubierta de microscopio limpio y elimine con cuidado el exceso de parámetros que rodean la cámara. Coloque dos bloques de calor previamente calentados a 120 grados centígrados en la parte superior de la celda de flujo para aplicar una presión homogénea sobre ella. Deje que la película para se derrita durante aproximadamente 25 minutos.

El siguiente paso es preparar el depósito de presión y los contenedores intermedios. El depósito de presión está hecho de plexiglás y permite alojar hasta seis contenedores intermedios. Primero, conecte las válvulas de cierre en la salida de los contenedores de almacenamiento intermedio para encender el flujo de almacenamiento intermedio con la palanca de la válvula en posición vertical o apagar en la posición girada en el sentido de las agujas del reloj.

Durante los experimentos, monte la celda de flujo en la platina del microscopio. A continuación, conecte las válvulas de cierre a través del éter polivinílico, la cetona del éter o el tubo de pico, y las espinas giratorias sin bridas a las entradas de la cámara de flujo. La tubería de pico tiene un diámetro interior de aproximadamente 150 micrómetros kilómetros, aproximadamente tres centímetros de tubería de etileno propileno fluorado con un diámetro interior de aproximadamente 500 micrómetros se utilizan como enlace entre la tubería de pico y los conjuntos de nano puertos de la celda de flujo.

Esto es esencial para reducir el flujo de tampón en la entrada de la cámara para evitar la rotura de la celda de flujo o el desprendimiento del nanopuerto del vidrio. Por otro lado, el uso de tubos de gran diámetro interior por sí solo requeriría grandes volúmenes de muestras biológicas. Conecte la salida de la cámara de flujo a un tubo Falcon abierto a presión atmosférica.

Este tubo sirve como eliminación para el tampón que fluye fuera de la cámara de flujo. Para comenzar este procedimiento, agregue un mililitro de tampón A a cada uno de los recipientes tampón y aplique 200 milibares de presión para lavar los tubos de conexión y la celda de flujo. Un sistema de control de presión es capaz.

Finalmente, ajustar la presión de aire dentro del depósito de presión. Compruebe la presencia de burbujas de aire, que podrían alterar la suavidad del flujo. Un suave movimiento en el tubo de salida ayudará a eliminar las burbujas restantes, disminuir la presión a 20 milibares y verificar que todos los canales y tubos estén libres de burbujas de aire y que el tampón fluya con velocidades similares en todos los canales.

Prepare las muestras hasta un volumen final de 300 microlitros. Este experimento utiliza perlas de poliestireno recubiertas de estrepto, ADN lineal biotinilado en ambas extremidades que contienen secuencias objetivo específicas para la unión del represor de lactosa y la proteína represora de lactosa marcada con fluorescencia. Agregue cada muestra a uno de los recipientes de la jeringa en el siguiente orden: cuentas en el primer canal, ADN en el segundo, el tampón de imágenes en el tercero y la proteína marcada en el cuarto canal.

Abra el flujo a 20 milibares y abra las válvulas de cierre para permitir que las muestras lleguen al canal de flujo. Esto es fácilmente detectable en el canal del cordón. Mientras toma imágenes del primer canal bajo iluminación de campo claro, encienda las dos pinzas ópticas y atrape una perla de poliestireno en cada trampa.

Muévete rápidamente al segundo canal para evitar que las otras cuentas caigan en las trampas. Tenga en cuenta que la llegada al canal de ADN es fácilmente perceptible al final del flujo de perlas. Usando un deflector óptico AO o un movimiento OD, una cuenta trampa va y viene en la proximidad de la otra cuenta para permitir la unión del ADN extendido del flujo entre las dos cuentas atrapadas ópticamente.

Cuando se forma una mancuerna de ADN, la cuenta estática comienza a seguir el movimiento de la cuenta que se mueve activamente hacia adelante y hacia atrás por la trampa. Muévase rápidamente al canal de búfer y apague el flujo de búfer. Realice un análisis de curva de extensión de fuerza para verificar la presencia de una sola molécula de ADN.

Esto se logra separando las dos cuentas mientras se mide la tensión del ADN. Una vez que se obtiene una sola mancuerna de ADN, vuelva a encender el flujo y mueva la mancuerna al canal de proteínas. Cambie a la microscopía de fluorescencia de campo amplio para monitorear la interacción de la proteína represora de lactosa marcada con el ADN, apague el flujo e inicie la adquisición.

Este método permite la detección de moléculas individuales de lactosa represor o laca ocular que interactúan con una molécula de ADN estirada. En este agram CH representativo, una sola molécula de ojo laca se difunde a lo largo de secuencias de ADN no específicas, mientras que otra molécula de ojo laca está específicamente unida a un operador ubicado en el centro de la molécula de ADN. Este gráfico muestra la posición de las dos moléculas del ojo laca a lo largo de la dirección que conecta los centros de las dos trampas.

En función del tiempo, las posiciones de las moléculas se determinaron mediante el algoritmo del centro de simetría radial. Aquí se muestra un gráfico del desplazamiento cuadrado medio o MSD frente al tiempo para una sola molécula de ojo laca que se difunde a lo largo de una molécula de ADN estirada. El coeficiente de difusión de la proteína se puede obtener fácilmente a partir de la regresión lineal de los datos. La combinación de técnicas de manipulación e imagen es un método poderoso, que permite el control mecánico en un solo polímero biológico como D-N-A-R-N-A o un filamento del citoesqueleto, y la localización simultánea de moléculas de proteínas individuales que interactúan con el polímero en sí.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la combinación de técnicas de manipulación e imagen de una sola molécula requiere un diseño cuidadoso de la configuración experimental para garantizar la estabilidad a nivel nanométrico del polímero en suspensión. Por otro lado, se necesita un diseño adecuado de la sonda biológica para garantizar una separación especial entre el láser G de captura y la sonda fluorescente. Consulte el texto del protocolo adjunto para obtener más detalles.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar la molécula de ADN entre los dos ritmos rápidos ópticos del ensamblaje de esta construcción. Se obtiene mejor con la celda de flujo multicanal para la que proporcionamos la descripción detallada. También indicamos cómo optimizar el flujo del tampón y eliminar las burbujas de aire, que de otro modo podrían comprometer sus experimentos.

En el protocolo de combinación de texto, puede encontrar los protocolos para marcar el ADN con bioTE, que es necesario para el ensamblaje con los latidos recubiertos de estreptavidina, así como los protocolos para marcar la proteína. Por último, ilustramos las operaciones paso a paso para cuantificar la unión y la difusión de una sola proteína represora de lactosa en una molécula de ADN estirada.