Determinación de la actividad locomotora espontánea en
10 de abril de 2014
Drosophila melanogaster, son útiles en el estudio de las manipulaciones genéticas o ambientales que afectan a comportamientos como la actividad locomotora espontánea. Aquí se describe un protocolo que utiliza monitores con rayos infrarrojos y software de análisis de datos para cuantificar la actividad locomotora espontánea.
El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la actividad locomotora espontánea de moscas de la fruta. Esto se logra primero recolectando y envejeciendo moscas experimentales. El segundo paso consiste en configurar monitores de población en un incubador con control de temperatura y descargar el software adecuado.
A continuación, las moscas se transfieren a viales de vidrio y luego se colocan dentro de monitores de población donde se ejecutan los monitores de actividad. El paso final consiste en analizar los datos. En última instancia, los monitores de población se utilizan para mostrar las diferencias en la actividad física espontánea de las moscas.
La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el eje geográfico negativo, es que permite un registro continuo, sencillo, fiable y objetivo de la actividad física espontánea de múltiples poblaciones de moscas. Este método puede ayudarnos a determinar cómo diferentes manipulaciones afectan a las moscas. La actividad física espontánea que demuestra el procedimiento será realizada por Suzanne Kowski, una ayudante de laboratorio de un laboratorio. Para comenzar, prepare el alimento siguiendo los pasos indicados en el protocolo de texto adjunto y déjelo enfriar con mezcla constante sobre una placa calefactora.
Aliquotar cinco mililitros de alimento en cada vial de vidrio estrecho, asegurándose de que la cantidad de alimento esté por debajo del anillo más bajo de la población. Monitorear después de que el alimento se enfríe a temperatura ambiente. Tapar los viales con tapones de esponja y mantenerlos a cuatro grados Celsius durante hasta dos semanas.
Caliente los viales a temperatura ambiente antes de usarlos. A continuación, críe moscas Canton S en viales de plástico con alimento estándar de laboratorio. Mantenga los viales en una cámara controlada de temperatura y humedad a 25 grados Celsius con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
Retire las moscas adultas de los frascos por la mañana. Luego, separe las moscas recién emergidas por sexo sobre una almohadilla de dióxido de carbono dentro de las ocho horas posteriores a la eclosión para asegurar que las hembras estén vírgenes. Prepare 10 frascos de moscas parentales colocando machos y hembras vírgenes de cinco a diez días de edad.
Moscas en un vial estándar con alimento y varios granos de levadura. Mantenga las moscas en un incubador a 25 grados Celsius con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad durante dos días. Transfiera las moscas a un vial de plástico nuevo cada dos días y mantenga los viales con los huevos resultantes en un incubador a 25 grados Celsius.
Luego, deseche las moscas que emergieron durante el primer día y devuelva los viales al incubador para recolectar una población más sincronizada de moscas el segundo día. A continuación, sobre una almohadilla de dióxido de carbono, recolecte rápidamente 25 moscas macho y 25 hembras por vial con una cuchara de metal dentro de las 24 horas. Anote el día de ELO en el vial.
Prepare al menos cinco viales por réplica para los grupos experimentales y de control. Mantenga los viales en cámaras ambientales con control de temperatura a 25 grados Celsius con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad.
Pase las moscas a un nuevo vial de plástico cada dos días durante 10 días. Utilice un embudo para colocar los monitores de población en un incubador con temperatura controlada. A continuación, conecte cada monitor con un cable telefónico de cuatro hilos a la unidad de interfaz de fuente de alimentación o PSIU mediante un divisor de cinco vías.
Luego, conecte el cable telefónico al PSIU. Conecte el PSIU a una toma de corriente de 100 a 240 voltios y enchufe el conector de salida de la fuente de alimentación en uno de los conectores macho del PSIU. A continuación, descargue el software USB utilizado por el PSIU para sintetizar un enlace de datos entre el programa informático y el PSIU y los monitores de actividad.
Inicie el programa. Luego, en preferencias, elija el puerto serial PSIU para Macintosh.
A continuación, seleccione el intervalo de lectura. Después, seleccione los monitores por su número de fabricante único. Elija el rango de monitores que corresponda a los números asignados a los monitores.
Asegúrese de que todos los monitores estén correctamente conectados buscando la luz verde. Una luz roja indica que la conexión se ha perdido. Una caja negra indica que el sistema está apagado o que la conexión USB no se ha realizado adecuadamente.
Separar moscas macho y hembra de la misma edad. En una almohadilla de dióxido de carbono, colocar 10 moscas macho y 10 moscas hembra en tubos de vidrio separados a temperatura ambiente.
Utilice al menos tres viales para cada línea experimental y control, y para cada sexo de moscas, mantenga los viales de lado hasta que las moscas se recuperen del dióxido de carbono para asegurarse de que no queden atrapadas en el alimento. Déjelas durante dos horas a temperatura ambiente para que se recuperen del monóxido de carbono. Luego coloque los viales dentro de la población.
Monitores alojados en las incubadoras. Pase las moscas a nuevos viales después de tres o cuatro días para evitar que se seque el alimento. Al final del experimento, escanee los datos para eliminar lecturas duplicadas y asegurarse de que las grabaciones estén completas.
Usando el escaneo de archivo 110 x, seleccione el intervalo para la recopilación de datos y descarte los datos recopilados dentro de las primeras 24 horas del período de tiempo seleccionado. El programa enviará el recuento total actual de cada monitor a la computadora y comenzará a contar nuevamente desde cero. A continuación, elija un nombre experimental y copie los archivos desde la carpeta de datos de la computadora para guardar los datos.
Comience el análisis de datos copiando cuidadosamente los datos recopilados en los archivos de texto en columnas de hojas de cálculo de Excel. Luego, calcule la actividad total dentro de un período de tiempo deseado para cada monitor, que representa la suma de la actividad recopilada en tres alturas diferentes de haces de infrarrojos. Finalmente, determine la actividad locomotora promedio y la desviación estándar entre los tres monitores, que representan tres réplicas biológicas, utilizando la prueba t de Student de dos colas.
La actividad locomotora espontánea en Drosophila depende del sexo de la mosca y del ciclo luz-oscuridad. Como muestra este gráfico de la actividad promedio de moscas macho y hembra, la flecha marca la transición de luz a oscuridad. Donde se observa una disminución en la actividad, la actividad total de moscas macho de 20 días de edad aumenta cuando se les proporciona la mitad de la cantidad de alimento estándar en una dieta baja en calorías, en comparación con la disminución de la actividad de las moscas en una dieta alta en calorías.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la actividad física espontánea de Drosophila. Este método es útil para determinar cómo diferentes manipulaciones genéticas o ambientales afectan la actividad de las moscas.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para cuantificar la actividad locomotora espontánea en Drosophila melanogaster. Al utilizar monitores de haces de infrarrojos y software de análisis de datos, los investigadores pueden medir eficazmente la actividad física de las moscas de la fruta en condiciones controladas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del comportamiento
- Genética
Antecedentes
- Drosophila melanogaster sirve como organismo modelo para el estudio del comportamiento.
- El entendimiento de la actividad locomotora puede proporcionar información sobre las influencias genéticas y ambientales.
- La tecnología de monitoreo por infrarrojos permite un seguimiento preciso de la actividad.
- El análisis de datos es fundamental para interpretar los patrones locomotores.
Objetivo del estudio
- Cuantificar la actividad locomotora espontánea en moscas de la fruta.
- Evaluar el impacto de factores genéticos y ambientales sobre el comportamiento.
- Proporcionar un protocolo estandarizado para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Recolección y envejecimiento de Drosophila melanogaster experimentales.
- Instalación de monitores de población en un incubador con control de temperatura.
- Transferencia de moscas a viales de vidrio para su monitoreo.
- Uso de monitores de actividad y análisis de los datos recopilados.
Resultados principales
- Los monitores de población cuantifican eficazmente las diferencias en la actividad locomotora.
- El análisis de datos revela información sobre los niveles de actividad física espontánea.
- Los resultados pueden orientar futuros estudios sobre comportamiento y genética.
- El protocolo es reproducible y aplicable a diversas configuraciones experimentales.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque confiable para estudiar la actividad locomotora en moscas de la fruta.
- Comprender estos comportamientos puede mejorar el conocimiento sobre las interacciones genéticas y ambientales.
- El protocolo puede adaptarse a diferentes necesidades de investigación en neurociencia y biología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de la actividad locomotora espontánea en Drosophila melanogaster proporciona una lectura escalable y objetiva para evaluar las influencias genéticas y ambientales sobre el comportamiento, apoyando la validación temprana de objetivos en la investigación de neurociencia y enfermedades metabólicas. Este método permite la reducción de riesgos mecanicistas al vincular los resultados fenotípicos con la modulación de vías, ofreciendo confianza predictiva en los flujos de trabajo de identificación de compuestos prometedores. Su reproductibilidad y capacidad de monitoreo continuo la posicionan como una plataforma de biomarcadores traslacionales para la validación de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición de la actividad física espontánea como lectura funcional de la integridad de las vías neuronales y metabólicas.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación objetiva y continua del comportamiento locomotor en distintas condiciones genéticas y ambientales.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al identificar compuestos o manipulaciones genéticas que alteran significativamente los patrones de actividad, lo que indica la interacción con el objetivo.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para cribados posteriores mediante el establecimiento de perfiles basales de actividad locomotora bajo condiciones controladas.
- Reproducibilidad: Proporciona resultados cuantitativos estandarizados mediante el monitoreo con haces de infrarrojos, lo que permite una evaluación confiable de compuestos entre réplicas.
- Escalabilidad: Permite el monitoreo paralelo de múltiples viales para la evaluación de alto rendimiento de intervenciones farmacológicas o genéticas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela estados patológicos humanos mediante la evaluación de cambios locomotores en manipulaciones genéticas que imitan trastornos neurológicos o metabólicos.
- Continuidad traslacional: Conecta fenotipos conductuales de fase de descubrimiento con la validación preclínica a través de métricas de actividad consistentes y cuantificables.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Orienta los criterios de avance al correlacionar cambios en la actividad con la modulación del objetivo, reduciendo los falsos positivos en la optimización de fármacos líderes.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre el blanco hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, proporcionando un punto final conductual que conecta la comprensión mecanicista con el resultado fenotípico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la validación de dianas mediante la cuantificación del modo en que los cambios genéticos o inducidos por fármacos afectan la actividad locomotora espontánea.
- Selección: Permite la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante el seguimiento continuo y multifactorial de la actividad en poblaciones de moscas.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas de variables dependientes (actividad total, desviación estándar) que permiten la comparación estadística de condiciones experimentales mediante análisis de prueba t.
- Investigación Traducional: Se alinea con el desarrollo de biomarcadores al vincular los cambios en la actividad locomotora con perturbaciones genéticas o metabólicas subyacentes relevantes para modelos de enfermedades humanas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable de cribado conductual aplicable en múltiples proyectos de investigación en neurociencia, metabolismo y envejecimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la medición directa de la actividad física espontánea como un referente fenotípico.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y la reproducibilidad mediante monitoreo infrarrojo calibrado y flujos de trabajo definidos para el análisis de datos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos conductuales tempranos y cuantificables que reducen la pérdida biológica en etapas avanzadas.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo al identificar intervenciones con efectos significativos y reproducibles sobre la actividad locomotora.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, configuración de ensayos conductuales y sistemas de monitoreo por infrarrojos.
- Depende de monitores de población, interfaz PSIU, incubadoras con control de temperatura y software de adquisición de datos.
- Necesita estandarización entre equipos de los protocolos de envejecimiento de moscas, separación por sexo y preparación de viales.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes fondos genéticos, condiciones dietéticas y tratamientos farmacológicos.
- Comprende limitaciones prácticas, como el secado del alimento con el tiempo y la necesidad de traslados periódicos de los viales para mantener la integridad de los datos.
