ScanLag: De Alto Rendimiento La cuantificación del crecimiento de las colonias y Lag Tiempo

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la distribución del retraso de un cultivo bacteriano para permitir la discriminación entre el tiempo de retraso prolongado y el crecimiento lento a nivel de una sola variante. Esto se logra creando primero una configuración de una matriz de escáneres que son identificados por una sola computadora. El segundo paso es colocar una unidad formadora de colonias definida para el cultivo bacteriano en placas de Petri que contienen agar nutriente convencional.

A continuación, los platos se colocan en soportes diseñados en los escáneres y se toman imágenes de lapso de tiempo de las colonias con los escáneres. El paso final es ejecutar el análisis de imágenes utilizando el software de retardo de escaneo, que analiza automáticamente las imágenes y extrae parámetros cuantitativos como el tiempo de aparición de cada colonia y el tiempo de crecimiento de cada colonia. En última instancia, las funciones de MATLAB se utilizan para generar el histograma de retraso utilizando estos datos.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de infecciones persistentes porque permite la detección de variantes lentas. Para empezar, elija un escáner plano con una resolución óptica de 4.800 DPI, una resolución de hardware de 4.800 por 9.600 DPI y una profundidad de bits de color de 48 bits que pueda funcionar a los niveles de temperatura y humedad relevantes. Elija un escáner que permita conectar más de un escáner a la computadora e identificarlo.

Únicamente, las placas de Petri tienen un volumen significativo. A diferencia del papel, que generalmente se usa en escáneres comerciales, las colonias se encuentran encima de la capa de agar a unos cinco milímetros por encima de la superficie del escáner. Para la mayoría de los escáneres, las colonias estarán enfocadas.

Prepare pedazos de tela de fieltro negro estéril para cubrir las placas y mantener las placas de Petri en su lugar. Prepare soportes de placas blancas que se ajusten a los escáneres y que tengan seis orificios que igualen el tamaño de las placas si es necesario para el crecimiento del microorganismo. Coloque los escáneres en un entorno con temperatura controlada.

Conecte los escáneres a la computadora para instalar el administrador de escaneo. Copie todos los archivos de la aplicación del administrador de escaneo en un directorio designado desde el sitio web de retraso de escaneo. Utilice una computadora con un sistema operativo Windows XP y asegúrese de que microsoft.

Se instala la versión 2.0 de NET FRAMEWORK. Estancado. Encuentre los nombres de los escáneres en los dispositivos de imágenes del administrador de dispositivos de administración de equipos. A continuación, configure el archivo de configuración del administrador de escaneo de acuerdo con estos nombres.

Para realizar un experimento, primero, diluya el cultivo a aproximadamente 2000 UFC por mililitro. A continuación, coloque 0,1,1 mililitros de cultivo de manera uniforme en placas de Petri preparadas con agar nutriente convencional. A continuación, cubra el plato con un trozo de tela de fieltro negro estéril para obtener un buen contraste entre las colonias y el plato, y para absorber la humedad.

Coloque la tapa en la placa y coloque las placas en los soportes de los escáneres. Para iniciar el administrador de escaneo. Elija los escáneres participantes de la lista de escáneres conectados.

A continuación, elija el número de imágenes que se van a tomar, el intervalo de tiempo entre las imágenes siguientes y el retardo de tiempo antes de comenzar el experimento para el análisis de imágenes. En primer lugar, clasifique las imágenes de cada escáner en carpetas separadas mediante la ventana de comandos de MATLAB. En primer lugar, prepare las imágenes para realizar el preprocesamiento.

En el preprocesamiento, las imágenes de un escáner se alinean. Cada placa de Petri se recorta de cada secuencia de imágenes. La hora a la que se recopiló cada imagen se recupera de la ejecución de la marca de tiempo.

Lapso de tiempo para que todas las placas realicen la detección y las colonias de seguimiento se detectan en cada placa de Petri y se les asigna un número de identificación. Los tamaños de cada colonia detectada se miden en función del tiempo. Extraiga la distribución de apariencia de las colonias utilizando la ventana de comandos de MATLAB.

Primera aplicación de retraso de escaneo para mostrar el análisis de una determinada placa de Petri junto con el gráfico del tamaño en función del tiempo para las colonias. Luego use el control deslizante para cambiar la hora actual de la placa. El tiempo también se indicará mediante una línea vertical coincidente en el gráfico de área de las colonias.

Haga clic en una colonia para ver su curva asociada y viceversa. Después de identificar la colonia, el fenotipo se puede recuperar seleccionando la colonia de la placa de Petri identificada. Filtre los defectos en el análisis automático eligiendo una colonia y haciendo clic en el botón Excluir.

Al hacer clic en excluir, el número de la colonia se volverá amarillo. Después de revisar los resultados del análisis de cada placa, resuma los resultados. En primer lugar, agregue histogramas para crear un histograma de apariencia.

A continuación, los tiempos ejecutan la curva de muerte gráfica para crear una representación de la curva de supervivencia de la distribución. Aquí se muestra un ejemplo de extracto de distribución de tiempo de retraso. El retraso de escaneo puede identificar y rastrear cada colonia con características específicas en una placa a lo largo del tiempo, como se haría en un ensayo de detección.

Cuando el cultivo del microorganismo es heterogéneo, las diferentes subpoblaciones pueden revelarse durante el ensayo. Esta figura muestra la cuantificación de la apariencia y, por lo tanto, revela la distribución del tiempo de retraso bimodal en una cepa mutante de E. coli. Aquí se muestran histogramas bidimensionales del tiempo de aparición y el tiempo de crecimiento de dos condiciones diferentes.

La comparación de los histogramas de las dos cepas muestra la diferencia en el tiempo de aparición, mientras que los tiempos de crecimiento son similares. Cuando las colonias crecen al mismo ritmo, la aparición tardía se puede atribuir al tiempo de retraso. Se examinó la influencia de las colonias que aparecieron temprano en la aparición de colonias posteriores.

Aquí se muestra la distribución del tiempo de retardo de las células de tipo salvaje, solas en placas, y la distribución del tiempo de retardo de una cepa sensible al frío. Siembra sola después de la transferencia a control de temperatura permisiva, los experimentos confirmaron que la apariencia posterior no se vio afectada, siempre y cuando el número total de colonias por placa no excediera las 200. Siguiendo este procedimiento.

Otros métodos, como la secuenciación del genoma completo o el análisis de la expresión, se pueden realizar en colonias con un fenotipo de crecimiento interesante para responder a preguntas adicionales como si el fenotipo es genético o epigenético.