Name: Imagen confocal de Confinados en reposo y que fluye mezclas de coloide y polímeros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprende a cuantificar el comportamiento de fase y las propiedades de transporte de suspensiones coloidales atractivas confinadas mediante microscopía confocal. Este método utiliza mezclas de coloides y polímeros en celdas de cuña delgadas.

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Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por la Universidad de Houston Nueva Facultad Grant, una donación de semillas del Centro de Texas para Superconductividad, y el Fondo de Investigación del Petróleo American Chemical Society (52537-DNI).

1. Preparación de mezclas de coloide y polímeros Nota: Este protocolo utiliza poli (metacrilato de metilo) (PMMA) partículas, estéricamente estabilizado usando poli (ácido 12-hidroxiesteárico) y marcado con un colorante fluorescente (tales como Rojo Nilo, rodamina B, o fluoresceína), que se sintetizó siguiendo una norma receta 52. <ol><li> Preparar un 3:01 w / w mezcla de bromuro de ciclohexilo (CXB) y decahidronaftaleno (DHN) como una acción disolvente. Esta mezcla casi coincide con la densidad y el índice de refracción de las partículas. Añadir una sal orgánica, cloruro de tetrabutilamonio (TBAC) 46, al disolvente a una concentración de 1,5 mM a la pantalla parcialmente las cargas de las partículas. </li><li> Para determinar con precisión la densidad de las partículas, preparar una suspensión en la fracción de volumen de partículas aproximada Φ = 0,10 en el CXB: disolvente DHN. Se centrifuga la suspensión a 800 g durante 75 min y añadir CXB o DHN gota a gota a mejorar la flotabilidadcoincidente. En estos experimentos, se midió la densidad de las partículas de PMMA a ser ρ = 1,223 g / ml. </li><li> Preparar una suspensión concentrada balance de partículas de PMMA (en este caso, Φ = 0,40) en el CXB: mezcla de disolventes DHN. </li><li> Preparar una solución concentrada de poliestireno lineal (PS) en el CXB: mezcla de disolventes DHN. Aquí, una solución de PS de peso molecular $ $ w ≈ 3.000.000 (radio de giro R G = 15 nm) se prepara a una concentración de C p ≈ 50 mg / ml. </li><li> Mezclar pesos apropiados de la partícula, de polímero, y mezclas de disolventes de archivo para formular suspensiones a las concentraciones deseadas de las partículas y polímeros. Nota: Aquí, las suspensiones de partículas monodispersas se preparan en la fracción de volumen de coloide constante Φ = 0,15 y la concentración de polímero variable en el volumen libre 53 c p = 0-25 mg / ml, y bidispersed suspensiones que contienen dos tamaños de partículas coloidales, With cada tamaño que lleven una etiqueta fluorescente distinta, se preparan en la fracción del volumen total de coloide fija Φ = 0,15, relación volumen fracción de pequeñas partículas r = 0,50, y la concentración de polímero en el volumen libre de 5 o 25 mg / ml. </li><li> Después se prepara cada suspensión, añadir gota a gota CXB o DHN y centrifugar las muestras a 800 xg durante al menos 75 minutos para confirmar que las partículas y grupos dentro de la suspensión permanecen flotabilidad emparejado. </li><li> Equilibrar todas las muestras durante al menos 24 horas antes de los experimentos de formación de imágenes. </li></ol> . 2 Experimentos Ejemplos de reposo: el comportamiento de fase <ol><li> Para determinar el comportamiento de la fase a granel, fabricar cámaras rectangulares de cubreobjetos de vidrio (Figura 1a). Para las mezclas de coloide de polímero en este estudio, las cámaras de espesor h = 1 mm (fijado por el grosor de un portaobjetos de microscopio) dan mayor comportamiento. </li><li> Para tener acceso a múltiples confinamientos en un solo experimento de microscopía, fabricar cuña delgadaen forma de cámaras, utilizando un único cubreobjetos como un espaciador en una cuña (Figura 1b). El ángulo de apertura de la cámara es &lt;0,5 °, de modo que en un solo campo de visión Las paredes son muy casi paralelos. Una cámara de representante permite el acceso a los espesores de confinamiento de h = 6 a&gt; 100 micras. </li><li> Construir cámaras en una base de cubreobjetos para formación de imágenes en un microscopio invertido y sellar con epoxi curable por radiación UV, que no se disuelve en la mezcla disolvente CXB-DHN. </li><li> Muestras de imágenes utilizando un microscopio confocal. Este protocolo demuestra imágenes con un confocal de exploración lineal unido a un microscopio invertido equipado con un lente de inmersión en aceite de 100X de apertura numérica NA = 1,40. </li><li> Excitar los tintes usando una fuente de láser. Aquí longitudes de onda λ = 491 o 561 nm se utilizan para excitar la fluoresceína y colorantes rodamina / Rojo Nilo, respectivamente. </li><li> En el sistema de puntos de exploración, generar una imagen escaneando rápidamente el punto focal a través de la muestra (en el x-Y plano) usando el software confocal. Una imagen de dos dimensiones de 512 píxeles x 512 píxeles, que cubren aproximadamente 50 micras x 50 micras, pueden ser adquiridos en 1/32 seg. Mejorar la calidad de la imagen al promediar varias imágenes o aumentar el tiempo de adquisición. </li><li> Ubicar la parte inferior de la cámara (z = 0), por ejemplo, centrándose en partículas adheridas a su parte inferior. En esta configuración, la altura (z) se incrementa con el aumento de enfoque en la cámara. </li><li> A modo de ejemplo, caracterizar el efecto de confinamiento en la dinámica de las partículas mediante la adquisición de una serie de tiempo de 2-D de imágenes (en el plano xy) en el plano medio de la cámara. En un experimento típico, 500 imágenes de dimensión 512 píxeles x 512 píxeles se adquieren a una velocidad de 1 fotograma / segundo (tiempo espaciado Dt = 1 seg). </li><li> Como un segundo ejemplo, caracterizar la estructura 3-D de las partículas mediante la adquisición de una serie tridimensional de imágenes (x, y, z). En un experimento típico, imágenes en dos dimensiones (512 píxeles x 512 píxeles) sonadquirida en múltiples posiciones z dentro de la cámara, con una separación constante de Delta Z = 0,2 m entre imágenes consecutivas establecidos por un piezoeléctrico. Una pila volumen que cubre un espesor de h = 30 micras contiene por lo tanto 151 imágenes. </li><li> Busque y partículas de pista en el tiempo en 2-D o 3-D utilizando el software de partículas de seguimiento escrito en IDL 23,54-56, MATLAB 57,58, LabView 59, o Python 60. Estos algoritmos permiten típicamente los centros de las partículas que deben resolverse dentro de 40 a 50 nm. Rastreo de partículas exitosa requiere que las partículas se mueven menor que la separación entre partículas entre tramas consecutivas. </li><li> Desde las posiciones de las partículas, calcular métricas estructurales y dinámicas. Tres parámetros convenientes que se muestran aquí son la función de correlación par 3-D g (r) 61, el desplazamiento cuadrático medio 2-D (MSD) 58,62, y el ser parte 2-D de la función de correlación van Hove T s ( x, t) 58. Las dos últimas métricas pueden ser también calculados en 3-D. </li></ol> . 3 experimentos que fluye: propiedades de flujo <ol><li> Fabrique una celda de flujo simple usando un microcapilar de cristal con sección transversal cuadrada (100 m x 100 m) que está fijada a un tubo de teflón. Utilice cubreobjetos de vidrio para soportar el capilar y proporcionar rigidez mecánica, como se muestra en el esquema de la Figura 7. </li><li> Cargar la mezcla coloidal-polímero en una jeringa de vidrio. Conecte la jeringa a una bomba de jeringa o un sistema de distribución de fluido neumático. </li><li> Monte la configuración celda de flujo en el microscopio invertido. Mantener la jeringa, de células, y la salida de flujo a la misma altura para minimizar el efecto de la gravedad sobre el perfil del flujo. </li><li> Control de la velocidad de flujo de la suspensión a través de la celda de flujo por la tasa de flujo volumétrico (para la bomba de jeringa) o la presión aplicada (para la caja de presión). La velocidad media de la suspensión en los microcanales también depende del doformulación spension. Los valores típicos de la velocidad máxima en los microcanales cuadrados medidos aquí son 200-2.000 m / seg. </li><li> Durante el flujo, adquirir una serie de 2-D tiempo confocal a velocidades de cuadro rápidas. Aquí, 500 imágenes de dimensión 512 pixeles x 512 pixeles se adquieren a 32 cuadros / seg (tiempo de espaciamiento Δ t = 1/32 seg) a diferentes alturas por encima de la parte inferior de la microcanal (z = 0 micras) que van desde z = 5 - 50 micras. Cada imagen cubre aproximadamente la mitad de la dimensión lateral (y) del microcanal, tal como se muestra en el recuadro a la Figura 7. Si las partículas aparecen elíptica, aumentar la velocidad de fotogramas de adquisición. </li><li> Al igual que en los experimentos de reposo, localice las partículas en 2-D utilizando algoritmos estándar para la localización y seguimiento de partículas en IDL o Matlab. Para flujos lentos, en el que las partículas se mueven a menos de la distancia media entre partículas entre cuadros, utilizan algoritmos de rastreo para obtener las trayectorias. </li><li> Utilice correlación de imágenes de calcmular los perfiles de velocidad de los flujos rápidos. <ol><li> Subdivide la imagen en imágenes horizontales de altura constante (y) a lo largo de la dirección de flujo (x). Para dos imágenes secuenciales I 1 (x, y) y 2 (x, y) desplazar la última imagen por un factor de Dx y luego calcular la covarianza cruzada entre I 1 (x, y) y 2 (x + Ax, y). </li><li> Identificar la posición del pico del histograma de valores Dx que maximizan la covarianza cruzada entre cada par de imágenes para obtener la velocidad de advección media en cada posición y lateral. Si esta distribución no está fuertemente alcanzó su punto máximo, adquirir imágenes a una velocidad más rápida. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las suspensiones coloidales son ampliamente estudiados como modelos para el comportamiento de fase reducido, ya que las partículas coloidales de tamaño micrométrico exhiben dinámica significativamente más lento que los átomos y las moléculas y por lo tanto se pueden obtener imágenes y seguimiento en el tiempo 10 fácilmente. Para estos estudios fundamentales, la comprensión del efecto de las atracciones entre partículas en el comportamiento de la fase confinada ofrece la oportunidad de explorar fenómenos como ...

En este trabajo se demuestra (a) de imagen confocal de mezclas de coloides poliméricos en reposo y que fluyen confinados en dos y tres dimensiones y (b) de las partículas de seguimiento y análisis de correlación de las imágenes resultantes para obtener información cuantitativa sobre el comportamiento de las fases y las propiedades de flujo. Las suspensiones coloidales con atractivas interacciones entre partículas aparecen por doquier en aplicaciones tecnológicas como materiales para el montaje dirigido 1-3, la administración de fármacos 4, 5-7 mejorada recuperación de hidrocarburos, y el almacenamiento de energía 8. Una característica común de estas aplicaciones es que las partículas deben ser fluyeron a través de geometrías finas, tales como toberas, cabezales de impresión, microcanales, o medios porosos, y / o ser en forma de películas delgadas o varillas. Las técnicas utilizadas para investigar la estructura de los coloides de tamaño micrométrico en geometrías confinadas, incluyendo microscopía electrónica 17,18, la microscopía de rayos X 19, y el láser de difracción microscopy 20, se puede utilizar para medir la estructura y dinámica de las partículas en la microescala. Estas técnicas, sin embargo, no permiten el acceso a las trayectorias de las partículas individuales, de las cuales las métricas estructurales y dinámicos se pueden calcular para una comparación directa con las simulaciones numéricas 21,22. La microscopía confocal es una variante de microscopía de fluorescencia que permite formación de imágenes de secciones delgadas de una muestra fluorescente. Para la ciencia coloidal 10, esta técnica es particularmente útil para obtener imágenes de las profundidades de suspensiones densas o en tres dimensiones. Algoritmos de partículas de seguimiento de 23 aplicado a dos series de tiempo-o tridimensional de micrografías confocales producir las trayectorias de todas las partículas visibles. Como resultado, la combinación de la microscopía confocal y de partículas de seguimiento se ha aplicado para estudiar el comportamiento de fase, la estructura y la dinámica de suspensiones coloidales, incluyendo cristales ordenados 24-27 y trastornoed gafas 28-31 y 32-35 geles. Otros algoritmos de análisis de imagen se pueden aplicar para medir la dinámica de las partículas de la serie de tiempo de micrografías confocales. Por ejemplo, la dinámica de partículas difusoras pueden ser estudiadas mediante el análisis de las fluctuaciones en la intensidad en el tiempo utilizando diferencial microscopía confocal dinámico 36. Cuando los desplazamientos de las partículas son más grandes que el espaciamiento entre partículas, de correlación de imágenes 37 sobre la base de partícula de imagen velocimetría 38-40 se puede aplicar para medir perfiles de velocidad de las partículas. La combinación de algoritmos de seguimiento y de correlación ha permitido la dinámica coloidales que se miden en los sistemas sometidos a lento y rápido flujo 11-16,41-45. Utilizamos mezclas de coloides poliméricos como modelos para suspensiones coloidales atractivos 9. En estas mezclas, el rango y la fuerza del atractivo potencial entre partículas se controlan a través de la relacióndel radio de giro del polímero a la radio de la partícula y la concentración del polímero y la repulsión electrostática se controla mediante la adición de una sal orgánica monovalente 46. Debido a que las interacciones entre partículas se pueden sintonizar cuidadosamente, la solidificación de estas mezclas se ha estudiado ampliamente con microscopía confocal 34,47-51. Aquí se demuestra la imagen confocal y análisis de imágenes de 37 mezclas de coloides poliméricos reposo y fluidas, en el que se celebra la fracción de volumen de coloide fija en Φ = 0,15, que la sonda el efecto de confinamiento en el comportamiento de las fases y propiedades de flujo de estas mezclas. Estas técnicas son ampliamente aplicables a los sistemas de partículas que son índice de refracción-emparejados y en el que las partículas y / o disolvente puede ser marcado con un colorante fluorescente.

<table><tbody><tr><td>Bromuro de ciclohexilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>Número CAS&nbsp; 108-85-0, Peso molecular = 163.06, Utilizado en stock solvente</td></tr><tr><td>Decahidronaftaleno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>Número CAS 91-17-8, Peso molecular = 138.25, Utilizado en stock solvente</td></tr><tr><td>Nilo Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Fluoresceína 5(6)-isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Rodamina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>Colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Dispersión dinámica de la luz&nbsp;</td>Equipo <td>BI-APD</td> DLS de <td>Brookhaven Instruments</td><td>utilizado para la medición del tamaño de partícula</td></tr><tr><td>Poliestireno&nbsp;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>Poliestireno (polímero) para inducir la atracción de agotamiento</td></tr><tr><td>Tetrabutilo (cloruro de amonio) (TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>sal monovalente</td></tr><tr><td>Adhesivo UV</td><td>Norland Adhesivo</td><td>NOA 68T Número de</td><td>pieza 68T01 (adhesivo curado con UV)</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Escáner</td><td>confocal</td>ocular</tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT Microscopio</td><td>de escáner confocal</td>infinito</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Centrífuga de</td><td>microscopio invertido</td>Leica <td>DMI3000B</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5.000 rpm</td></tr><tr><td>Tubo de teflón</td> piezas <td>pequeñas</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite Tubo de pared 26 AWG 0.016" ID x 0.003"</td></tr><tr><td>Epoxi de</td> pared <td>Devcon</td><td>DA051</td><td>5 min</td></tr><tr><td>Jeringa</td> de epoxi <td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>jeringa de vidrio con luer metálico punta de bloqueo</td></tr><tr><td>Puntas de jeringa&nbsp;</td><td>Puntas de precisión Nordson</td><td>7018462</td><td>32 GA&nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa&nbsp;</td><td>Sistema de bombeo New Era Inc.</td><td>NE1002X</td><td>Bomba microfluídica programable (syringepump.com)</td></tr><tr><td>Balanza de pesaje</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0,0001-220 g</td></tr><tr><td>Partículas de PMMA</td><td>Partículas coloidales de poli(metilmetacrilato)</td> <td>sintetizadas</td><td></td></tr></tbody></table>

imagen confocal de confinados en reposo y que fluye mezclas de coloide y polímeros

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

El comportamiento de las suspensiones coloidales confinados con atractivas interacciones entre partículas es crítica para el diseño racional de los materiales para el montaje dirigido 1-3, la administración de fármacos 4, la mejora de la recuperación de hidrocarburos 5-7, y los electrodos capaces de fluir para el almacenamiento de energía 8. Suspensiones que contienen coloides fluorescentes y polímeros no adsorbentes son atractivos sistemas modelo, como la relación entre el radio de giro del polímero a la radio de la partícula y la concentración de polímero de control de la gama y la fuerza de la atracción entre partículas, respectivamente. Al ajustar las propiedades del polímero y la fracción de volumen de los coloides, fluidos coloidales, fluidos de agrupaciones, geles, cristales, y los vidrios se pueden obtener 9. La microscopía confocal, una variante de la microscopía de fluorescencia, permite una muestra ópticamente transparente y fluorescente para ser reflejado con una alta resolución espacial y temporal en tres dimensiones. En esta técnica, un pequeño orificio o hendidura bloquea la luz fluorescente emitida por regiones de la muestra que se encuentran fuera del volumen focal del sistema óptico del microscopio. Como resultado, se forma la imagen sólo una sección delgada de la muestra en el plano focal. Esta técnica es especialmente adecuado para investigar la estructura y la dinámica en densas suspensiones coloidales en la escala de una sola partícula: las partículas son lo suficientemente grandes como para ser resueltos usando la luz visible y difunden lo suficientemente lento como para ser capturado a velocidades típicas de los sistemas de escaneo confocal comerciales 10 . Las mejoras en la velocidad de escaneado y algoritmos de análisis han permitido también a la imagen confocal cuantitativa de suspensiones fluidas 11-16,37. En este trabajo se demuestra experimentos de microscopía confocal para investigar el comportamiento de la fase confinada y las propiedades de flujo de las mezclas de coloides poliméricos. Primero preparamos colloid mezclas de polímeros que son la densidad y el índice de refracción igualados. A continuación, se presenta un protocolo estándar para obtener imágenes densas mezclas de coloides poliméricos reposo bajo diversas confinamiento en celdas en forma de cuña delgada. Por último, demostrar un protocolo para obtener imágenes de las mezclas de coloides poliméricos durante el flujo de microcanales.

Para demostrar la imagen confocal y de partículas de seguimiento, se investigó el efecto de confinamiento en el comportamiento de las fases de las mezclas de coloides poliméricos 63-65. Para estos experimentos el diámetro coloide era 2 a = 0,865 m. La fracción de volumen de coloide se fijó en Φ = 0,15 y la concentración de polímero C p se varió desde 0 hasta 23,6 mg / ml. Confocal de imágenes representativas se muestran en la Figura 2 63, columna de la ...

La microscopía confocal se utiliza para obtener imágenes de las mezclas de coloides poliméricos en reposo y que fluyen, los cuales son estudiados como sistemas modelo para suspensiones atractivos. Algoritmos de análisis de imagen se utilizan para calcular las métricas estructurales y dinámicas para las partículas coloidales que miden cambios debido al confinamiento geométrico.

Imagen confocal de Confinados en reposo y que fluye mezclas de coloide y polímeros

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

El objetivo general del siguiente experimento es cuantificar los cambios en el comportamiento de fases confinadas y las propiedades de transporte de suspensiones coloidales atractivas utilizando microscopía confocal. Esto se logra formulando mezclas de coloides y polímeros para modelar suspensiones coloidales atractivas. Las mezclas se observan y confinan en celdas delgadas en forma de cuña para mostrar cómo el confinamiento modifica la estructura, la dinámica y el comportamiento de fases de estas mezclas.A continuación, se obtienen imágenes de las mezclas mientras fluyen a través de microcanales para determinar el efecto de la intensidad de la atracción entre los coloides sobre las propiedades de transporte confinado de las mezclas. Los algoritmos automatizados de análisis de imágenes y seguimiento de partículas pueden mostrar cómo el confinamiento en reposo conduce a la solidificación y a la correlación de imágenes. Los algoritmos pueden mostrar cómo el aumento de la intensidad de la atracción conduce a un comportamiento de flujo cada vez más no newtoniano.La principal ventaja de esta técnica u otros métodos como el microscopio electrónico y la dispersión dinámica de luz es que permite observar directamente las trayectorias individuales de partículas, a partir de las cuales se pueden calcular métricas estructurales y dinámicas para su comparación directa con simulaciones. Este método estándar puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la física de la materia condensada blanda, como la forma en que los sistemas coloidales se autoensamblan en presencia de interacciones entre partículas, o cómo los materiales sólidos compuestos por suspensiones ligeras fluyen bajo una fuerza o tensión aplicada. Para este protocolo, se han preparado partículas de PMMA marcadas con un colorante, consulte el material de referencia vinculado en el protocolo textual para preparaciones estándar.Prepare una mezcla de tres a uno en peso de broy heane en deco hidro nataline lean; a continuación, agregue tetra butil amonio y sal orgánica hasta 1,5 milimolar. El disolvente iguala el índice de refracción de las partículas y apantalla parcialmente su carga para determinar con precisión la densidad de las partículas, suspendiéndolas al 0,1 % en volumen en el disolvente preparado. Centrifugue la suspensión a 800 ×g durante 75 minutos.Verifique que las partículas no sedimenten después de la centrifugación. Luego, para evitar que las partículas se sedimenten, agregue gota a gota el disolvente básico para igualar la densidad del disolvente a la de las partículas. A continuación, prepare una suspensión al 40 % de las partículas de PMMA en la mezcla de disolvente preparada.Prepare también poli-cireno lineal en la mezcla de disolvente a alta concentración. Por ejemplo, 50 miligramos por mililitro calculados a partir del peso molecular y el radio de giro del poliestireno. El uso de la suspensión concentrada de partículas de PMMA y la disolución de poliestireno permite obtener suspensiones con la concentración deseada de partículas con polímeros.Aquí, la suspensión contiene un 15 por ciento en volumen de partículas de PMMA y la concentración del polímero varía de cero a 25 miligramos por mililitro mediante dispersiones en volúmenes iguales de dos partículas de PMMA de tamaños y etiquetas diferentes. También se pueden mezclar fracciones con la solución de polímero. Después de mezclar cada suspensión, centrifúgelas y luego añada un disolvente gota a gota para igualar estrechamente la densidad del disolvente con la de las partículas.Por último, equilibre todas las muestras colocando las muestras selladas en un frasco durante al menos 24 horas antes de obtener imágenes de ellas. Comience por armar cámaras rectangulares a partir de cubreobjetos de vidrio. El grosor del portaobjetos microscópico aquí es de un milímetro, y por lo tanto, el grosor de la cámara, que permite el comportamiento en masa de las mezclas poliméricas con collar.Si se desea una cámara de altura múltiple, elabore cámaras delgadas con forma de cuña utilizando un cubreobjetos único espaciado sobre una cuña. El ángulo de apertura de la cámara es menor a 0,5 grados y el espesor de la cámara aumenta desde seis micrones hasta un milímetro. Esta configuración permite variar continuamente el espesor de confinamiento; fabrique las cámaras para colocarlas sobre un microscopio invertido y séllelas con un epóxico curable por UV que sea resistente a la mezcla de solventes del microscopio utilizado.Aquí se muestra una cabeza de escaneo confocal de barrido lineal conectada a un microscopio invertido con un objetivo de inmersión en aceite de 100x. Con una apertura numérica de 1,4, utilice longitudes de onda adecuadas para excitar los colorantes y obtenga imágenes cuadradas de 50 micrones a 512 píxeles cuadrados. Comience con una exposición de un treintaidosavo de segundo y luego ajuste según la calidad de la imagen.A continuación, localice la parte inferior de la cámara donde se adhirirán las partículas. Luego mueva el enfoque al punto medio de la cámara. Ahora tome aproximadamente 500 imágenes a una velocidad de un cuadro por segundo en el plano medio para el análisis 2D.Luego, para el análisis 3D, adquiera imágenes en Z con intervalos de 0,2 micrones a lo largo de 30 micrones en cualquier experimento de imagen colateral. Es fundamental optimizar las condiciones de adquisición para obtener imágenes de alto contraste. Analice las imágenes utilizando un paquete de software de seguimiento de partículas.Debe estar disponible un algoritmo que resuelva las partículas hasta 40 o 50 nanómetros. El seguimiento de partículas solo es posible si las partículas se desplazan menos que la distancia interparticular entre cuadros consecutivos. Para evaluar la estructura y la dinámica de las partículas, utilice las siguientes métricas.Una función de correlación pareja 3D, un desplazamiento cuadrático medio 2D o 3D y una parte auto de la función de correlación de Van Hove en 2D o 3D. Para este experimento, prepare una celda de flujo sencilla a partir de un capilar de vidrio cuadrado de 100 micrones de ancho. Conecte un tubo de teflón y utilice láminas de cubreobjetos de vidrio para el soporte estructural.A continuación, cargue la mezcla coloidal de polímero de interés en una jeringa de vidrio y conéctela a un sistema de dispensación, como una bomba. Ahora monte el conjunto en el microscopio invertido utilizado en la sección anterior. La celda de flujo de la jeringa y la salida deben mantenerse lo más niveladas posible.Ajuste el caudal según la mezcla de polímero coloidal. Durante el flujo, se ha utilizado una concentración a través de capilares cuadrados de 200 a 2000 micrones por segundo. Recopile imágenes 2D como se describió en la sección anterior a diferentes distancias desde el fondo del canal, de cinco a 50 micrones.Si las partículas aparecen elípticas, aumente la frecuencia de cuadros de adquisición. Utilice software de seguimiento y IDL o MATLAB para analizar el flujo. Para obtener una resolución subpíxel en el seguimiento de partículas, es necesario ajustar cuidadosamente los parámetros de seguimiento con el fin de obtener OIDs que no presenten sesgo en una dirección particular.Durante el flujo lento. Cuando las partículas se mueven menos que la distancia interpartícula entre cuadros, se pueden obtener trayectorias utilizando rutinas de seguimiento en flujos más rápidos. Utilice la correlación de imágenes para calcular la velocidad.Divida cada imagen en imágenes horizontales en la dirección del flujo. En imágenes secuenciales, desplace la segunda imagen para que coincida con la primera y utilice la distancia de desplazamiento para calcular la velocidad entre pares de imágenes o cada subdivisión de las imágenes originales. Elabore un histograma de todos los valores de desplazamiento calculados.Si los valores no presentan un pico pronunciado, repita el experimento a una velocidad de cuadro más rápida. Se suspendieron partículas de PMMA con un diámetro de 0,865 micrómetros al 15% en volumen en una mezcla de solventes que contenía 23,6 miligramos de polímero por mililitro. Métricas estructurales y dinámicas se utilizaron para evaluar las imágenes, incluyendo la correlación por pares y el desplazamiento cuadrático medio.El cambio de suspensión puede alterar la estructura y la dinámica de las suspensiones confinadas. Por ejemplo, se formuló una suspensión dispersa de partículas de 1,48 micrones y 0,73 micrones en la que las partículas ocuparon el 15% del volumen al disminuir el grosor del confinamiento. Se indujo una fase de gel coloidal de tipo sólido que contenía ambos tipos de partículas, y el desplazamiento cuadrático medio de las partículas grandes disminuyó a medida que el sistema se confinó más.De acuerdo con el flujo de solidificación, se compararon las propiedades de partículas semana y fuertemente atractivas. La concentración de polímero varió de cinco a 25 miligramos por mililitro. En las suspensiones, la suspensión semana mostró un perfil de densidad que variaba fuertemente con la posición a través del canal.Durante un flujo de 10 microlitros por hora, el perfil de densidad de la suspensión fuertemente atractiva fue casi constante a través del canal bajo las mismas condiciones. De manera similar, hubo diferencias en los perfiles de velocidad de estas suspensiones. Las partículas débilmente atractivas estuvieron cercanas a la predicción newtoniana para su velocidad, mientras que las partículas fuertemente atractivas se desviaron ligeramente de la predicción newtoniana para su velocidad, especialmente más cerca de la pared lateral del canal donde Y es cero.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la microscopía confocal para investigar el comportamiento de fases y las propiedades de flujo de suspensiones coloidales siguiendo este procedimiento. Otras métricas, como los tamaños de los agregados y las dimensiones fractales, pueden calcularse a partir de las posiciones de las partículas para responder preguntas adicionales, como cómo la confinación modifica la forma de los agregados formados.

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Investigación

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Química

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Este protocolo describe la síntesis y formulación de biomateriales inyectables de hidrogel de polímeros y nanopartículas supramoleculares (PNP). Se demuestran las aplicaciones de estos materiales para la administración de fármacos, la estabilización biofarmacéutica y la encapsulación y administración celular.

Hidrogeles de polímeros y nanopartículas supramoleculares inyectables para aplicaciones de administración de células y fármacos

La técnica propuesta proporcionará un enfoque novedoso, eficiente, frugal y no invasivo para obtener imágenes del flujo fluídico a través de un lecho de polvo empaquetado, produciendo una alta resolución espacial y temporal.

Técnica de imagen frugal del flujo capilar a través de polvos de impresión polimérica tridimensionales

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Difusión y ensamblaje de una sola molécula en membranas lipídicas llenas de polímeros

Este protocolo detalla el diseño y la fabricación de un dispositivo microfluídico adecuado para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos. La síntesis de técnicas de microfabricación, control de flujo automatizado y modelado computacional permite un sistema flexible ideal para sondear el citoesqueleto celular in vitro.

Desarrollo de un enfoque basado en la microfluídica para investigar la mecánica de los polímeros de microtúbulos

Aprende a cuantificar el comportamiento de fase y las propiedades de transporte de suspensiones coloidales atractivas confinadas mediante microscopía confocal. Este método utiliza mezclas de coloides y polímeros en celdas de cuña delgadas.

Imagen confocal de Confinados en reposo y que fluye mezclas de coloide y polímeros

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